Summary
Bu makalede, biz uzun vadeli sağlamak için basit bir yöntem mevcut
Abstract
Normal ve kusurlu embriyonik gelişim sürücü ve genetik microenvironmental faktörler arasındaki ilişkilerin anlaşılması ve yeni tedavi stratejileri keşfetmek için esastır. Görüntüleme teknolojisindeki gelişmeler, organizasyon ve vücut planı olgunlaşması kantitatif araştırma etkin, ancak daha sonraki bir aşamada embriyonik morfolojilerinden daha az açıktır. Tavuk embriyolar kültür ve cerrahi manipülasyon kolaylığı nedeniyle bu uygulama için cazip bir omurgalı hayvan model sistem. Erken embriyolar, hücre desenlendirme ve kader çalışmaları 1,2 tam optik erişim sağlayan filtre kağıdı yüzük, kısa bir süre için kültür olabilir . Kalp morfolojilerinden gibi incelenmesi ileri gelişim süreçleri, geleneksel yumurta kabuğu 3-5 bir pencere üzerinden, ama bu tekniği pencere boyutu nedeniyle optik erişimi sınırlar . Daha önce 10 gün, ultrasonografi 6,7 ile yüksek çözünürlüklü görüntüleme etkin altıgen tartmak teknelerde eski-ovo kültürünün bütün embriyolar için basit bir yöntem geliştirdi. Bu kültürler canlı deneyleri için mevcut görüntüleme araçları türleri sınırlayarak, ulaşım zor. Biz burada bir maliyet-etkili, taşınabilir çevre haznesi ile geliştirilmiş bir kabuk daha az kültür sistemi mevcut. Yumurta kısmen steril su ile dolu bir plastik bardak, dairesel yapıştırılmış bir poliüretan membran (wrap sarılmak) tarafından oluşturulan bir hamak üzerine kırık. Mekaniği altındaki hamak ve su taşıma araçları ile indüklenen titreşim yardımcı hamak çevresi ve derinlik boyutları, hem yüzey gerilimi korumak için kritik bir rol oynadı. Su banyosu dolaşan küçük bir ayak izi de deney sırasında sürekli sıcaklık kontrolü sağlamak için geliştirilmiştir. Biz morfojenik kusur olmadan en az 14 gün boyunca bu şekilde embriyoların kültürü için yeteneğini göstermek ya da bu sistemin birçok mikrocerrahi ve görüntüleme uygulamaları gecikme ve istihdam.
Protocol
1 Ex-ovo Kültür Protokolü:
- Döllenmiş tavuk yumurta inkübe
- Döllenmiş tavuk yumurtası 13 saklanabilir ° C inkübasyon 5 gün öncesine kadar geliştirme başlatılması. Bir kırmızı şarap soğutucusu, bu sıcaklıkta muhafaza edebilirsiniz.
- 37.5 sürekli sallanan bir% 60 sabit nem inkübatör ° C de 72 saat inkübe yumurta künt yüzü yukarı.
- Hamaklar hazırlayın (Şekil 1a)
- 9 oz plastik bardak ılık steril su ile doldurun ¾. Düzenli bir 9 oz fincan, 8 cm üst çapa sahip. Biz bu boyutu, burada sunulan uzun süre kültür uygulama için en uygun olduğu bulundu.
- Cut, 20 cm şal sarılmak. Etrafına bir lastik bant koyarak fincan dairesel yapıştırmayın. Plastik su üstüne yayılmış olmalıdır. Grubun etrafında aşırı plastik kesin. Biz taşınması sırasında sarısı bölme ile sonuçlanan, yumurta sarısı yapışmasını önler, bu uygulama için en uygun şal sarılmak bulundu.
- Plastik,% 70 etanol ile ıslatılmış Kimwipes (Kimberly-Clark, Inc.) Ile silin.
- Inkübatör inkübasyon 72 saat sonra yumurta çıkarın.
- % 70 etanol ıslak Kimwipes yüzey silerek yumurta sterilize edin.
- Yumurtalar embriyo uygun konumlandırma (Şekil 1b) için 1-2 dakika yatay yatırın. Bir yumurta karton yatay yumurtlayarak için kullanılabilir. Embriyolar 1-2 dakika sonra başına dönecektir.
- Laminer akış kaputu aseptik hamaklar üzerine embriyolar transfer.
- Yumurta (Şekil 1c) alt kısmında küçük bir göçük kalmayıncaya kadar keskin bir kenarı (metal bir kova veya bir cam beher kenarına gibi) kullanarak, yumurta hafifçe dokunun. Unutmayın, embriyo Üstyaka'da konumlandırılmış.
- Başparmak göçük karşıt taraflarında koyun ve kabukları çekme dışında yatay (Şekil 1d).
- Sarısı embriyo yanı albumin hamak (Şekil 1e) üzerine yerleştirin. Albumin, uzun kültür uygulamalar için embriyo beslenme sağlar yanı sıra hareketli sistem tarafından indüklenen şokları absorbe sarısı etrafında bir nemlendirme bir ortam sağlayacaktır. Su altında hamak, su sirkülasyonu ısıtıcı kullanıldığı takdirde görüntüleme sırasında embriyo taşıma sırasında yere paralel kalır ve ısı iletkeni olarak hizmet sağlayacaktır.
