Summary
Мы описываем процедуры регистрации ежедневной двигательной активности ритмы
Abstract
Большинство форм жизни выставку суточные ритмы в клеточных, физиологических и поведенческих явлений, которые приводятся в действие эндогенных циркадных (≡ 24 ч) кардиостимуляторы или часы. Сбои в системе человеческих циркадных связаны с возникновением многочисленных заболеваний или расстройств. Значительный прогресс по отношению к нашему пониманию механизмов, лежащих циркадных ритмов вышла из генетических экраны которого легко измерить поведенческих ритм используется как считывание функции часов. Исследования с использованием дрозофилы внесли конструктивный вклад в наше понимание клеточных и биохимических основ лежащий в основе циркадных ритмов. Стандартный циркадные поведенческие считывания измеряется в дрозофилы двигательной активности. В целом, система мониторинга включает в себя специально разработанные устройства, которые можно измерить опорно-двигательного движение дрозофилы. Эти устройства располагаются в экологически контролируемых инкубаторы расположены в темной комнате, и основаны на использовании прерывания луч инфракрасного света для записи двигательной активности отдельных мух содержится внутри трубочки. При проведении измерений в течение многих дней, дрозофилы выставку ежедневно циклы активности и бездействия, поведенческие ритм, который регулируется эндогенных циркадных системы животного. Общая процедура была упрощена с появлением коммерчески доступных устройств опорно-двигательной активности мониторинг и развитие программного обеспечения для анализа данных. Мы используем систему от Trikinetics Inc, которая является процедура, описанная здесь, и в настоящее время наиболее популярная система используется во всем мире. Совсем недавно те же устройства мониторинга были использованы для изучения сна поведения у дрозофилы. Потому что ежедневный сон-бодрствование циклы много мух могут быть измерены одновременно, и только 1 до 2 недель стоит непрерывного данных двигательной активности обычно достаточно, эта система идеально подходит для крупномасштабных экраны для выявления дрозофилы проявляется изменены циркадных или сон свойствами.
Protocol
Общий дизайн протокол показано на рисунке 1. Установки для мониторинга двигательной активности с использованием приборов разместился в экологически контролируемых инкубаторы расположены в темной комнате должна быть собрана в первую очередь. Как только это будет завершена, система может использоваться во всех последующих измерений деятельности опорно-двигательного ритма. Для каждого эксперимента, нужно (я) подготовки экспериментальных животных, которые могут включать в создании трансгенных животных и создание необходимых крестов, (II) подготовка стекла деятельности пробирки, содержащие источник пищи, (III) нагрузки летит в деятельности трубы и подключения мониторов деятельности в систему сбора данных, и (IV), записи и анализа данных с помощью различного программного обеспечения в зависимости от того, что циркадные или спать параметры кто-то хочет, чтобы исследовать. Здесь мы определяем «запуска» эксперимент как время, когда летит в мониторинг устройств сначала выставлен желаемый светлый / темный условий окружающей среды инкубаторов.
1. Настройка опорно-двигательной системы мониторинга активности
- Система мониторинга включает в себя множество пунктов оборудования, такого как специальные устройства контроля, охраны окружающей инкубаторы, которые имеют потенциал для суточного управления светом, устройств сбора данных, компьютеров и периферийного материалов, таких как проводку для подключения устройств мониторинга для сбора данных устройств (рис. 2). Инструкция по установке Мониторинг дрозофилы активность (DAM) системы сбора данных обеспечивается производителем (Trikinetics Inc.)
- Для дома опорно-двигательной системы мониторинга деятельности, выбрать хорошо проветриваемом помещении, предпочтительно оборудован системой контроля температуры, быть посвященной фотолаборатории. При всех электрических систем, участвующих (например, компьютер и бизнес-инкубаторов), работающих в течение длительного периода времени, в течение малого и ограничивается комнате, перегрева могут быть сгенерированы, ведущих к быстрому росту температуры в помещении. Следовательно, инкубаторы будут обременены дополнительной нагрузкой для поддержания температуры и более вероятно потерпеть неудачу в регулирование температуры. Мы считаем, что даже для хорошо проветриваемых помещениях, переход от кондиционера летом, чтобы тепло в осень / зима может сделать это трудно поддерживать комнатной температуре. В таких случаях дополнительная вентиляция, возможно, придется быть установлена в темной комнате, чтобы уменьшить риск перегрева. Кроме того, лучше отключить инкубаторы, которые не используются, чтобы минимизировать производство ненужных тепла.
