Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En Ex-ovo Kyckling Embryo Culture lämpligt för bildbehandling och mikrokirurgi Applications

Published: October 23, 2010 doi: 10.3791/2154

Summary

I denna artikel presenterar vi en enkel metod för att långsiktigt

Abstract

Förstå sambanden mellan genetiska och microenvironmental faktorer som driver normalt och missbildade embryonal utveckling är grundläggande för att upptäcka nya terapeutiska strategier. Framsteg inom bildteknik har gjort det möjligt kvantitativ undersökning av organisationen och mognar i kroppen planen, men senare embryonala morfogenes är mindre tydligt. Kyckling embryon är en attraktiv ryggradsdjur modellsystem för denna ansökan på grund av dess enkla kultur och kirurgisk manipulation. Tidiga embryon kan odlas under en kort tid på filterpapper ringar, som möjliggör komplett optisk access för cell mönstring och studier öde 1,2. Studera avancerade utvecklingsprocesser såsom hjärt morfogenes traditionellt utförs genom ett fönster på äggskal 3-5, men denna teknik begränsar optisk access på grund av fönstrets storlek. Vi utvecklade tidigare en enkel metod för att kulturen hela embryon ex-ovo den sexkantiga väga båtar för upp till 10 dagar, vilket gjorde högupplösta bilder via ultraljud 6,7. Dessa kulturer var svåra att transportera, vilket begränsar vilka typer av bildbehandling verktyg tillgängliga för live-experiment. Vi presenterar här ett förbättrat skal-mindre kultur-system med en kostnadseffektiv, bärbara klimatkammare. Ägg var spruckna på en hängmatta som skapats av en polyuretan membran (klänga wrap) fästs runt om, med en plastmugg delvis fyllda med sterilt vatten. Måtten på omkrets och djup hängmattan var båda kritiska för att upprätthålla ytspänning, medan mekaniken i hängmattan och vatten under bidragit till att dämpa vibrationer som orsakas av transporter. Ett litet fotavtryck cirkulerande vatten bad också utvecklats för att möjliggöra kontinuerlig temperaturkontroll under experiment. Vi visa förmåga till kultur embryon på detta sätt i minst 14 dagar utan morphogenic fel eller dröjsmål och använder detta system i flera mikrokirurgisk och applikationer avbildning.

Protocol

. 1 Ex-ovo Kultur protokollet:

  1. Inkubera befruktade hönsägg
    1. Befruktade kyckling ägg kan förvaras vid 13 ° C upp till 5 dagar innan inkubering utan att initiera utveckling. En röd vinkyl kan behålla denna temperatur.
    2. Inkubera ägg trubbig uppåt i en 60% konstant luftfuktighet inkubator med kontinuerlig gungande vid 37,5 ° C i 72 timmar.
  2. Förbered hängmattor (Figur 1a)
    1. Fyll ¾ av 9 oz plastmuggar med varmt sterilt vatten. En vanlig 9 oz Cup har en övre diameter på 8 cm. Vi fann att denna storlek var mest lämpade för länge kultur ansökan presenteras här.
    2. Skär ca 20 cm klänga wrap. Klistra fast runt om, på toppen av koppen genom att placera ett gummiband runt. Plast ska spridas ovanpå vattnet. Skär den överskjutande plasten runt bandet. Vi fann håller fast linda vara mest lämpliga för denna applikation eftersom den förhindrar vidhäftning äggulan, vilket resulterar i äggulan splitting under transporten.
    3. Torka av plasten med kimwipes (Kimberly-Clark, Inc.) fuktad med 70% etanol.
  3. Ta bort ägg från inkubatorn efter 72 timmars inkubering.
  4. Sterilisera äggen genom att torka ytan med 70% etanol fuktade kimwipes.
  5. Lägg äggen horisontellt i 1-2 minuter för korrekt placering av embryot (Figur 1b). En äggkartong kan användas för att lägga ägg horisontellt. Embryon kommer att rotera till toppen efter 1-2 minuter.
  6. Överför embryon till hängmattor aseptiskt i ett laminärt flöde huva.
    1. Med hjälp av en vass kant (som kanten på en plåthink eller en glasbägare) trycker ägget försiktigt tills det finns en liten buckla på undersidan av ägget (Figur 1c). Kom ihåg att embryot placeras på ovansidan.
    2. Sätt tummarna på motsatta sidor av buckla och dra skalen isär horisontellt (figur 1d).
    3. Placera äggulan med embryot samt albumin på hängmattan (Figur 1e). Albumin kommer att ge en dämpande miljö runt äggulan som absorberar stötar som orsakas av att flytta systemet och det ger näring till embryot länge kulturen praxis. Vatten under hängmattan kommer att se embryot kommer att stanna parallellt med marken under transport och fungera som en ledare av värme under avbildning om en vattencirkulation värmare används.
    4. Embryot bör redan vara placerad på toppen, om överföringen sker på rätt sätt. Om inte, använd en oskarp, steril objektet (dvs. trubbig spets av slutna böjd sax) och directionally smeka äggulan så att embryot roterar till toppen.
    5. Placera en 10 cm i diameter petriskål ovanpå koppen att försegla embryot.
  7. Placera kopp kultur i inkubatorn inställd på 37,5 ° C. Om en UN-inkubator används, placera 1-2 september oz koppar fyllda med destillerat vatten håller luftfuktigheten på ~ 60% (Figur 1f).
  8. Om odling embryon bortom embryonala Dag 7 ska krossade äggskal bitarna vara utspridda runt periferin av embryot som en kalcium källa för ben utveckling och mognad.

