Summary
In questo articolo presentiamo una metodologia semplice per permettere a lungo termine
Abstract
Comprendere le relazioni tra fattori genetici e microambientali che guidano normali e malformate sviluppo embrionale è fondamentale per scoprire nuove strategie terapeutiche. I progressi nella tecnologia di imaging hanno permesso indagine quantitativa dell'organizzazione e della maturazione del piano di corpo, ma una fase successiva morfogenesi embrionale è meno chiara. Embrioni di pollo sono un interessante modello animale vertebrato sistema per questa applicazione a causa della sua facilità di cultura e di manipolazione chirurgica. Embrioni precoci possono essere coltivate per un breve periodo su anelli carta da filtro, che permette l'accesso completo ottici per patterning cellulare e il destino 1,2 studi. Lo studio dei processi avanzati dello sviluppo come morfogenesi cardiaca sono tradizionalmente svolte attraverso una finestra del guscio 3-5, ma questa tecnica limita l'accesso ottico a causa delle dimensioni della finestra. Abbiamo già messo a punto un metodo semplice per la cultura embrioni interi franco-ovo su esagonale pesare imbarcazioni fino a 10 giorni, che ha permesso di imaging ad alta risoluzione tramite ecografia 6,7. Queste culture sono state difficili da trasportare, limitando i tipi di strumenti di imaging disponibili per esperimenti dal vivo. Noi qui presenti una migliore senza guscio sistema di coltura con un costo-efficace, camera portatile ambientale. Uova erano incrinate su un amaca creato da una membrana poliuretanica (pellicola trasparente) apposto la circonferenza un bicchiere di plastica parzialmente piena d'acqua sterile. Le dimensioni della circonferenza e la profondità della amaca erano entrambi critici per mantenere la tensione superficiale, mentre la meccanica del amaca e acqua sotto aiutato smorzare le vibrazioni indotte dal trasporto. Un piccolo ingombro circolante bagno d'acqua è stato anche sviluppato per consentire un controllo continuo della temperatura durante la sperimentazione. Dimostriamo la capacità di embrioni cultura in questo modo per almeno 14 giorni senza difetto morfogenici o ritardi ed impiegare questo sistema in microchirurgia diversi e applicazioni di imaging.
Protocol
1. Ex-ovo Cultura protocollo:
- Incubare uova di gallina fecondate
- Uova di gallina fecondate possono essere conservati a 13 ° C fino a 5 giorni prima di incubazione senza avviare lo sviluppo. Un raffreddamento di vino rosso in grado di mantenere questa temperatura.
- Incubare le uova lato smussato in un incubatore di umidità del 60% costante con dondolo continuo a 37,5 ° C per 72 ore.
- Preparare amache (Figura 1a)
- Riempire ¾ di 9 bicchieri di plastica oz con acqua calda sterile. Un regolare 9 oz tazza ha un diametro superiore di 8 cm. Abbiamo scoperto che queste dimensioni era più adatto per l'applicazione della cultura lungo tempo presentato qui.
- Taglio di circa 20 cm pellicola trasparente. Circonferenza apporre sulla parte superiore della coppa mettendo un elastico intorno. Plastica dovrebbe essere ripartito in cima l'acqua. Tagliare la plastica in eccesso intorno alla band. Abbiamo trovato pellicola trasparente per essere più appropriato per questa applicazione in quanto impedisce l'adesione del tuorlo, con conseguente suddivisione tuorlo durante il trasporto.
- Pulire la plastica con Kimwipes (Kimberly-Clark, Inc.) bagnate con il 70% di etanolo.
- Rimuovere le uova da incubatrice dopo 72 ore di incubazione.
- Sterilizzare le uova strofinando la superficie con etanolo al 70% Kimwipes bagnata.
- Deporre le uova in orizzontale per 1-2 minuti per il corretto posizionamento degli embrioni (Figura 1b). Una scatola di uova può essere utilizzato per deporre le uova in orizzontale. Gli embrioni ruoterà verso l'alto dopo 1-2 minuti.
- Trasferimento degli embrioni su amache in modo asettico in una cappa a flusso laminare.
- Usando un bordo tagliente (come il bordo di un secchio di metallo o di un bicchiere di vetro), toccare delicatamente l'uovo fino a quando vi è una piccola ammaccatura sul lato inferiore delle uova (Figura 1c). Ricordate, l'embrione è posizionato sulla superficie superiore.
- Mettete i pollici in lati opposti della ammaccatura e tirare i gusci a parte in orizzontale (Figura 1d).
