Summary
この記事では、我々は長期的な有効にするシンプルな方法論を提示
Abstract
正常と不正な形式の胚発生を促進遺伝子と微環境要因間の関係を理解することは新たな治療戦略を発見するための基本です。イメージング技術の進歩は、身体の計画の組織と成熟の定量的な調査を有効にしているが、後の段階の胚の形態形成にはあまり明確ではない。ニワトリ胚のための文化と手術操作の容易さのこのアプリケーションのための魅力的な脊椎動物の動物モデル系です。初期胚は、細胞のパターニングと運命学の1,2のための完全な光アクセスを可能にするろ紙のリング、上に短い時間のために培養することができる。このような心臓の形態形成などの勉強を高度な発達過程は伝統的に卵殻3-5の窓を通して行われますが、この手法は、ウィンドウのサイズに起因する光アクセスを制限している。我々は以前までの超音波検査6,7を経由して高分解能のイメージングを有効にして10日間、にのために六角形の重船の文化胚EX - OVO全体を簡単に計測する手法を開発した。これらの文化は、ライブの実験で使用可能なイメージングツールの種類を制限する、輸送することが困難でした。ここでは、費用対効果の高い、ポータブル環境室との改善されたシェルレス培養系を提示する。卵は、部分的に滅菌水で満たされたプラスチック製のコップに円周方向に貼付ポリウレタン膜（ラップしがみつく）によって作成されたハンモックに割れていた。ハンモックと水の下の力学が輸送によって誘発される振動を減衰させる助けながら、ハンモックの円周と深さの寸法は、両方の表面張力を維持するために重要でした。水浴を循環させ、小さなフットプリントは、実験中に連続的な温度制御を可能にするために開発されました。我々は、形態形成の欠陥または遅滞なく、少なくとも14日間この方法における培養胚に能力を発揮し、いくつかの顕微およびイメージングアプリケーションでこのシステムを採用しています。
Protocol
1 EX -オボ文化プロトコル。：
- 受精鶏卵をインキュベート
- 受精鶏卵は13℃で保存できますCを最大5日間インキュベーション前に開発を開始せずに。赤のワインクーラーは、この温度を維持することができます。
- 72時間の37.5での連続的なロッキングの間に60％恒湿インキュベーター° Cでインキュベーション卵鈍い面を上に。
- ハンモックを準備する（図1a）
- 塗りつぶし¾ 9オンスのプラスチックのコップの暖かい滅菌水で。定期的な9オンスカップは、8cmの上部直径を有している。我々は、このサイズがここで紹介する長い時間培養アプリケーションに最適であることがわかった。
- 約20cmのラップをしがみつくカット。円周のまわりのラバーバンドを配置することによって、カップの上に貼付。プラスチックは、水の上に分散させる必要があります。バンド周りの余分なプラスチックをカット。我々は、輸送中に卵黄の分割の結果、それは卵黄の付着を防止するため、このアプリケーションのための最も適切なものにラップをしがみつく発見。
- 70％エタノールで湿らせたキムワイプ（キンバリークラーク社）とプラスチックを拭きます。
- 72時間のインキュベーション後にインキュベーターから卵を取り除く。
- 70％エタノール接液キムワイプで表面を拭いて卵を滅菌する。
- 胚の適切な配置（図1b）のための1-2分のために水平に卵を産む。卵のカートンを水平に卵を産むために使用することができます。胚は、1〜2分後に上に回転します。
- 層流フード内で無菌的にハンモックの上に胚を移す。
- 卵（図1c）の下側に小さなへこみがあるまでシャープなエッジ（金属製のバケツやガラスのビーカーの端など）を使用して、静かに卵をタップします。覚えておいて、胚は、上側に配置されている。
- くぼみの反対側に親指を置くと（図1d）離れて水平にシェルを引き出します。
- 胚と同様にアルブミンハンモック（図1E）上に卵黄を置きます。アルブミンは、それが長い文化の実践のための胚に栄養を提供するだけでなく、システムを移動することによって誘発される衝撃を吸収するために卵黄の周りに湿し水環境を提供します。ハンモックの下の水は、水の循環のヒーターが使用されている場合、胚は、撮像時の輸送中に地面に平行に保ち、熱の伝導体として機能することを確実にします。
- 転送が正しく実行されている場合、胚はすでに一番上に配置する必要があります。されていない場合は、アンシャープ、滅菌オブジェクト（閉じた曲線ハサミのすなわち鈍先端）と方向的に愛撫胚が上に回転するように卵黄を使用してください。
- 胚を密封するためにカップの上に直径10cmのシャーレを置きます。
- 37.5でのインキュベーターセットに配置カップの文化℃の携帯用インキュベーターを使用する場合は、蒸留水で満たされた1月2日9オンスのカップを置くと、〜で湿度を保つ60％（図1F）。
- 胎生7日目を超えて培養胚の場合、粉砕卵殻片を骨の発達と成熟のためのカルシウム源として胚の周縁部に点在してください。
外インキュベーターイメージング/操作のためのアクセサリー機器：
循環水浴をインキュベーション温度を維持するために、家の中に建てられましたながらイメージングまたは操作（図3）。カップに合うことができる水浴は水の貯水池への適切なサイズのチューブを介して接続されている。抵抗ヒータは、水の温度に従って、手動で調節されている貯水槽の水を加熱する。ウォーターポンプは、水を循環させる。 Pictoral表現はultrasongraphy / florescent顕微鏡（図3）を介して画像処理しやすさを表しています。
図1。ハンモックとハンモックにニワトリ胚の転送の準備。
図2。代表的な結果- 。EX OVO培養技術を介して成長し、異なる段階のニワトリ胚胚HH 17以降からは、この手法を使って成長させることができる。
図3。理想的な開発の温度で胚を保つために元卵培養系と組み合わせて使用する水循環システムの概略図と代表的な写真。
2。選択したアプリケーション：
I.マイクロインジェクション
この胚培養では、ソリューションがコントラストに基づくイメージング（すなわち、蛍光顕微鏡、マイクロ計算地形など）（図4）のために血管系に注入する必要があるマイクロインジェクションのアプリケーションに適しています。以下のマイクロインジェクションのプロトコルは、次のとおりです。
- 注射apparaを準備TUS
- ファッションは、マイクロフォージを使用して、斜め先端のマイクロニードルに0.75 IDのガラスキャピラリーチューブを引っ張った。必要なチップのサイズは、所望の標的静脈径/流量に依存します。
- 0.03インチIDのシリコンチューブにシリンジを接続してください。