- Печать комнату от внешних источников света. Вход может быть блокирована с вращающейся дверью или черным занавесом. Мы предпочитаем вращающуюся дверь, как это сводит к минимуму шансы нежелательного света, попадающие в темной комнате. Внутри темной комнате, это не нужно работать в полном неведении, как плодовых мушек циркадные системы не чувствительны к инфракрасному свету (и гораздо менее чувствителен к красному свету по сравнению с зеленый / синий свет). В случаях, когда мы должны видеть в темной комнате, но хотите сохранить общий темноте (например, быстро удаление или добавление устройства контроля в инкубатор, который находится в его темные фазы), мы просто используем стандартные фонарик, который покрыт красным фильтр. Альтернативно или в дополнение, если в вашей фотолаборатории есть лампы дневного света, покройте их красной фильтровальной бумаге или автономных накаливания стол свет покрытые такими фильтровальную бумагу. Очень маловероятно, что разоблачение мухи в темноте, чтобы очень кратко экспозициями (несколько секунд) красного света будет влиять на их циркадные часы. Кроме того, хотя циркадные системы дрозофилы очень чувствителен к видимому свету, мы не думаем, небольшие скрипы света в темной комнате будет косвенные, во всяком случае, хорошей практикой является сохранение инкубатор двери этого дома мониторов открыт только когда необходимо. Кроме того, только открыть один инкубатор в то время, так как это позволит свести к минимуму возможность инкубатор на его темные фазы, под действием света из инкубатора на свет фазу.
- Покупка бесперебойного питания (ИБП) чрезвычайные резервного питания, что имеет достаточно мощности мощности для питания компонентов системы мониторинга деятельности в случае перенапряжения, шип, или сбоем питания в здании. Подключение резервных ИБП аварийная установка в цепь чрезвычайных резервную копию, если он имеется. Помните, что даже если ваше оборудование подключено к розетке чрезвычайных во время отключения электроэнергии не может быть короткого переходного периода, как система переключается на аварийный источник. Во время этого перехода, потери мощности даже на несколько секунд может привести к компьютерам выключение и свет в инкубаторе выключения. Таким образом, важно, чтобы компьютеры используются для сбора данных о деятельности и системы управления свет в инкубатор не только подключили в аварийный власти, но и ИБП. Если система управления освещением в инкубаторе напрямую не регулируется инкубатор (в большинстве случаев это так), то достаточно, чтобы включить в инкубаторе появляютсяNCY власти без ИБП, так как потери мощности в течение нескольких секунд не повлияет температуры в камере. Обратите внимание, что в целом ИБП только сохранить ваше оборудование работает в течение 5-30 мин в отсутствие власти, ее главной целью является защита от временной потери мощности при переходе от регулярного к аварийного электроснабжения.
- Настройка компьютера PC или Macintosh, полностью предназначенный для сбора данных и / или для управления светом из инкубаторов. С DAM системы будет работать все время, и без присмотра, рекомендуется, чтобы этот компьютер с минимальным установленным программным обеспечением, желательно без помощи сетевого подключения, чтобы минимизировать риск сбоев. Кроме того, система нуждается в переносное устройство для хранения данных, например, почтовый диск, CD / DVD-писатель, или USB, для обеспечения загрузки данных, собранных для последующего анализа.
- Вручную организовать сеть телефонной линии аккуратно вокруг стеллажей из экологически контролируемых инкубаторы, чтобы простота подключения / отключения деятельности мониторов. Стандартные телефонные линии, адаптеры и разветвители можно приобрести в коммерческих электронных магазинов и используется. Настройка нескольких телефонных линий в таким образом, что они будут сходиться в одну магистраль и продлить из инкубатора для подключения к компьютеру.
- Подключение устройства контроля внутри инкубатора к компьютеру через интерфейс блока питания (он же синий ящик из Trikinetics Inc), которая служит для питания Activity Monitor (Trikinetics Inc) через телефонную линию. Этот интерфейс блок питания также действует как интерфейс для передачи данных переход от телефонной линии для USB-кабеля. Дополнительный контроллер свет в тех же единицах, в которых шнур питания линии в системе свет инкубатор может быть подключен к, доступно, чтобы контроль циркадных график освещения инкубатор через компьютер.
- Маска возможных источников света от светодиодных электронных устройств или неправильно печать инкубатор дверь с лентой уткой или черной тканью, чтобы обеспечить автономный ритм измеряется в отсутствие нежелательного света.
2. Подготовка экспериментальных животных
- Поведенческие фенотипы у плодовых мушек, таких как циркадный ритмичность и сна / отдыха деятельности очень чувствительны к генотипической и возрастные различия подопытных животных (Koh и соавт. 2006). Поэтому, крайне важно, чтобы оценить эти фенотипы при сварке контрольных животных, выращиваемые в тех же условиях и того же возраста. Кроме того, существует половой диморфизм в циркадных ритмичность (Хелфриха-Фостер, 2000). Общая практика заключается в использовании взрослых мужчин мух, которые выращиваются в 25 ° С и от 1 до 5 дней стар для опорно-двигательного анализов деятельности. Мужской мухи вместо самок традиционно используется, потому что откладки яиц деятельность повлияет на истинное измерение двигательной активности. Из-за половой диморфизм, иногда опробование самок может быть информативной. Продовольственная, состоящий из просто 5% сахарозы и 2% Бакто агар помешает яйца без девственной женщин из развивающихся стран и движения вылупившихся личинок из вызывающих ошибочные рассчитывает деятельности. Кроме того, девственные самок можно использовать хотя могут быть различия в активности между профилями вязка и девственных самок (Хелфриха-Форстер, J. Biol. Ритмы 2000).
- При рассмотрении циркадные и сна / отдыха параметров конкретного мутанта мухи интересов, это разумно ауткросс мутант акции с диким штаммом же генетический фон, например, w1118 или уш. Это приведет к удалению второй сайт генетических модификаторов, которые могут потенциально маски циркадных или сна / отдыха фенотипа. Поскольку не существует кроссинговера у дрозофилы мужчин, лучше выполнять ауткросс путем скрещивания мутанта самок с диким типом мужчин. Штамма дикого типа будет также служить в качестве надлежащего контроля за экспериментом. Семенной как дикого типа контроля и мутанта мухи в то же время в стандартных дрозофилы пищи примерно от 10 до 14 дней до эксперимента ритм двигательной активности (см. Блумингтон дрозофилы сток центр для пищевой рецепт; http://flystocks.bio.indiana.edu /). По eclosion потомства, сбор от 1 до 5 дней самцов мух и отложите их для использования в экспериментах.
- С многочисленных генетических инструментов и ресурсов, таких как избыточная экспрессия, РНК-интерференции, а тканеспецифические GAL4 водитель летать линий, доступных из различных центров акции по всему миру, можно анализировать последствия гиперэкспрессией или стучать вниз специфических генов в ткани и временных конкретных образом (марка и Perrimon 1993 года; McGuire и др., 2004;.. Остервальдер и др. 2001). Чтобы изучить циркадные и сна / отдыха параметры, используя этот подход, мух проведения трансгенные конструкции с тканью или конкретной наркотиками индуцибельной GAL4 драйверов (например, мужчины) пересекаются с мухами проведения трансгенных конструкций с целевыми генами прилагается к UAS ответчика (например, девственные самки) около 14 дней до начала двигательной активностиэкспериментов. По eclosion потомства, сбор от 1 до 5 дней самцов мух и отложите их для использования в экспериментах. Родительских линий, используемых для кросс которые обычно используются в качестве контрольных для экспериментов. Потомство от скрещивания UAS ответчика и водитель GAL4 линий с дикими мухи типа того же генетического фона также соответствующие элементы управления.
- Как указано в шагах (2) и (3), время, необходимое для подготовки экспериментальных животных сильно варьирует в зависимости от характера и дизайн эксперимента. В случае, когда трансгенные животные должны быть получены или если пересечения схемы должны быть выполнены, больше времени, очевидно, будет необходимо. Для материально-техническим причинам, она занимает около 14 дней при 25 ° С для дрозофилы развиваться из яиц взрослых мух.
3. Подготовка активность трубы
- Активность трубы представляют летать обитания в ходе эксперимента. Они представляют собой тонкие (около 5 мм в диаметре; отметить, Trikinetics предлагает различные размеры в зависимости от вида Drosophila быть проанализированы) 5 мм стеклянных трубок, которые содержат вещества пищи на одном конце и подключен с пряжей или пластиковой заглушкой на другом конце. Так как стеклянные трубки деятельности могут быть использованы несколько раз, мы расскажем о подготовке процедуры с помощью использовали / неочищенных труб деятельности от предыдущих экспериментов в качестве отправной точки. Если вы используете новые трубы деятельности, просто перейдите к шагу (11).
- Желательно использовать деятельности трубки, которые только что сделали с пищей внутрь трубы имеет тенденцию высыхать и загрязняется с грибами сверхурочно, даже при условии хранения при 4 ° C. Они, как правило, подготовлены несколько дней, чтобы за неделю до начала эксперимента. Поэтому важно оценить количество труб, необходимых для каждого эксперимента, прежде чем их подготовки.
- Удалите заглушки (пряжи или пластиковой заглушкой) от используемых труб деятельности и положить их в большом стакане стекла. Трубы должны только заполнить до половины стакана. Заполните стакан с водопроводной водой, убедившись, что погружаться труб.
- Микроволновая стакан заполнен стеклянных трубок, пока вода не доходит до полного быстрого кипения, чтобы расплавить воск и агар питания.