- Mettere il tuorlo con embrione così come l'albumina sulla amaca (figura 1e). Albumina fornirà un ambiente di smorzamento intorno al tuorlo di assorbire gli shock indotto spostando il sistema così come fornisce nutrimento all'embrione per le pratiche della cultura lungo. Acqua sotto l'amaca garantirà l'embrione rimane parallelo al terreno durante il trasporto e fungere da conduttore di calore durante l'imaging se un riscaldatore a circolazione d'acqua è usato.
- L'embrione deve essere già posizionato sulla parte superiore se il trasferimento viene effettuato correttamente. In caso contrario, utilizzare un contrasto, un oggetto sterile (es. Blunt punta di forbici curve chiuse) e direzionale accarezzare il tuorlo in modo che l'embrione ruota verso l'alto.
- Posizionare un diametro di 10 centimetri piatto Petri in cima alla coppa per sigillare l'embrione.
- Luogo cultura tazza in incubatore a 37,5 ° C. Se un incubatore portatile è usato, ponendo 01-02 settembre tazze oz riempita con acqua distillata mantiene l'umidità a ~ 60% (Fig. 1f).
- Se gli embrioni al di là di coltura embrionale giorni 7, pezzi di guscio d'uovo tritato devono essere sparsi per la periferia dell'embrione come fonte di calcio per lo sviluppo e la maturazione delle ossa.
Equipaggiamento accessorio per esterno incubatore di imaging / manipolazione:
Un bagno d'acqua in circolo è stato costruito in casa per mantenere la temperatura di incubazione, mentre imaging o manipolazione (Figura 3). Un bagno d'acqua che può andare bene la coppa è collegato tramite tubazione dimensioni adeguate ad un serbatoio d'acqua. Un riscaldatore resistenza riscalda l'acqua nel serbatoio, che viene regolata manualmente seguendo la temperatura dell'acqua. Una pompa acqua circola l'acqua. Rappresentazione pittorica raffigura la facilità di imaging tramite ultrasongraphy / microscopia florescent (Figura 3).
Figura 1. Preparazione di amaca e il trasferimento di embrioni di pollo al amache.
Figura 2. Risultati rappresentativi -. Diversi embrioni di pollo fase cresciuta attraverso la cultura tecnica ex ovo embrioni da SS 17 in poi possono essere coltivate attraverso questa tecnica.
Figura 3. Immagini schematiche e rappresentante del sistema di circolazione dell'acqua utilizzata in congiunzione con l'ex-ovo sistema di coltura per mantenere gli embrioni a temperatura ideale di sviluppo.
2. Applicazioni selezionato:
I. Microiniezione
Questa cultura embrione è adatto per applicazioni microiniezione in cui le soluzioni devono essere iniettati per l'imaging vascolare di contrasto a base (es. microscopia a fluorescenza, micro-topografia computerizzata, ecc) (Figura 4). Di seguito è riportato il protocollo microiniezione:
- Preparare il apparec iniezionetus
- Moda tirato 0,75 tubi di vetro capillari ID in microaghi punta smussata con un microforge. Dimensioni della punta richiesta dipende vena obiettivo diametro / portata desiderata.
- Collegare la siringa a 0,03 pollici tubo in silicone ID.
- Caricare il tubo con la soluzione da iniettare e collegare il microago al tubo.
- Posizionare il microago sul micromanipolatore e siringa titolare siringa o pompa a siringa.
- Aggiungere acqua sterile in tazza in modo da accrescere l'embrione. Abbiamo sperimentato che per la penetrazione corretta dell'ago in un vaso sanguigno (es. vasi vitellina), la penetrazione orizzontale è necessario. Ciò richiede l'embrione di essere sullo stesso piano, come i bordi della tazza.
- Estrarre l'elastico tenendo la plastica sotto l'embrione.
- Sollevare un lato della plastica delicatamente e aggiungere un po 'di acqua sterile per la coppa.
- Fissare l'elastico sulla plastica di nuovo.
- Iniettare la soluzione di un vaso embrionale. Nella nostra esperienza, quando la soluzione viene iniettata a una nave vitellina, microaghi doveva essere di dimensioni ° circa 1 / 10 del diametro del vaso per mantenere la perfusione efficace senza causare sanguinamento.
- Pompa la soluzione per il microago garantendo l'assenza di formazione di bolle d'aria.
- Allineare la punta del microago sulla nave selezionata. Per le navi vitellina, selezionando un'area forchetta darà superficie massima di penetrare la nave.