- 注入する溶液でチューブをロードし、チューブにマイクロニードルを接続してください。
- シリンジホルダーまたはシリンジポンプにマイクロマニピュレータと注射器の上にマイクロニードルを置きます。
- カップに滅菌水を追加し、それによって胚を上げる。我々は、血管（すなわち、卵黄血管）に針の適切な浸透のために、水平方向の浸透が必要であることを経験した。これは、胚はカップの縁と同じ平面上にある必要があります。
- 胚の下にプラスチックを保持しているゴムバンドを取り出してください。
- 優しくプラスチックの片側を持ち上げて、カップにいくつか滅菌水を加える。
- 再びプラスチックの上にゴムバンドを固定します。
- 胚の血管への解決策を注入。我々の経験では、ソリューションが卵黄の容器に注入されると、マイクロニードルは出血を引き起こすことなく効率的な血流を維持するために、血管の直径の約1 / 10サイズにする必要がありました。
- 気泡のない形成を確実にしないマイクロニードルへの解決策をポンプ。
- 選択された容器の上にマイクロニードルの先端を合わせます。卵黄血管の場合は、フォークのエリアを選択すると、容器を貫通する最大面積を与える。
- 船に向かって針を押してください。船は最初にリトラクトします。針が貫通したら、灌流を開始します。流れる血の色は血流に変更する必要があります。色の変化が見られない場合、針が血管外に浸透している場合があります。容器の色の変化が見られるまで同時にソリューションをポンピングしながらその場合には、徐々にニードルを引っ込める。灌流が完了すると、容器の外マイクロニードルを引っ込める。
図4：EX - OVO培養ニワトリ胚の血管系への蛍光色素のマイクロインジェクション。
II。顕微手順 - 左心房ライゲーション
このEX - OVO文化のセットアップでは、胚への完全なアクセシビリティを提供するため、ニワトリ胚への外科的なアプリケーションの実行に最適です。以下の例のテクニック、左心房ライゲーション（LAL）（図5）ためのプロトコルです。手順は、約24時間培養期間（HH24）に行われます。
- ノットをオーバーハンドの準備〜10から0ナイロン縫合糸を使用して、0.5 mmの直径を。
- 細かい鉗子で、局所的に胚を介して絨毛膜と尿膜膜を除去し、胚の左側に表示されていることそれが垂直方向にそのような回転に戻ってから胚を持ち上げます。
- 細かい鉗子を使用して、左心房を介して心膜を取り除く。
- 左心房を介して結び目の位置を合わせ、それを締めます。左側に元の血流の約75％を禁止するように結び目は、その接続する必要があります。 microscissorsと結び目の端をカットし、慎重に余分な縫合糸を除去し捨てる。
- 元の位置（上右側）に戻す胚を回転させる。
- 偽のコントロールは、同じ手順が含まれますが、縫合糸は、ただ通過し、関連付けられていないされます。効果的なLAL治療（75％収縮）が24時間後に手術にてさせていただきます、と失格胚は除外されます。
図5：コントロールと左心房の連結されたニワトリ胚矢印は、連結された胚の約75％小型である左心房を示しています。
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Discussion
光アクセスと鳥類の胚の実験は、卵の殻の制約のため困難である。のウィンドウが大幅に注入し、顕微鏡を使った手術のアプローチ8のアクセス可能な微小血管の数を制限します。結果としてのみ初期胚を操作して連続観測が不可能であることができる。長期的な文化9を防止胚での表面張力の不十分な制御のためのペトリ皿を使用して初期のEX - OVOの文化は、使用が制限さでした。我々は最近、許容表面tenstion 7を維持する六角形の重さのボートを使用してこのテクニックを改善し、これらの文化は、輸送に困難でした。ここで紹介するテクニックは、この問題を解決し、大幅にマイクロインジェクションし、外科的処置を含む、用いることのできる実験手法とイメージング技術の種類を拡大する。研究は後で形態形成イベントを理解することに焦点を当てとして、この技術は現在、実験的に継続的に勉強することは不可能な開発のイベントの監視と変調が可能になります。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertile white Leghorn chicken eggs | |||
| Model GB1, Avery Incubators, Hugo CO | |||
| Saran Wrap | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | ||
| Rubber bands | |||
| Warm sterile water | |||
| 9 oz plastic cup | |||
| 100 mm diameter Petri dish | |||
| 1602N thermal air | GQF Manufacturing | ||
| Fluorescein-conjugated dextran (2 MDa, 1% w/v in phosphate buffered saline) | Sigma-Aldrich | ||
| Microforge | Glassworx, Inc, St Louis MO | ||
| Glass capillary tubes (0.75 mm ID) | |||
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | Model M3301L | |
| Fluorescent microscopy | Carl Zeiss, Inc. | Z20 | |
| Fine 55-forceps | World Precision Instruments, Inc. | ||
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon Inc. | ||
| Tubing | VWR international | 1mm OD | |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | ||
| 200 μL pipetter and pipette tips | VWR international |
References
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