Tillbehör utrustning för utanför inkubatorn bildhantering / manipulation:

En cirkulerande vattenbad byggdes huset för att upprätthålla inkubation temperaturer medan bildbehandling eller manipulation (Figur 3). Ett vattenbad som kan passa koppen är ansluten via lämplig storlek slangen till en vattenreservoar. En värmare värmer upp vattnet i behållaren som regleras manuellt genom att följa vattentemperaturen. En vattenpump cirkulerar vattnet. Av bilder representation skildrar avbildning enkelt via ultrasongraphy / florescent mikroskopi (Figur 3).

Figur 1
Figur 1. Beredning av hängmatta och överföring av kyckling embryon till hängmattor.

Figur 2
Figur 2. Representativa resultat -. Annat skede kycklingembryon vuxit via ex ovo kultur tekniken Embryon från HH 17 och framåt kan odlas via denna teknik.

Figur 3
Figur 3. Schematisk och representativa bilder av vattencirkulationen system som används i samband med ex-ovo kultur system för att hålla embryon vid idealisk utveckling temperatur.

2. Utvalda applikationer:

I. mikroinjektion

Detta embryo kultur är lämplig för mikroinjektion applikationer där lösningar måste injiceras för att kärl för kontrast baserad avbildning (dvs. fluorescerande mikroskopi, mikro-beräknad topografi etc.) (Figur 4). Nedan visas mikroinjektion protokoll:

  1. Förbered injektionen apparaTUS
    1. Mode drog 0,75 ID glas kapillärrör i avfasade spetsen mikronålar hjälp av en microforge. Storlek krävs spetsen beror på målet ven önskad diameter / flöde.
    2. Anslut sprutan till 0,03 tums ID silikonslang.
    3. Ladda slangen med den lösning som skall injiceras och anslut microneedle till slangen.
    4. Placera microneedle på mikromanipulator och spruta för att spruta innehavare eller sprutpump.
  2. Tillsätt sterilt vatten i koppen därmed höja embryot. Vi upplevde att för riktig penetration av nålen i ett blodkärl (dvs. vitelline fartyg), är horisontell penetrationen nödvändig. Detta kräver embryot att vara på samma plan som kanterna på koppen.
    1. Ta ut gummibandet som håller plasten i embryot.
    2. Lyft ena sidan av plasten försiktigt och tillsätt lite sterilt vatten för att koppen.
    3. Fäst gummibandet på plasten igen.
  3. Injicera lösningen på en embryonal fartyg. Enligt vår erfarenhet när det injiceras i en vitelline fartyg, mikronålar behövde storlek ca 1 / 10: e av fartyget diameter för att upprätthålla en effektiv genomblödning utan att orsaka blödning.
    1. Pump lösningen på microneedle garanterar inga luftbubblor bildas.
    2. Rikta spetsen på microneedle på det valda fartyget. För vitelline fartyg kommer att välja en gaffel område ge maximal område att tränga in i fartyget.
    3. Tryck nålen mot fartyget. Fartyget kommer först tillbaka. När nålen penetrerar, börja perfusion. Färgen på det strömmande blodet bör förändras med perfusion. Om färgförändring inte syns, kan nålen har trängt ut ur fartyget. I så fall långsamt dra tillbaka microneedle samtidigt pumplösning till färgförändring i fartyget sett. När perfusionen är klar, dra tillbaka microneedle ut ur fartyget.

Figur 4
Figur 4: mikroinjektion av en fluorescerande färg i kärlsystemet av en ex-ovo odlade kycklingembryo.