- Embriyo transferi doğru yapılır zaten üstüne yerleştirilmiş olmalıdır. Aksi takdirde, bir keskinlik giderme, steril bir nesne (yani kapalı kavisli makas künt uçlu) ve yönünün okşamak embriyo başına döner böyle sarısı kullanın.
- Embriyo mühür fincan üstünde 10 cm çapında Petri kabı yerleştirin.
- 37.5 inkübatör seti içine fincan kültürü Yer ° C Taşınabilir bir inkübatör kullanılması durumunda, distile su ile dolu 1-2 9 oz bardak yerleştirerek ~ az nem tutar% 60 (Şekil 1f).
- Embriyonik gün 7 ötesinde kültür embriyolar, ezilmiş kabuğu parçaları, kemik gelişimi ve olgunlaşması için bir kalsiyum kaynağı olarak embriyo çevre etrafında dağınık olması gerekir.
Dış inkübatör görüntüleme / manipülasyon için donatım:
Dolaşan su banyosunda inkübasyon sıcaklıkları sürdürmek için ev inşa edildi, görüntüleme veya manipülasyon (Şekil 3). Fincan uygun bir su banyosu için uygun büyüklükte bir su deposu boru ile bağlanır. Bir direnç ısıtıcı, su sıcaklığı takip ederek elle düzenlenir, rezervuar su ısıtır. Bir su pompası, su dolaşır. Grafiksel gösterimi ultrasongraphy / florescent mikroskobu (Şekil 3) ile görüntüleme kolaylığı gösteriyor.
Şekil 1. Hamak ve hamaklar için tavuk embriyo transferi hazırlanması.
Şekil 2. Temsilcisi sonuçları - ex ovo kültür tekniği ile yetiştirilen farklı evre tavuk embriyolar HH 17 itibaren Embriyolar bu tekniği ile yetiştirilebilir.
Şekil 3. Ex-ovo kültür sistemi ile birlikte ideal gelişme sıcaklığında embriyoların tutmak için kullanılan su dolaşım sistemi şematik ve temsili resim.
2. Seçilmiş Uygulamalar:
I. Mikroenjeksiyon
Bu, embriyo kültürü, mikroenjeksiyon uygulamaları için çözümler kontrast temelli görüntüleme dahil (yani florasan mikroskobu, mikro-bilgisayarlı topografya vb) (Şekil 4) damarsal enjekte gerekir uygundur. Aşağıda mikroenjeksiyon protokolü:
- Enjeksiyon hazırlayın apparaanlamda
- Moda, bir microforge kullanarak Eğimli ucu microneedles 0.75 ID kılcal cam tüpler çekti. Size gerekli ucu istenen hedef ven çapı / akış hızı bağlıdır.
- 0.03 inçlik ID silikon tüp şırınga bağlayın.
- Enjekte edilebilir çözüm tüp Yük ve boru microneedle bağlamak.
- Microneedle, şırınga sahibinin veya şırınga pompası mikromanipülatör ve şırınga üzerine yerleştirin.
- Fincan böylece embriyo yükseltmek steril su ekleyin. Biz (yani vitelline gemi) bir kan damarı içine iğne uygun penetrasyon için gerekli olduğunu, yatay penetrasyon yaşadı. Bu embriyo fincan kenarları aynı düzlemde gerektirir.
- Plastik embriyonun altında tutan lastik bant çıkartın.
- Plastik bir tarafı hafifçe kaldırın ve fincan için bazı steril su ekleyin.
- Yeniden plastik lastik bant üzerine sabitleyin.
- Embriyonik bir gemi çözüm enjekte edilir. Bizim tecrübelerimize göre, çözüm bir vitelline gemi enjekte edildiğinde, kanamaya neden olmadan verimli perfüzyon korumak için damar çapı yaklaşık 1 / 10 ölçekli inci gereken microneedles.
- Microneedle hiçbir hava kabarcıklarının oluşumu sağlamak için bir çözüm Pompa.
- Seçilen gemiye microneedle ucu aynı hizaya getirin. Vitellin gemiler için, bir çatal alanı seçerek maksimum alan gemi nüfuz verecektir.
- Iğne gemi doğru itin. Geminin ilk geri çekilecektir. Iğne nüfuz sonra, perfüzyon başlar. Akan kan rengi perfüzyonu ile değiştirmeniz gerekir. Eğer renk değişimi görülür, iğne geminin dışına nüfuz olabilir. Renk değişikliği, geminin aynı anda görüldüğü kadar çözüm pompalama Bu durumda, yavaş yavaş microneedle geri çekmek. Perfüzyon tamamlandıktan sonra, geminin microneedle geri çekin.
Şekil 4: ex-ovo kültürlü civciv embriyo damar içine floresan boya Mikroenjeksiyon.
II. Mikrocerrahi Prosedürü - Sol Atriyal ligasyon
Bu eski-ovo kültür kurulum embriyo tam erişilebilirlik sağlar civciv embriyolarının cerrahi uygulamaları gerçekleştirmek için idealdir. Aşağıda bir örnek tekniği için protokol, sol atriyal ligasyonu (LAL) (Şekil 5). Bu prosedür yaklaşık 24 saat kültür dönemi (HH24) yapılır:
- Knot overhand ~ 0.5 mm çapında 10-0 naylon cerrahi sütür kullanarak hazırlayın.
- Ince forseps ile embriyo üzerinde, yerel ve allantoik koryonik membranlar kaldırmak ve embriyonun sol tarafında görünür olduğunu dikey geri döndürmek için embriyo kaldırın.
- Ince forseps kullanarak, sol atrium içinde perikard kaldırmak.
- Düğüm sol atrium içinde aynı hizaya getirin ve sıkın. ~% 75 sol tarafında orijinal kan akımı yasaklamak gibi düğüm bağlı olmalıdır. Microscissors düğüm kenarları kesin ve fazla dikiş dikkatlice çıkarın ve atın.
- Orijinal oryantasyon (üst sağ tarafı) embriyo geri döndürün.
- Şam kontrolleri aynı prosedürü içerecektir, ancak sütür geçirilir ve bağlı olacaktır. Etkin LAL tedavi (% 75 daralma), ameliyat sonrası 24 saat teyit edilmesi ve diskalifiye embriyolar dışı bırakılacaktır.
Şekil 5: Bir kontrolü ve sol atriyal bağlanan civciv embriyo Ok sol kulakçıklar bağlanan embriyo yaklaşık% 75 daha küçük gösterir .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optik erişim ve kuş embriyolarında deney yumurta kabuğu kısıtlamaları nedeniyle zordur. Pencereleme enjeksiyon ve mikrocerrahi yaklaşımları 8 için erişilebilir mikrodamarlar sayısı önemli ölçüde sınırlar . Sonuç olarak sadece erken embriyolar manipüle ve sürekli gözlem mümkün değildir. Embriyo üzerinde yüzey gerilimi yetersiz denetim nedeniyle uzun süreli kültür 9 engelledi Petri kutularına kullanarak Erken ex ovo kültürleri sınırlı kullanım. Yakın zamanda kabul edilebilir yüzey tenstion 7 korur altıgen tartmak tekne kullanarak bu tekniği gelişmiş, ama bu kültürlerin taşınması zordu. Burada sunulan tekniği bu sorunu çözer ve mikroenjeksiyon ve cerrahi işlemler de dahil olmak üzere istihdam edilecek deneysel yöntemleri ve görüntüleme teknikleri önemli ölçüde genişletiyor. Araştırmalar, daha sonra morfojenik olayları anlamakta odaklanır, bu tekniğin henüz deneysel olarak sürekli çalışma için imkansız olan gelişme olayları izleme ve modülasyonu sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertile white Leghorn chicken eggs | |||
| Model GB1, Avery Incubators, Hugo CO | |||
| Saran Wrap | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | ||
| Rubber bands | |||
| Warm sterile water | |||
| 9 oz plastic cup | |||
| 100 mm diameter Petri dish | |||
| 1602N thermal air | GQF Manufacturing | ||
| Fluorescein-conjugated dextran (2 MDa, 1% w/v in phosphate buffered saline) | Sigma-Aldrich | ||
| Microforge | Glassworx, Inc, St Louis MO | ||
| Glass capillary tubes (0.75 mm ID) | |||
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | Model M3301L | |
| Fluorescent microscopy | Carl Zeiss, Inc. | Z20 | |
| Fine 55-forceps | World Precision Instruments, Inc. | ||
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon Inc. | ||
| Tubing | VWR international | 1mm OD | |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | ||
| 200 μL pipetter and pipette tips | VWR international |
References
- Zamir, E. A., Czirok, A., Cui, C., Little, C. D., Rongish, B. J. Mesodermal cell displacements during avian gastrulation are due to both individual cell-autonomous and convective tissue movements. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19806-19811 (1980).
- Ehrman, L. A., Yutzey, K. E. Lack of regulation in the heart forming region of avian embryos. Dev Biol. 207, 163-175 (1999).
- Clark, E. B., Hu, N., Rosenquist, G. C. Effect of conotruncal constriction on aortic-mitral valve continuity in the stage 18, 21 and 24 chick embryo. Am J Cardiol. 53, 324-327 (1984).
- deAlmeida, A., McQuinn, T., Sedmera, D. Increased ventricular preload is compensated by myocyte proliferation in normal and hypoplastic fetal chick left ventricle. Circ Res. 100, 1363-1370 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Butcher, J. T., McQuinn, T. C., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. R. Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition. Circ Res. 100, 1503-1511 (2007).
- McQuinn, T. C. High-frequency ultrasonographic imaging of avian cardiovascular development. Dev. Dyn. 236, 3503-3513 (2007).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. , (2007).
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev Biol. 41, 391-394 (1974).
