Summary
Neste artigo, apresentamos uma metodologia simples para ativar a longo prazo
Abstract
Compreender as relações entre fatores genéticos e microambientais que a unidade normal e malformados desenvolvimento embrionário é fundamental para descobrir novas estratégias terapêuticas. Avanços na tecnologia de imagem têm permitido investigação quantitativa da organização e amadurecimento do plano do corpo, mas numa fase posterior morfogênese embrionária é menos clara. Embriões de galinha são um atrativo vertebrados sistema modelo animal para esta aplicação devido à sua facilidade de cultura e manipulação cirúrgica. Embriões podem ser cultivadas por um curto período em anéis de papel de filtro, que permite acesso óptico completo para padronização celular e 1,2 estudos destino. Estudar processos avançados de desenvolvimento, como a morfogênese cardíaca são tradicionalmente realizada através de uma janela da casca do ovo 3-5, mas esta técnica limita o acesso óptico devido ao tamanho da janela. Nós já desenvolveu um método simples para a cultura de todo o embrião ex-ovo no hexagonal pesar barcos para até 10 dias, o que permitiu imagens de alta resolução através de ultra-sonografia 6,7. Essas culturas foram difíceis de transportar, limitando os tipos de ferramentas de imagem disponíveis para experimentos ao vivo. Nós aqui apresentar um sistema de cultura melhorou shell-less com um custo-benefício, a câmara portátil ambiental. Os ovos estavam rachados em uma rede criada por uma membrana de poliuretano (filme plástico) aposta circunferencialmente para um copo de plástico parcialmente cheio com água estéril. As dimensões da circunferência ea profundidade da rede eram fundamentais para manter a tensão superficial, enquanto os mecânicos da rede e água abaixo ajudou amortecem as vibrações induzidas por transporte. A pegada pequena circulação banho de água também foi desenvolvido para permitir o controle de temperatura contínua durante a experimentação. Nós demonstramos a capacidade de cultura de embriões, desta forma, pelo menos, 14 dias sem defeito ou atraso morfogênicos e empregar este sistema em vários de microcirurgia e aplicações de imagem.
Protocol
1. Protocolo Cultura Ex-ovo:
- Incubar ovos de galinha fertilizados
- Ovos de galinha fertilizados podem ser armazenadas a 13 ° C até 5 dias antes da incubação sem iniciar o desenvolvimento. Um refrigerador de vinho tinto pode manter esta temperatura.
- Incubar ovos lado sem corte em um 60% de umidade constante incubadora com balanço contínuo a 37,5 ° C por 72 horas.
- Prepare redes (Figura 1a)
- Preencha ¾ de 9 oz copos de plástico com água estéril morna. A regularidade 9 oz copo tem um diâmetro superior de 8 cm. Descobrimos que este tamanho era o mais adequado para aplicação de longa data a cultura aqui apresentado.
- Cortar cerca de 20 cm filme plástico. Apor circunferencialmente em cima do copo, colocando uma faixa de borracha ao redor. Plástico deve ser espalhado em cima da água. Corte o excesso de plástico em torno da banda. Encontramos filme plástico a ser mais adequado para esta aplicação, uma vez que previne a adesão da gema, resultando na separação da gema durante o transporte.
- Limpe o plástico com kimwipes (Kimberly-Clark, Inc.) umedecido com álcool 70%.
- Retire os ovos da incubadora após 72 horas de incubação.
- Esterilizar os ovos, limpando a superfície com álcool 70% kimwipes molhada.
- Colocar os ovos na horizontal por 1-2 minutos para o posicionamento adequado do embrião (Figura 1b). Uma caixa de ovos pode ser usado para colocar ovos na horizontal. Embriões irá girar ao topo após 1-2 minutos.
- Transferência de embriões em redes assepticamente em uma capela de fluxo laminar.
- Usando uma borda afiada (como a borda de um balde de metal ou um copo de vidro), toque o ovo delicadamente até que haja um pequeno dente na parte inferior do ovo (Figura 1c). Lembre-se, o embrião é posicionado no upperside.
- Colocar os polegares em lados opostos do dente e puxe as cascas para além horizontalmente (Figura 1d).