II. Mikrokirurgisk Förfarande - vänster förmak Ligation

Detta ex-ovo kultur inställning är idealisk för att utföra kirurgiska applikationer till kycklingembryon eftersom det ger full tillgänglighet till embryot. Nedan följer protokollet för ett exempel teknik, vänster förmak ligation (LAL) (Figur 5). Ingreppet görs cirka 24 timmar i kulturen perioden (HH24):

  1. Förbered overhand knop ~ 0,5 mm diameter med 10-0 nylon kirurgiska sutur.
  2. Med fin pincett, lokalt bort chorionic och allantois membran över embryot och lyft embryot från baksidan att rotera den vertikalt så att vänster sida av embryot är synlig.
  3. Med fin pincett, ta bort hjärtsäcken över vänster förmak.
  4. Rikta knuten över vänster förmak och dra åt. Knuten bör knytas så att förbjuda ~ 75% av den ursprungliga blodflödet till vänster. Skär kanterna av knut med microscissors och försiktigt ta bort och kasta överskott sutur.
  5. Rotera embryot tillbaka till sin ursprungliga orientering (höger upptill).
  6. Sham kontroller kommer att innebära att samma metod, men suturen kommer bara att passera genom och inte bundna. Effektiv LAL behandling (75% förträngning) kommer att bekräftas på 24 timmar efter operation, och diskvalificeras embryon kommer att uteslutas.

Figur 5
Figur 5:. En kontroll och en vänster förmak knyts ihop kycklingembryo Pilen visar den vänstra förmak, vilket är ca 75% mindre i knyts ihop embryot.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Optisk access och försöksverksamhet inom aviär embryon är utmanande på grund av begränsningar i äggskalet. Windowing begränsar betydligt det antal mikrokärl tillgänglig för injektion och mikrokirurgisk metoder 8. Som ett resultat enbart tidiga embryon kan manipuleras och ständig kontroll är inte möjlig. Tidig ex-ovo kulturerna med Petriskålar var av begränsad användning på grund av otillräcklig kontroll av ytspänningen på embryot hindrat långsiktiga kulturen 9. Vi förbättrade nyligen denna teknik med en sexkantig väger båt som håller acceptabel yta tenstion 7, men dessa kulturer var svåra att transportera. Tekniken som presenteras här löser detta problem och väsentligt utökar den typ av experimentella metoder och tekniker avbildning som kan användas bland annat mikroinjektion och kirurgiska ingrepp. Som forskning fokuserar på att förstå senare morphogenic händelser kommer denna teknik att övervakning och anpassning av utvecklingen händelser som för närvarande omöjligt att experimentellt studera kontinuerligt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fertile white Leghorn chicken eggs
Model GB1, Avery Incubators, Hugo CO
Saran Wrap
Kimwipes Kimberly-Clark Corporation
Rubber bands
Warm sterile water
9 oz plastic cup
100 mm diameter Petri dish
1602N thermal air GQF Manufacturing
Fluorescein-conjugated dextran (2 MDa, 1% w/v in phosphate buffered saline) Sigma-Aldrich
Microforge Glassworx, Inc, St Louis MO
Glass capillary tubes (0.75 mm ID)
Micromanipulator World Precision Instruments, Inc. Model M3301L
Fluorescent microscopy Carl Zeiss, Inc. Z20
Fine 55-forceps World Precision Instruments, Inc.
10-0 nylon surgical suture Ethicon Inc.
Tubing VWR international 1mm OD
3 mL syringe BD Biosciences
200 μL pipetter and pipette tips VWR international

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zamir, E. A., Czirok, A., Cui, C., Little, C. D., Rongish, B. J. Mesodermal cell displacements during avian gastrulation are due to both individual cell-autonomous and convective tissue movements. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19806-19811 (1980).
  2. Ehrman, L. A., Yutzey, K. E. Lack of regulation in the heart forming region of avian embryos. Dev Biol. 207, 163-175 (1999).
  3. Clark, E. B., Hu, N., Rosenquist, G. C. Effect of conotruncal constriction on aortic-mitral valve continuity in the stage 18, 21 and 24 chick embryo. Am J Cardiol. 53, 324-327 (1984).
  4. deAlmeida, A., McQuinn, T., Sedmera, D. Increased ventricular preload is compensated by myocyte proliferation in normal and hypoplastic fetal chick left ventricle. Circ Res. 100, 1363-1370 (2007).
  5. Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
  6. Butcher, J. T., McQuinn, T. C., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. R. Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition. Circ Res. 100, 1503-1511 (2007).
  7. McQuinn, T. C. High-frequency ultrasonographic imaging of avian cardiovascular development. Dev. Dyn. 236, 3503-3513 (2007).
  8. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. , (2007).
  9. Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev Biol. 41, 391-394 (1974).

Tags

Utvecklingsbiologi kyckling embryo ex-ovo kultur utvecklingsbiologi mikrokirurgi bildbehandling mikroinjektion ligering
En<em> Ex-ovo</em> Kyckling Embryo Culture lämpligt för bildbehandling och mikrokirurgi Applications
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. More

Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. J. Vis. Exp. (44), e2154, doi:10.3791/2154 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter