Summary
Dans cet article, nous présentons une méthodologie simple pour permettre à long terme
Abstract
Comprendre les relations entre facteurs génétiques et microenvironnementales ce disque normal et malformés développement embryonnaire est fondamentale pour la découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les progrès de la technologie d'imagerie ont permis étude quantitative de l'organisation et la maturation du plan du corps, mais à un stade ultérieur la morphogenèse embryonnaire est moins claire. Embryons de poulet sont un système de vertébrés attractif modèle animal pour cette application en raison de sa facilité de culture et de la manipulation chirurgicale. Embryons précoces peuvent être cultivées pendant un court moment sur les anneaux de papier filtre, qui permet un accès complet optique pour la structuration et le destin cellulaire des études 1,2. Etudier les processus de développement avancés tels que la morphogenèse cardiaque sont traditionnellement effectuées par une fenêtre de la coquille 3-5, mais cette technique limite l'accès optique due à la taille de fenêtre. Nous avons déjà développé une méthode simple pour la culture des embryons toute l'ex-ovo-sur hexagonale pèsent bateaux pour un maximum de 10 jours, ce qui a permis d'imagerie haute résolution via l'échographie 6,7. Ces cultures ont été difficiles à transporter, limitant les types d'outils d'imagerie disponibles pour des expériences en direct. Nous présentons ici un système de culture améliorée sans coquille avec un bon rapport coût-efficacité, chambre environnementale portables. Les œufs étaient fissurés sur un hamac créé par une membrane de polyuréthane (s'accrocher envelopper) apposé circonférentiellement pour une tasse en plastique partiellement rempli d'eau stérile. Les dimensions de la circonférence et la profondeur du hamac sont à la fois critique pour maintenir la tension de surface, tandis que la mécanique du hamac et eau sous aidé à atténuer les vibrations induites par le transport. Un faible encombrement circulant bain d'eau a également été développé pour permettre un contrôle continu de la température lors de l'expérimentation. Nous démontrons la capacité de la culture des embryons de cette manière pendant au moins 14 jours sans défaut ou retard morphogénique et emploient ce système en microchirurgie plusieurs applications d'imagerie.
Protocol
1. Protocole Culture Ex-ovo:
- Incuber les œufs de poule fécondés
- Œufs de poule fécondés peuvent être stockées à 13 ° C jusqu'à 5 jours avant l'incubation sans initier le développement. Un refroidisseur de vin rouge peut maintenir cette température.
- Incuber les œufs côté émoussé dans un 60% d'humidité constant incubateur avec bascule en continu à 37,5 ° C pendant 72 heures.
- Préparer hamacs (figure 1a)
- Remplir aux ¾ de 9 oz gobelets en plastique avec de l'eau stérile chaude. Un habitué 9 oz coupe a un diamètre de 8 cm de haut. Nous avons constaté que cette taille était le plus approprié pour une application à long temps de culture présentées ici.
- Coupez environ 20 cm s'accrocher envelopper. Apposez circonférentiellement sur le dessus de la tasse en plaçant une bande élastique autour. Plastique doivent être répartis sur le dessus de l'eau. Coupez le plastique excédentaire autour de la bande. Nous avons trouvé s'accrocher envelopper d'être le plus approprié pour cette application car elle empêche l'adhérence du jaune, ce qui entraîne la scission jaune pendant le transport.
- Essuyez le plastique avec Kimwipes (Kimberly-Clark, Inc) mouillé avec 70% d'éthanol.
- Retirer les oeufs de l'incubateur après 72 heures d'incubation.
- Stériliser les œufs en essuyant la surface avec 70% d'éthanol Kimwipes mouillée.
- Poser les oeufs à l'horizontale pendant 1-2 minutes pour le bon positionnement de l'embryon (figure 1b). Un carton d'œufs peuvent être utilisés pour la ponte à l'horizontale. Embryons tournera vers le haut après 1-2 minutes.
- Transfert des embryons sur des hamacs de façon aseptique dans une hotte à flux laminaire.
- L'utilisation d'un bord tranchant (comme le bord d'un seau en métal ou un récipient en verre), appuyez doucement jusqu'à ce que l'œuf il ya une petite dent sur la partie inférieure de l'œuf (figure 1c). Rappelez-vous, l'embryon est placé sur la face supérieure.
- Mettez les pouces dans les côtés opposés de la dent et tirer des obus en dehors horizontalement (figure 1d).
- Placer le jaune d'oeuf avec l'embryon ainsi que l'albumine sur le hamac (figure 1E). L'albumine va fournir un environnement d'amortissement autour du jaune pour absorber les chocs induits par le déplacement du système aussi bien qu'il fournit la nutrition de l'embryon pour des pratiques de culture longue. L'eau sous le hamac d'assurer l'embryon va rester parallèle au sol pendant le transport et servir de conducteur de chaleur lors de l'imagerie si un réchauffeur de circulation d'eau est utilisé.
- L'embryon doit déjà être placé sur le dessus si le transfert est effectué correctement. Si non, utiliser un flou, objet stérile (ie. bout émoussé des ciseaux courbes fermées) et caresse le jaune directionnelle tels que l'embryon tourne vers le haut.
- Placer un diamètre de 10 cm boîte de Petri sur le dessus de la tasse pour sceller l'embryon.
- Placer la tasse de la culture dans l'incubateur réglé à 37,5 ° C. Si un incubateur portable est utilisé, placer 1 à 2 sept tasses oz rempli d'eau distillée maintient l'humidité à ~ 60% (figure 1f).
- Si les embryons en culture au-delà de 7 jours embryonnaire, des morceaux coquille écrasée devrait être disséminés sur le pourtour de l'embryon comme une source de calcium pour le développement des os et de la maturation.
Les équipements accessoires pour l'extérieur incubateur d'imagerie / manipulation:
Un bain d'eau circulant dans la maison a été construite pour maintenir les températures d'incubation tout en imagerie ou de manipulation (figure 3). Un bain d'eau qui peuvent tenir la tasse est connecté via un tube de taille appropriée pour un réservoir d'eau. Un chauffage à résistance chauffe l'eau dans le réservoir qui est réglementé manuellement en suivant la température de l'eau. Une pompe à eau fait circuler l'eau. La représentation picturale illustre la facilité d'imagerie par ultrasongraphy / microscopie florescent (figure 3).
Figure 1. Préparation du hamac et le transfert d'embryons de poulet aux hamacs.
Figure 2. Les résultats représentatifs -. Différents embryons de poulet stade adulte moyen technique de culture in ovo ex embryons de HH 17 et suivants peuvent être cultivées par cette technique.
Figure 3. Schéma et photos représentant du système de circulation de l'eau utilisée en conjonction avec le système de culture ex-ovo de garder les embryons à la température idéale de développement.
2. Les demandes sélectionnées:
Microinjection I.
Cette culture de l'embryon est adapté pour des applications où les solutions de micro-injection doivent être injectés au système vasculaire de l'imagerie de contraste à base (c.-à-microscopie à fluorescence, la micro-topographie, etc calculé) (figure 4). Ci-dessous est le protocole de micro-injection:
- Préparer le Appara d'injectionTus
- Mode tiré 0,75 tubes en verre ID capillaire dans les micro-aiguilles embout biseauté en utilisant un microforge. Taille de la pointe requis dépend de la veine cible de diamètre / débit désiré.
- Raccorder la seringue à 0,03 tube de silicone ID pouces.
- Chargez le tube avec la solution à injecter et à connecter le micro-aiguille à la tubulure.
- Placez le micro-aiguille sur le micromanipulateur et une seringue pour porte-seringue ou une pompe à seringue.
- Ajouter de l'eau stérile dans la tasse à augmenter ainsi l'embryon. Nous avons connu que pour une bonne pénétration de l'aiguille dans un vaisseau sanguin (ie. navire vitelline), la pénétration horizontale est nécessaire. Cela nécessite l'embryon d'être sur le même plan que les bords de la tasse.
- Sortez la bande de caoutchouc tenant le plastique sous l'embryon.
- Soulever un côté de la plastique doucement et ajouter de l'eau stérile pour la tasse.
- Fixez la bande de caoutchouc sur le plastique de nouveau.
- Injecter la solution à un navire embryonnaire. Dans notre expérience, quand la solution est injectée à un navire vitelline, micro-aiguilles nécessaires pour être dimensionnée e environ 1 / 10 du diamètre du vaisseau pour maintenir la perfusion efficace sans causer des saignements.
- Pomper la solution à la micro-aiguille assurant pas de formation de bulles d'air.
- Aligner l'extrémité de la micro-aiguille sur le navire sélectionné. Pour vaisseaux vitellins, en sélectionnant une zone de fourche donnera superficie maximale de pénétrer dans le navire.
