Summary
In dit artikel presenteren we een eenvoudige methode om op lange termijn in staat stellen
Abstract
Het begrijpen van de relatie tussen genetische en microenvironmental factoren die de normale en misvormde embryonale ontwikkeling te stimuleren van fundamenteel belang is voor het ontdekken van nieuwe therapeutische strategieën. De vooruitgang in imaging technologie in staat hebben gesteld kwantitatief onderzoek van de organisatie en de rijping van het lichaam plan, maar later stadium embryonale morfogenese is minder duidelijk. Kippenembryo's zijn een aantrekkelijk gewervelde dier modelsysteem voor deze toepassing vanwege het gemak van cultuur en chirurgische manipulatie. Vroege embryo's kunnen worden gekweekt voor een korte tijd op filtreerpapier ringen, die volledig optische toegang voor mobiele patronen en het lot studies 1,2 mogelijk maakt. Het bestuderen van geavanceerde ontwikkelingsprocessen zoals hart-morfogenese zijn traditioneel uitgevoerd door een raam van de eischaal 3-5, maar deze techniek beperkt optische toegang vanwege venster grootte. We hebben eerder ontwikkelde een eenvoudige methode om de cultuur gehele embryo's ex-ovo op zeshoekige wegen boten voor maximaal 10 dagen, die een hoge resolutie imaging ingeschakeld via echografie 6,7. Deze culturen waren moeilijk te vervoeren, het beperken van de aard van de imaging tools beschikbaar zijn voor live-experimenten. We hebben hier aanwezig zijn een verbeterde shell-minder cultuur-systeem met een kosten-effectieve, draagbare klimaatkamer. Eieren waren gebarsten op een hangmat gemaakt door een polyurethaan membraan (klampen wrap) langs de omtrek aangebracht op een plastic bekertje gedeeltelijk gevuld met steriel water. De afmetingen van de omtrek en de diepte van de hangmat waren zowel kritisch naar de oppervlakte spanning te behouden, terwijl de mechanica van de hangmat en water onder hielp dempen trillingen veroorzaakt door het transport. Een kleine footprint circulerend waterbad werd ook ontwikkeld om constante temperatuurbeheersing tijdens experimenten mogelijk te maken. Tonen we de mogelijkheid om embryo's in de cultuur op deze wijze gedurende ten minste 14 dagen zonder morfogenisch defect of vertraging en dit systeem gebruiken in verschillende microchirurgische en imaging toepassingen.
Protocol
1. Ex-ovo-Cultuur Protocol:
- Incubeer bevruchte kippeneieren
- Bevruchte kippeneieren kan worden opgeslagen bij 13 ° C tot 5 dagen vóór de incubatie zonder inleiding ontwikkeling. Een rode wijn cooler kan handhaven deze temperatuur.
- Incubeer de eieren stompe kant naar boven in een 60% constante luchtvochtigheid incubator met continue rocken bij 37,5 ° C gedurende 72 uur.
- Bereid hangmatten (figuur 1a)
- Vul ¾ van 9 oz plastic bekers met warm steriel water. Een regelmatige 9 oz beker heeft een top diameter van 8 cm. Wij vonden dat dit formaat het meest geschikt is voor lange tijd de cultuur toepassing hier gepresenteerd.
- Snij ongeveer 20 cm vastklampen wrap. Brengen de omtrek op de top van de beker door het plaatsen van een rubberen band om. Plastic moet worden verspreid op de top van het water. Snijd de overtollige plastic rond de band. We vonden vastklampen wrap het meest geschikt voor deze toepassing, omdat het voorkomt aanhechting van de dooier, resulterend in de dooier splitsen tijdens het transport.
- Veeg de kunststof met kimwipes (Kimberly-Clark, Inc), bevochtigd met 70% ethanol.
- Verwijder de eieren van incubator na 72 uur incubatie.
- Steriliseren eieren door af te vegen oppervlak met 70% ethanol bevochtigd kimwipes.
- Horizontaal leggen de eieren 1-2 minuten voor een goede positionering van het embryo (Figuur 1b). Een eierdoos kan worden gebruikt voor het leggen van eieren horizontaal. Embryo's zal draaien naar de top na 1-2 minuten.
- Transfer embryo's op hangmatten aseptisch in een laminaire stroming kap.
- Met behulp van een scherpe rand (zoals de rand van een metalen emmer of een glazen beker), tik het ei tot er een klein deukje aan de onderkant van het ei (figuur 1c). Vergeet niet, is het embryo geplaatst op de bovenzijde.
- Zet duimen in tegenovergestelde zijden van de deuk en trek de schelpen uit elkaar horizontaal (figuur 1d).
- Leg de dooier met embryo als albumine op de hangmat (figuur 1e). Albumine zal zorgen voor een demping omgeving rond de dooier aan schokken veroorzaakt door het bewegen van het systeem zo goed als geeft voeding aan de embryo voor een lange culturele praktijken op te nemen. Water onder de hangmat zorgt voor de embryo zal parallel blijven aan de grond tijdens het transport en dienen als een geleider van warmte tijdens de beeldvorming als een water circulatie verwarming wordt gebruikt.