- Spingere l'ago verso la nave. La nave per prima ritrattare. Una volta che l'ago penetra, avviare perfusione. Il colore del sangue che scorre dovrebbe cambiare con perfusione. Se il cambiamento di colore non si vede, l'ago potrebbe essere penetrato dalla nave. In questo caso, ritirare lentamente il microago allo stesso tempo la soluzione di pompaggio fino a cambiare colore nel vaso si vede. Una volta che la perfusione è completo, ritirare il microago fuori dal vaso.
Figura 4: microiniezione di un colorante fluorescente nel sistema vascolare di un ex-ovo-embrione di pollo in coltura.
II. Microchirurgico Procedura - Sinistra Legatura atriale
Questo ex-ovo configurazione cultura è l'ideale per l'esecuzione di applicazioni chirurgiche di embrioni di pollo in quanto fornisce la piena accessibilità per l'embrione. Di seguito è riportato il protocollo per una tecnica, ad esempio, la legatura atriale sinistro (LAL) (Figura 5). La procedura viene eseguita circa 24 ore nel periodo di coltura (HH24):
- Preparare overhand nodi ~ 0,5 mm di diametro con 10-0 sutura chirurgica nylon.
- Con una pinza sottile, localmente rimuovere le membrane coriali e allantoide oltre l'embrione e sollevare l'embrione dal retro per ruotare verticalmente in modo tale che il lato sinistro dell'embrione è visibile.
- Utilizzando una pinza sottile, rimuovere il pericardio sopra l'atrio sinistro.
- Allineare il nodo sopra l'atrio sinistro e stringerlo. Il nodo dovrebbe essere legata in modo da vietare ~ 75% del flusso di sangue originale sul lato sinistro. Tagliare i bordi del nodo con microscissors e rimuovere con cautela e scartare sutura in eccesso.
- Ruotare l'embrione al suo orientamento originale (lato destro in alto).
- Controlli Sham coinvolgerà la stessa procedura, ma la sutura sarà solo attraversato e non legato. Efficace trattamento LAL (75 costrizione%) sarà confermato a 24 ore dopo la chirurgia, e gli embrioni squalificato saranno esclusi.
Figura 5:. Un controllo e una sinistra embrione atriale pulcino legatura Arrow mostra gli atri sinistra, che è circa il 75% più piccolo nell'embrione legato.
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Discussion
Accesso ottico e sperimentazione negli embrioni aviaria è una sfida a causa dei vincoli del guscio d'uovo. Windowing limita in modo significativo il numero di accesso per gli approcci di iniezione e microchirurgia 8 microvasi. Di conseguenza solo gli embrioni precoci possono essere manipolati e costante osservazione non è possibile. Primi ex-ovo culture utilizzando piastre di Petri erano di uso limitato a causa di un inadeguato controllo della tensione superficiale sull'embrione impedito a lungo termine cultura 9. Recentemente abbiamo migliorato questa tecnica utilizzando un esagonale pesare barca che mantiene tenstion accettabile superficie 7, ma queste culture erano difficili da trasportare. La tecnica qui presentata risolve questo problema e si espande in modo significativo dal tipo di metodi sperimentali e tecniche di imaging che possono essere impiegati, comprese le procedure microiniezione e chirurgiche. Come la ricerca si concentra sulla comprensione eventi successivi morfogenici, questa tecnica consentirà il monitoraggio e la modulazione di eventi di sviluppo che sono attualmente impossibile studiare sperimentalmente in modo continuo.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertile white Leghorn chicken eggs | |||
| Model GB1, Avery Incubators, Hugo CO | |||
| Saran Wrap | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | ||
| Rubber bands | |||
| Warm sterile water | |||
| 9 oz plastic cup | |||
| 100 mm diameter Petri dish | |||
| 1602N thermal air | GQF Manufacturing | ||
| Fluorescein-conjugated dextran (2 MDa, 1% w/v in phosphate buffered saline) | Sigma-Aldrich | ||
| Microforge | Glassworx, Inc, St Louis MO | ||
| Glass capillary tubes (0.75 mm ID) | |||
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | Model M3301L | |
| Fluorescent microscopy | Carl Zeiss, Inc. | Z20 | |
| Fine 55-forceps | World Precision Instruments, Inc. | ||
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon Inc. | ||
| Tubing | VWR international | 1mm OD | |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | ||
| 200 μL pipetter and pipette tips | VWR international |
References
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