- Poussez l'aiguille vers le navire. Le navire va d'abord se rétracter. Une fois que l'aiguille pénètre, commencer la perfusion. La couleur du sang qui coule devrait changer avec la perfusion. Si le changement de couleur ne se voit pas, l'aiguille peut avoir pénétré dans le navire. Dans ce cas, lentement se rétractent la micro-aiguille de pompage tout en solution jusqu'à changer de couleur dans le vaisseau est vu. Une fois la perfusion terminée, retirer la micro-aiguille hors du navire.
Figure 4: microinjection d'un colorant fluorescent dans le système vasculaire de l'embryon ex-ovo-chiches cultivés.
II. Procédure microchirurgicale - Gauche Ligature auriculaire
Cette configuration de la culture ex-ovo est idéale pour réaliser des applications chirurgicales pour les embryons de poulet car elle offre une accessibilité totale à l'embryon. Voici le protocole d'une technique par exemple, a quitté la ligature auriculaire (LAL) (figure 5). La procédure est réalisée environ 24 heures dans la période de culture (HH24):
- Préparer pronation noeuds ~ 0,5 mm de diamètre à l'aide de suture en nylon 10-0 chirurgicale.
- Avec une pince fine, localement enlever les membranes choriales et allantoïdien sur l'embryon et soulever l'embryon de l'arrière pour faire pivoter verticalement de telle sorte que c'est le côté gauche de l'embryon est visible.
- En utilisant une pince fine, enlevez le péricarde sur l'atrium gauche.
- Alignez les noeuds sur l'oreillette gauche et le serrer. Le nœud doit être lié de manière à interdire ~ 75% de la circulation sanguine d'origine pour le côté gauche. Couper les bords du noeud avec microciseaux et retirez et jetez de suture excès.
- Tournez l'embryon revenir à son orientation d'origine (à droite sur le dessus).
- Contrôle Sham impliquera la même procédure mais la suture sera juste passé à travers et non liées. L'efficacité du traitement du labo (75% de constriction) sera confirmée à 24 heures post-chirurgie, et les embryons disqualifiés seront exclus.
Figure 5:. Un contrôle et une gauche d'embryon de poulet ligaturé auriculaire La flèche indique l'oreillette gauche, qui est d'environ 75% plus petit dans l'embryon ligaturé.
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Discussion
L'accès optique et d'expérimentation dans les embryons aviaire est difficile en raison de contraintes de la coquille d'œuf. Fenêtrage limite considérablement le nombre d'accès à des approches d'injection et de microchirurgie 8 microvaisseaux. En conséquence seuls les embryons précoces peuvent être manipulés et de l'observation en continu n'est pas possible. Début ex-ovo-cultures utilisant des boîtes de Petri ont été d'un usage limité à cause du contrôle insuffisant de la tension de surface sur l'embryon empêché à long terme de culture 9. Nous avons récemment amélioré cette technique en utilisant un bateau qui pèsent hexagonale maintient tenstion surface acceptable 7, mais ces cultures ont été difficiles à transporter. La technique présentée ici permet de résoudre ce problème et élargit considérablement le type de méthodes expérimentales et des techniques d'imagerie qui peuvent être employées, y compris les procédures de micro-injection et chirurgicales. Comme la recherche porte sur la compréhension des événements tard morphogénique, cette technique permettra le suivi et la modulation des événements de développement qui sont actuellement impossibles à titre expérimental d'étude en continu.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertile white Leghorn chicken eggs | |||
| Model GB1, Avery Incubators, Hugo CO | |||
| Saran Wrap | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | ||
| Rubber bands | |||
| Warm sterile water | |||
| 9 oz plastic cup | |||
| 100 mm diameter Petri dish | |||
| 1602N thermal air | GQF Manufacturing | ||
| Fluorescein-conjugated dextran (2 MDa, 1% w/v in phosphate buffered saline) | Sigma-Aldrich | ||
| Microforge | Glassworx, Inc, St Louis MO | ||
| Glass capillary tubes (0.75 mm ID) | |||
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | Model M3301L | |
| Fluorescent microscopy | Carl Zeiss, Inc. | Z20 | |
| Fine 55-forceps | World Precision Instruments, Inc. | ||
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon Inc. | ||
| Tubing | VWR international | 1mm OD | |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | ||
| 200 μL pipetter and pipette tips | VWR international |
References
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