- Coloque a gema com o embrião, bem como a albumina para a rede (figura 1e). Albumina irá proporcionar um ambiente de amortecimento em torno da gema para absorver os choques induzidos movendo o sistema, bem como proporciona nutrição para o embrião para as práticas da cultura de comprimento. Água por baixo da rede vai garantir o embrião vai ficar paralelos ao chão durante o transporte e servir como um condutor de calor durante o exame, se um aquecedor de circulação de água é utilizada.
- O embrião já deve ser colocada em cima se a transferência for realizada corretamente. Se não, use um unsharp, objeto estéril (ou seja, de ponta Blunt tesoura curva fechada) e acariciar direcionalmente a gema de tal forma que o embrião gira ao topo.
- Lugar a 10 cm de diâmetro placa de Petri em cima do copo para selar o embrião.
- Colocar a cultura copo no set incubadora a 37,5 ° C. Se uma incubadora portátil é utilizado, colocando setembro 1-2 copos oz preenchido com água destilada mantém a umidade em ~ 60% (Figura 1f).
- Se os embriões cultura além do dia embrionárias 7, pedaços de casca de ovo esmagada devem ser espalhadas em torno da periferia do embrião como fonte de cálcio para o desenvolvimento ósseo e maturação.
Equipamento acessório para a incubadora fora imagem / manipulação:
Um banho de água circulante foi construída em casa para manter a temperatura de incubação, enquanto imagens ou manipulação (Figura 3). Um banho de água que pode caber o cálice é ligado através de tubos de tamanho apropriado para um reservatório de água. Um aquecedor de resistência aquece a água no reservatório, que é regulada manualmente, seguindo a temperatura da água. Uma bomba de água circula a água. Representação pictórica mostra a facilidade de imagens via ultrasongraphy / microscopia fluorescente (Figura 3).
Figura 1. Preparação de rede e transferência de embriões de galinha para redes.
Figura 2. Resultados representativos -. Embriões de galinha cresceu estágio diferente através de técnica de cultura de embriões ex ovo HH 17 em diante podem ser cultivadas através desta técnica.
Figura 3. Imagens esquemáticas e representante do sistema de circulação de água utilizada em conjunto com o sistema de cultura ex-ovo para manter os embriões à temperatura ideal de desenvolvimento.
2. Os pedidos seleccionados:
Microinjeção I.
Esta cultura de embriões é adequado para aplicações microinjeção onde as soluções precisam ser injetado para vasculatura para geração de imagens baseado em contraste (microscopia de fluorescência ou seja, micro-topografia computadorizada, etc) (Figura 4). Abaixo está o protocolo de microinjeção:
- Prepare comparti injeçãotus
- Moda puxado 0,75 tubos ID capilar de vidro em ponta chanfrada microagulhas usando um microforge. Tamanho da ponta necessária depende taxa alvo veia diâmetro / fluxo desejado.
- Conectar a seringa ao tubo 0,03 polegadas ID silicone.
- Carregar o tubo com a solução a ser injetado e conecte o microagulhas para a tubulação.
- Coloque o microagulhas e micromanipulador para a seringa para titular seringa ou bomba de seringa.
- Adicionar água esterilizada no copo, assim, elevar o embrião. Nós experimentamos que para a penetração adequada da agulha em um vaso sanguíneo (navio vitelínico ou seja), a penetração horizontal é necessária. Isso requer o embrião estar no mesmo plano que as bordas do copo.
- Retire a banda de borracha que segura o plástico sob o embrião.
- Levantar um dos lados do plástico com cuidado e acrescente um pouco de água estéril para o copo.
- Segura o elástico para o plástico de novo.
- Injetar a solução para um navio embrionárias. Em nossa experiência, quando a solução é injetada a um navio vitelínico, microagulhas precisava ser ª cerca de 1 / 10 de tamanho do diâmetro do vaso para manter a perfusão eficiente sem causar sangramento.
- Bombear a solução para o microneedle garantindo que não haja formação de bolhas de ar.
- Alinhe a ponta do microagulhas para o navio selecionado. Para os navios vitelínico, a seleção de uma área de garfo dará área máxima para penetrar na embarcação.