- Het embryo moet nu al worden geplaatst op de top als de overdracht goed is uitgevoerd. Zo niet, gebruik een onscherp, steriele object (dwz Blunt tip van gesloten gebogen schaar) en directioneel strelen de dooier zodanig dat het embryo draait naar de top.
- Plaats een diameter van 10 cm Petrischaal op de top van de beker voor het embryo afdichting.
- Plaats een kopje cultuur in de couveuse ingesteld op 37,5 ° C. Als een draagbare incubator wordt gebruikt, het plaatsen van 01-02 september oz cups gevuld met gedestilleerd water houdt de luchtvochtigheid op ~ 60% (zie figuur 1f).
- Als het kweken van embryo's buiten embryonale dag 7, moet verpletterd eierschaal stukken worden verspreid over de periferie van het embryo als een bron voor calcium bot-ontwikkeling en rijping.
Bijkomende uitrusting voor buiten incubator beeldvorming / manipulatie:
Een circulerend waterbad werd gebouwd in huis om incubatietemperaturen houden terwijl imaging of manipulatie (figuur 3). Een waterbad dat de beker past is aangesloten via juiste grootte slang aan op een water reservoir. Een weerstand verwarmt het water in het reservoir die handmatig wordt geregeld door het volgen van de watertemperatuur. Een waterpomp circuleert het water. Beknopte beschrijving geeft imaging gemak via ultrasongraphy / florescent microscopie (figuur 3).
Figuur 1. Voorbereiding van de hangmat en de overdracht van kippen embryo's hangmatten.
Figuur 2. Representatieve resultaten -. Andere fase kippenembryo's gegroeid via ex ovo cultuur techniek Embryo's van HH 17 vanaf kan worden geteeld via deze techniek.
Figuur 3. Schematische en representatieve foto's van de water circulatie systeem dat wordt gebruikt in combinatie met de ex-ovo-cultuur systeem om embryo's te houden op de ontwikkeling ideale temperatuur.
2. Geselecteerde toepassingen:
I. micro-injectie
Deze embryo cultuur is geschikt voor micro-injectie toepassingen waar oplossingen moeten worden geïnjecteerd om vasculatuur voor contrast op basis van beeldvorming (dwz fluorescentie microscopie, micro-berekende topografie enz.) (figuur 4). Hieronder vindt u de micro-injectie protocol:
- Bereid de injectie apparaat komttus
- Fashion 0,75 ID glazen capillaire buisjes getrokken in afgeschuinde tip micronaaldjes met behulp van een microforge. Omvang van de benodigde tip hangt af van doel ader gewenste diameter / debiet.
- Verbind de spuit met 0,03 inch ID silicone.
- Laad de slang met de oplossing te injecteren en sluit de micronaaldjes op de buis.
- Plaats de micronaaldjes op de micromanipulator en spuit spuit houder of injectiepomp.
- Voeg steriel water in de beker daarmee het embryo te verhogen. We hebben ervaren dat voor een goede penetratie van de naald in een bloedvat (dwz vitelline schip), horizontale penetratie nodig is. Dit vereist het embryo om op hetzelfde vlak als de randen van de beker.
- Haal de rubberen band die de plastic onder het embryo.
- Til de ene kant van het plastic en voeg wat steriel water om de beker.
- Bevestig de rubberen band op het plastic opnieuw.
- Injecteer de oplossing voor een embryonale vat. In onze ervaring, als oplossing wordt geïnjecteerd met een vitelline schip, micronaalden die nodig is om grote ongeveer 1 / 10 e van het schip diameter om een efficiënte perfusie te onderhouden zonder dat bloeden zijn.
- Pomp de oplossing voor de micronaaldjes zodat er geen vorming van luchtbellen.
- Lijn het puntje van de microneedle op de geselecteerde schip. Voor vitelline schepen, zal het selecteren van een vork ruimte geven maximale ruimte om het schip binnen te dringen.
- Duw de naald naar het schip. Het schip zal eerst intrekken. Zodra de naald doordringt, start perfusie. De kleur van het stromende bloed moet veranderen met de perfusie. Als kleurverandering is niet gezien, kan de naald zijn doorgedrongen uit van het schip. In dat geval langzaam intrekken van de microneedle tegelijkertijd pompoplossing tot kleurverandering in het vat wordt gezien. Zodra de perfusie is voltooid, trekken de microneedle uit van het schip.
Figuur 4: micro-injectie van een fluorescerende kleurstof in het vaatstelsel van een ex-ovo gekweekt kippenembryo.
