Summary
במאמר זה, אנו מציגים מתודולוגיה פשוטה כדי לאפשר לטווח ארוך
Abstract
הבנת יחסי הגומלין בין גורמים גנטיים microenvironmental כי ההתפתחות העוברית כונן רגיל פגום מהותית על גילוי אסטרטגיות טיפוליות חדשות. התקדמויות טכנולוגיית הדמיה אפשרו חקירה כמותית של הארגון והתבגרות של התוכנית הגוף, אבל המורפוגנזה עובריים בשלב מאוחר יותר הוא פחות ברור. עוברי עוף הם בעלי חיים בעלי חוליות אטרקטיבי מודל המערכת עבור יישום זה בגלל קלות של תרבות מניפולציה כירורגית. עוברי מוקדם יכול להיות מתורבת לזמן קצר על טבעות נייר סינון, המאפשר גישה אופטיים המלא ל דפוסים התא מחקרים 1,2 הגורל. לימוד תהליכים התפתחותיים מתקדמות כגון המורפוגנזה לב מבוצעים באופן מסורתי דרך חלון של קליפת 3-5, אבל הטכניקה הזו מגבילה גישה אופטית בשל גודל חלון. אנחנו קודם לכן פיתחו שיטה פשוטה לתרבות עוברים כל לשעבר אובו על סירות לשקול משושה עד 10 ימים, מה שאיפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה באמצעות אולטרסאונד 6,7. תרבויות אלו היו קשים בתחבורה, להגביל את סוגי כלי הדמיה עבור ניסויים לחיות. כאן אנו מציגים שיפור מערכת קרב פחות תרבות עם תא, חסכונית סביבתי נייד. ביצים סדוקות על ערסל נוצר על ידי קרום פוליאוריטן (נצמד) מודבקת circumferentially על כוס פלסטיק מלאה חלקית עם מים סטריליים. מידות ההיקף והעומק של הערסל שניהם קריטי לשמור על מתח הפנים, בעוד המכניקה של הערסל מים מתחת עזר לשכך ויברציות המושרה על ידי התחבורה. טביעת רגל קטנה במחזור אמבט מים פותחה גם כדי לאפשר בקרת טמפרטורה רציף במהלך הניסויים. אנו מדגימים את היכולת עוברי התרבות בדרך זו לפחות במשך 14 ימים ללא פגם morphogenic או עיכוב להעסיק זו מערכת microsurgical מספר יישומי הדמיה.
Protocol
1. Ex-אובו תרבות לפרוטוקול:
- לדגור ביצים עוף מופרית
- ביצי תרנגולת מופרות ניתן לאחסן 13 ° C עד 5 ימים לפני הדגירה ללא ייזום ופיתוח. מקרר יין אדום יכול לשמור על טמפרטורה זו.
- ביצי דגירה בצד הקהה את בלחות של 60% החממה מתמיד עם נדנדה רציפה 37.5 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות.
- הכן ערסלים (איור 1 א)
- מלאו ¾ של 9 כוסות גרם פלסטיק עם מים סטריליים חם. רגיל 9 גרם כוס יש קוטר החלק העליון של 8 ס"מ. מצאנו כי גודל זה היה הכי מתאים ליישום תרבות זמן רב המוצג כאן.
- גזור על 20 ס"מ נצמד. Circumferentially להדביק על גבי כוס על ידי הנחת גומייה סביב. פלסטיק צריך להתפשט על גבי המים. חותכים את עודפי פלסטיק סביב הלהקה. מצאנו נצמד להיות המתאים ביותר עבור יישום זה מכיוון שהוא מונע הידבקות של חלמון, וכתוצאה מכך פיצול חלמון במהלך ההובלה.
- נגבו את הפלסטיק עם kimwipes (קימברלי קלארק, Inc) הרטובות עם אתנול 70%.
- הסר ביצים באינקובטור לאחר 72 שעות של דגירה.
- לעקר ביצים ידי ניגוב פני השטח עם kimwipes אתנול 70% הרטובות.
- הנח את הביצים אופקית עבור 1-2 דקות על מיקום תקין של העובר (איור 1b). קרטון ביצים יכול לשמש המטילה ביצי אופקית. עוברים יסתובב העליון אחרי 1-2 דקות.
- העברת העוברים על ערסלים בסביבה נקייה מחיידקים במנדף זרימה למינרית.
- בעזרת קצה חד (כמו קצה דלי מתכת או כוס זכוכית), הקש את הביצה בעדינות עד שלא שקע קטן על החלק התחתון של הביצה (איור 1 ג'). זכרו, העובר ממוקם על upperside.
- שים את אגודליו משני צדי השקע ולשלוף את הקליפות בנפרד אופקית (איור 1d).
- מניחים את החלמון עם העובר וכן אלבומין על גבי ערסל (דמות 1e). אלבומין תספק סביבה לחה סביב החלמון לספוג זעזועים הנגרמת על ידי העברת מערכת וכן הוא מספק תזונה לעובר על נוהלי תרבות ארוכה. מים מתחת הערסל יבטיח העובר יישאר במקביל לקרקע במהלך התחבורה לשמש מוליך חום במהלך הדמיה אם תנור זרימת מים משמש.