- Empurre a agulha em direção ao navio. O navio irá primeiro retrair. Uma vez que a agulha penetra, iniciar a perfusão. A cor do sangue que flui deve mudar com a perfusão. Se mudar de cor não é visto, a agulha pode ter penetrado para fora da embarcação. Nesse caso, lentamente retrair o microagulhas, ao mesmo tempo de bombeamento solução até mudar de cor no vaso é visto. Uma vez que a perfusão está completo, recolher o microagulhas para fora da embarcação.
Figura 4: microinjeção de um corante fluorescente na vasculatura de um embrião de galinha ex-ovo cultivadas.
II. Procedimento de microcirurgia - Ligadura Atrial Esquerda
Esta configuração cultura ex-ovo é ideal para a realização de aplicações cirúrgicas de embriões de galinha, uma vez que oferece acessibilidade total para o embrião. Abaixo está o protocolo de uma técnica de exemplo, deixou ligadura atrial (LAL) (Figura 5). O procedimento é realizado em aproximadamente 24 horas para o período de cultura (HH24):
- Prepare overhand nós ~ 0,5 mm de diâmetro com fio de náilon 10-0 cirúrgico.
- Com uma pinça fina, localmente remover as membranas coriônica e alantóide sobre o embrião e levante o embrião de trás para girá-lo na vertical de tal forma que o lado esquerdo do embrião é visível.
- Utilizando uma pinça fina, retire o pericárdio sobre o átrio esquerdo.
- Alinhar o nó sobre o átrio esquerdo e aperte-a. O nó deve ser amarrado de modo a proibir ~ 75% do fluxo sangüíneo original para o lado esquerdo. Cortar as bordas do nó com microtesoura e remova cuidadosamente e descarte de sutura em excesso.
- Gire o embrião de volta à sua orientação original (lado direito em cima).
- Controles Sham envolverá o mesmo procedimento, mas a sutura só vai ser transmitido através de e não vinculados. Tratamento eficaz LAL (75% constrição) será confirmado com 24 horas pós-cirurgia, e os embriões desqualificado serão excluídas.
Figura 5:. Um controle e um embrião de galinha atrial esquerda ligada seta mostra o átrio esquerdo, que é cerca de 75% menor no embrião ligado.
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Discussion
Acesso óptico e experimentação em embriões de aves é um desafio devido às limitações da casca do ovo. Windowing limita significativamente o número de microvasos acessível para injeção e abordagens microcirúrgicas 8. Como resultado, apenas embriões podem ser manipulados e observação contínua não é possível. Início ex-ovo culturas usando placas de Petri eram de uso limitado por causa do controle inadequado da tensão superficial sobre o embrião impediu a cultura a longo prazo 9. Recentemente, esta técnica melhorada usando um barco pesa hexagonal que mantém tenstion superfície aceitável 7, mas essas culturas eram difíceis de transportar. A técnica apresentada aqui resolve este problema e expande significativamente o tipo de métodos experimentais e técnicas de imagem que pode ser aplicado, incluindo procedimentos de microinjeção e cirúrgicos. Como a pesquisa se concentra em entender os eventos posteriores morfogênicos, esta técnica vai permitir a monitorização e modulação de eventos de desenvolvimento que estão actualmente impossível experimentalmente estudo continuamente.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertile white Leghorn chicken eggs | |||
| Model GB1, Avery Incubators, Hugo CO | |||
| Saran Wrap | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | ||
| Rubber bands | |||
| Warm sterile water | |||
| 9 oz plastic cup | |||
| 100 mm diameter Petri dish | |||
| 1602N thermal air | GQF Manufacturing | ||
| Fluorescein-conjugated dextran (2 MDa, 1% w/v in phosphate buffered saline) | Sigma-Aldrich | ||
| Microforge | Glassworx, Inc, St Louis MO | ||
| Glass capillary tubes (0.75 mm ID) | |||
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | Model M3301L | |
| Fluorescent microscopy | Carl Zeiss, Inc. | Z20 | |
| Fine 55-forceps | World Precision Instruments, Inc. | ||
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon Inc. | ||
| Tubing | VWR international | 1mm OD | |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | ||
| 200 μL pipetter and pipette tips | VWR international |
References
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