II. Microchirurgische Procedure - linker atrium Ligatie
Deze ex-ovo-cultuur setup is ideaal voor het uitvoeren van chirurgische toepassingen te kippenembryo's, omdat het voorziet in volledige toegankelijkheid van de embryo. Hieronder is het protocol voor een voorbeeld techniek, linker atrium ligatie (LAL) (figuur 5). De procedure wordt uitgevoerd ongeveer 24 uur in de cultuur periode (HH24):
- Bereid overhandse knopen ~ 0,5 mm diameter met 10-0 nylon chirurgisch hechtdraad.
- Met fijne tang, lokaal verwijder de chorion en allantoïs membranen over het embryo en til het embryo van de rug te draaien deze verticaal zodanig dat de linker kant van het embryo zichtbaar is.
- Met behulp van fijne tang, verwijdert u het hartzakje over het linker atrium.
- Lijn de knoop over het linker atrium en vastschroeven. De knoop moet worden gebonden om ~ 75% van de oorspronkelijke bloedtoevoer naar de linkerkant te verbieden. Snijd de randen van de knoop met microscissors en verwijder voorzichtig en gooi overtollige hechtdraad.
- Terug Draai het embryo in de oorspronkelijke stand (rechts boven).
- Sham controles zullen betrekking hebben op de dezelfde procedure, maar de hechting zal gewoon worden doorgegeven en niet gebonden. Effectieve LAL behandeling (75% vernauwing) zal bevestigd worden 24 uur na de operatie, en gediskwalificeerd embryo's zullen worden uitgesloten.
Figuur 5:. A-controle en een linker atrium geligateerd kippenembryo pijl geeft de linker atria, dat is ongeveer 75% kleiner in de geligeerde embryo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optische toegang en experimenten in het aviaire embryo's is een uitdaging vanwege beperkingen van de eierschaal. Window beperkt aanzienlijk het aantal microvaten toegankelijk voor injectie en microchirurgische benadering 8. Als gevolg daarvan alleen maar vroege embryo's kunnen worden gemanipuleerd en continue observatie is niet mogelijk. Begin van de ex-ovo culturen met behulp van Petri schalen waren slechts beperkt bruikbaar vanwege de ontoereikende controle op de oppervlaktespanning op het embryo voorkomen dat op lange termijn de cultuur 9. We hebben onlangs deze techniek verbeterd met behulp van een zeshoekig wegen boot die aanvaardbaar oppervlak tenstion 7 onderhoudt, maar deze culturen zijn moeilijk te transporteren. De techniek hier gepresenteerde lost dit probleem op en een aanzienlijke uitbreiding van de aard van de experimentele methoden en beeldvormende technieken die kunnen worden ingezet waaronder micro-injectie en chirurgische procedures. Als onderzoek richt zich op het begrijpen van later morfogenisch evenementen, zal deze techniek in staat stellen controle en modulatie van de ontwikkeling van gebeurtenissen die momenteel onmogelijk is om continu experimenteel te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertile white Leghorn chicken eggs | |||
| Model GB1, Avery Incubators, Hugo CO | |||
| Saran Wrap | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | ||
| Rubber bands | |||
| Warm sterile water | |||
| 9 oz plastic cup | |||
| 100 mm diameter Petri dish | |||
| 1602N thermal air | GQF Manufacturing | ||
| Fluorescein-conjugated dextran (2 MDa, 1% w/v in phosphate buffered saline) | Sigma-Aldrich | ||
| Microforge | Glassworx, Inc, St Louis MO | ||
| Glass capillary tubes (0.75 mm ID) | |||
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | Model M3301L | |
| Fluorescent microscopy | Carl Zeiss, Inc. | Z20 | |
| Fine 55-forceps | World Precision Instruments, Inc. | ||
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon Inc. | ||
| Tubing | VWR international | 1mm OD | |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | ||
| 200 μL pipetter and pipette tips | VWR international |
References
- Zamir, E. A., Czirok, A., Cui, C., Little, C. D., Rongish, B. J. Mesodermal cell displacements during avian gastrulation are due to both individual cell-autonomous and convective tissue movements. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19806-19811 (1980).
- Ehrman, L. A., Yutzey, K. E. Lack of regulation in the heart forming region of avian embryos. Dev Biol. 207, 163-175 (1999).
- Clark, E. B., Hu, N., Rosenquist, G. C. Effect of conotruncal constriction on aortic-mitral valve continuity in the stage 18, 21 and 24 chick embryo. Am J Cardiol. 53, 324-327 (1984).
- deAlmeida, A., McQuinn, T., Sedmera, D. Increased ventricular preload is compensated by myocyte proliferation in normal and hypoplastic fetal chick left ventricle. Circ Res. 100, 1363-1370 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Butcher, J. T., McQuinn, T. C., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. R. Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition. Circ Res. 100, 1503-1511 (2007).
- McQuinn, T. C. High-frequency ultrasonographic imaging of avian cardiovascular development. Dev. Dyn. 236, 3503-3513 (2007).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. , (2007).
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev Biol. 41, 391-394 (1974).