- העובר צריך להיות כבר ממוקמת על אם ההעברה נעשית כראוי. אם לא, להשתמש unsharp, חפץ סטרילי (טיפ בלאנט כלומר, מספריים מעוקל סגורה) ו ללטף directionally החלמון כזה העובר מסתובב למעלה.
- מניחים בקוטר 10 ס"מ צלחת פטרי על גבי הכוס לאטום את העובר.
- מניחים כוס תרבות לתוך להגדיר את החממה על 37.5 ° C. אם חממה נייד משמש, הצבת ספטמבר 1-2 כוסות גרם מלא מים מזוקקים שומר על לחות ב ~ 60% (איור 1f).
- אם עוברים culturing מעבר ליום עובריים 7, חתיכות קליפת כתוש צריך להיות מפוזרים ברחבי הפריפריה של העובר כמקור לסידן להתפתחות עצם התבגרות.
אביזרים וציוד חממה מחוץ הדמיה / מניפולציה:
אמבט מים במחזור נבנה בבית כדי לשמור על טמפרטורת הדגירה בעוד הדמיה או מניפולציה (איור 3). אמבט מים שיכולים להתאים את הגביע מחובר דרך צינורות בגודל המתאים למאגר מים. דוד התנגדות מחממת את המים במאגר אשר מוסדר באופן ידני על ידי ביצוע טמפרטורת המים. משאבת המים מזרימה את המים. ייצוג Pictoral מתאר להקל הדמיה באמצעות ultrasongraphy / מיקרוסקופיה florescent (איור 3).
באיור 1. הכנת ערסל והעברת עוברים עוף ערסלים.
איור 2. תוצאות נציג -. שונה עוף בשלב עוברי גדל באמצעות טכניקה לשעבר תרבות אובו עוברים מבית HH 17 ואילך ניתן לגדל באמצעות טכניקה זו.
איור 3. תמונות סכמטי ונציג של מערכת מחזור מים הפועל בשיתוף עם מערכת לשעבר אובו התרבות לשמור עוברים בטמפרטורת פיתוח אידיאלי.
2. יישומים נבחרים:
I. Microinjection
זו תרבות העובר מתאים ליישומים microinjection איפה הפתרונות צריכים להיות מוזרק אל vasculature הדמיה בניגוד מבוסס (כלומר, מיקרוסקופ פלואורסצנטי, מיקרו שחושב טופוגרפיה וכו ') (איור 4). להלן פרוטוקול microinjection:
- הכן את appara הזרקהTus
- אופנה משך 0.75 כוס מזהה צינורות לתוך נימי microneedles קצה משופעים באמצעות microforge. גודל קצה הנדרשת תלויה בשיעור וריד קוטר / זרימה היעד הרצוי.
- חברו את המזרק 0.03 צינורות מזהה אינץ סיליקון.
- טען את צינורות עם הפתרון להיות מוזרק ולחבר את microneedle אל הצינור.
- מניחים את microneedle על micromanipulator לבין מזרק לבעל מזרק או משאבת מזרק.
- מוסיפים מים סטריליים בגביע ובכך להעלות את העובר. חווינו כי חדירה נכונה של המחט לתוך כלי דם (כלומר, כלי vitelline), חדירה אופקית הכרחי. זה דורש העובר להיות על המטוס זהה את שולי הכוס.
- הוציאו את הגומייה מחזיק את הפלסטיק מתחת העובר.
- הרם צד אחד של הפלסטיק בעדינות להוסיף קצת מים סטריליים כדי הגביע.
- Secure את הגומייה על הפלסטיק שוב.
- הזרק הפתרון כלי עובריים. מניסיוננו, כאשר פתרון מוזרק לכלי vitelline, microneedles צריכה להיות ה כ 1 / 10 בגודל של קוטר כלי לשמור זלוף ויעיל מבלי לגרום לדימום.
- משאבה הפתרון microneedle הבטחת אין היווצרות של בועות אוויר.
- יישר את קצה microneedle על כלי שנבחר. עבור כלי vitelline, בחירת אזור מזלג ייתן שטח מרבי לחדור אל הספינה.
- דחוף את המחט לכיוון הספינה. הכלי יהיה הראשון לחזור. לאחר המחט חודרת, להתחיל זלוף. צבעו של הדם הזורם צריך לשנות עם זלוף. אם משנים את צבעם אינו נראה, המחט עשוי חדרו מתוך הספינה. במקרה כזה, לאט לאט לחזור microneedle ובמקביל שאיבה פתרון עד לשנות צבע כלי נתפסת. לאחר זלוף תושלם, לסגת microneedle מתוך הספינה.
איור 4: Microinjection של פלורסנט לצבוע לתוך כלי הדם של העובר לשעבר אובו חומוס מתורבת.
השנייה. נוהל Microsurgical - קשירת פרוזדורים שמאלי
זו ההגדרה לשעבר אובו תרבות אידיאלית עבור יישומי ביצוע הניתוח על עוברי אפרוח שכן הוא מספק נגישות מלאה העובר. להלן פרוטוקול טכניקה דוגמה, עזב קשירת פרוזדורים (LAL) (איור 5). ההליך מבוצע כ 24 שעות לתוך התקופה תרבות (HH24):
- הכן את הבוהן קשרים ~ 0.5 מ"מ בקוטר 10-0 באמצעות תפר ניילון כירורגית.
- בעזרת מלקחיים בסדר, מקומי להסיר את קרום כוריוני ו allantoic על העובר והרם את העובר מהחלק האחורי כדי לסובב את זה במאונך כזה כי הצד השמאלי של העובר גלוי.
- בעזרת מלקחיים בסדר, להסיר את קרום הלב על אטריום שמאל.
- יישר את הקשר על אטריום שמאל ולהדק אותו. הקשר צריך להיות קשור כדי לאסור ~ 75% של זרימת הדם המקורית בצד שמאל. חותכים את הקצוות של הקשר עם microscissors ובזהירות להסיר ולסלק תפר עודף.
- סובב את העובר בחזרה לכיוון המקורי (צד ימין למעלה).
- שולטת שאם יהיה כרוך בפרוצדורה זהה אך תפר תהיה רק עבר ולא קשור. טיפול אפקטיבי LAL (75 מועקה%) יאושר ב 24 שעות שלאחר הניתוח, עוברים נפסל ייכללו.
איור 5:. מלאה עובר שמאל פרוזדורים חומוס ligated החץ מראה את הפרוזדורים שמאל, שזה בערך 75% קטן יותר בעובר ligated.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
גישה אופטית ניסויים בעוברים העופות הוא מאתגר בשל אילוצים של קליפת ביצה. Windowing משמעותי מגבילה את מספר microvessels נגיש גישות הזרקת microsurgical 8. כתוצאה מכך רק עוברי מוקדם ניתן להשפיע תצפית רציפה אינו אפשרי. מוקדם לשעבר אובו תרבויות באמצעות צלחות פטרי היו של שימוש מוגבל בשל שליטה מספקת מתח הפנים על העובר מנעו תרבות ארוך טווח 9. אנחנו לאחרונה שיפור הטכניקה הזו באמצעות סירה משושה לשקול המקיימת tenstion משטח מקובלת 7, אבל אלה היו תרבויות קשה להעביר. הטכניקה המוצגת כאן פותר בעיה זו מרחיבה באופן משמעותי את סוג שיטות ניסוייות וטכניקות הדמיה כי יכול להיות מועסק לרבות הליכי microinjection וכירורגי. כמו המחקר מתמקד בהבנת אירועים morphogenic מאוחר יותר, טכניקה זו תאפשר מעקב אפנון של אירועים הפיתוח כי כרגע אי אפשר ללמוד בניסוי ברציפות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertile white Leghorn chicken eggs | |||
| Model GB1, Avery Incubators, Hugo CO | |||
| Saran Wrap | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | ||
| Rubber bands | |||
| Warm sterile water | |||
| 9 oz plastic cup | |||
| 100 mm diameter Petri dish | |||
| 1602N thermal air | GQF Manufacturing | ||
| Fluorescein-conjugated dextran (2 MDa, 1% w/v in phosphate buffered saline) | Sigma-Aldrich | ||
| Microforge | Glassworx, Inc, St Louis MO | ||
| Glass capillary tubes (0.75 mm ID) | |||
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | Model M3301L | |
| Fluorescent microscopy | Carl Zeiss, Inc. | Z20 | |
| Fine 55-forceps | World Precision Instruments, Inc. | ||
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon Inc. | ||
| Tubing | VWR international | 1mm OD | |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | ||
| 200 μL pipetter and pipette tips | VWR international |
References
- Zamir, E. A., Czirok, A., Cui, C., Little, C. D., Rongish, B. J. Mesodermal cell displacements during avian gastrulation are due to both individual cell-autonomous and convective tissue movements. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19806-19811 (1980).
- Ehrman, L. A., Yutzey, K. E. Lack of regulation in the heart forming region of avian embryos. Dev Biol. 207, 163-175 (1999).
- Clark, E. B., Hu, N., Rosenquist, G. C. Effect of conotruncal constriction on aortic-mitral valve continuity in the stage 18, 21 and 24 chick embryo. Am J Cardiol. 53, 324-327 (1984).
- deAlmeida, A., McQuinn, T., Sedmera, D. Increased ventricular preload is compensated by myocyte proliferation in normal and hypoplastic fetal chick left ventricle. Circ Res. 100, 1363-1370 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Butcher, J. T., McQuinn, T. C., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. R. Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition. Circ Res. 100, 1503-1511 (2007).
- McQuinn, T. C. High-frequency ultrasonographic imaging of avian cardiovascular development. Dev. Dyn. 236, 3503-3513 (2007).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. , (2007).
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev Biol. 41, 391-394 (1974).