- Будьте осторожны, что вода горячая. Снимите стакан с микроволновой печью и перемешать труб с пластиковым шпателем или 10 мл пипетки, чтобы ловушке воска, чтобы всплыть на вершину. Затем повторите шаг (4).
- Снимите стакан с микроволновой печью и ждать, пока она остынет. Ввод в стакане холодной комнате (если она имеется) позволит ускорить процесс.
- Когда вода остынет, воск будет собирать на поверхности воды и постепенно затвердевает. Просто удалите затвердевшим воском вручную. Это должно избавиться от большей части воска на трубах.
- Передача активности труб, чтобы новый стакан со свежей водопроводной водой и повторите шаги (4) и (5).
- Поскольку большинство из воска была удалена в шаге (7), не стоит ждать воска укрепить. Просто налейте воду из стакана и передачи трубы в другой новый стакан. Будьте осторожны, что вода по-прежнему жарко.
- Повторите шаги (4) и (5) в последний раз. Вылейте воду из стакана и ждать активности труб, чтобы остыть.
- Загружать их по вертикали на 250 мл или 500 мл стеклянные стаканы. Убедитесь, что они не слишком плотно упакованы. Стерилизовать их с помощью автоклава с сухой цикл, или просто использовать сушильный шкаф для сушки труб.
- Отдельно, для приготовления пищи для загрузки в деятельности трубы, сделать раствор, содержащий 5% сахарозы (Sigma) и 2% Бакто агар (BD) в дистиллированной воде или водопроводную воду. Автоклав для стерилизации решение. Автоклавного пищи можно использовать сразу или хранить в 4 ° С в течение длительного периода времени. Как только пища застывает, один будет необходимо микроволновой печью и сжижать его для того, чтобы заполнить трубы. Неиспользованные порции пищи могут быть сохранены и использованы на более поздний срок.
- Пищи в идеале должно быть около 65 ° C при использовании для заполнения активности труб. Если она слишком горячая, слишком много конденсата будет накапливаться внутри труб. Если это не достаточно горячо, питание укрепят до трубы равномерно заполнены. Чтобы заполнить активности труб с пищей, использовать 10 мл пипеткой пипетки жидкий раствор пищи по внутренней стенке стеклянный стакан, позволяя пищу решение заполнить деятельности трубку снизу вверх, пока труб на треть заполненный с решением. Swirl стакан вокруг осторожно, чтобы убедиться, что все трубы, особенно те, в середине стакана, равномерно заполнен пищей решение. Подождите, пока пища укрепить полностью либо при комнатной температуре или 4 ° C. Переходите к следующему шагу раз конденсата внутри стеклянных трубок рассеиваться.
- Для удаления активности труб из стакана, нажмите трубы на дно стакана и поворот трубы в то же время так, чтобы затвердевшей пищи внутри трубы и нижнейстакана будут разделены. Возьмите трубы из стакана, предпочтительно в виде одной связке.
- Чистая трубы один за другим с бумажными полотенцами, чтобы удалить лишнюю еду на наружной поверхности труб. Установите трубы в сторону в чистую емкость.
- Возьмите общее нагревателя блока лабораторию без держателя трубки и крышки нагревательного колодца тщательно несколькими слоями сильный алюминиевой фольги. Добавить парафин (воск) гранул в алюминиевой подкладкой отопления и таять.
- Держите труб на непродовольственные конец и погрузите пищи конец в расплавленный воск. Dip вощеная часть в стеклянный стакан, заполненный холодной водой для ускорения затвердевания воска. Повторите еще раз. Погружение воском труб в воду будет препятствовать трубы от слипания.
- Трубы могут быть использованы сразу же, или хранится в герметичном контейнере при температуре 4 ° C для использования в течение недели. Длительное хранение приведет к чрезмерному высыханию пищи. Если трубы хранить при температуре 4 ° С, удостоверьтесь, чтобы согреть их до температуры окружающей среды, оставляя их на скамью верхней перед использованием.
4. Загрузка влетает в активность Трубы и опорно-двигательной системы мониторинга активности
- Перед загрузкой летит в деятельности труб, включите инкубатора, который будет использоваться для размещения деятельности мониторов. Отрегулируйте температуру с помощью инкубатора управления и набора светлый / темный режима использования света DAM контроллер системы или инкубаторов собственный свет система управления в зависимости от желаемого эксперимента. Время, необходимое для загрузки летит в деятельности труб должно быть достаточно для стабилизации температуры.
- Обезболить мух с углекислым газом.
- Использование тонкой кистью, чтобы мягко передачи одного летать в деятельности трубки.
- Захватите середине цельного куска пряжи, что составляет около половины дюйма с мелкими щипцы и вставьте пряжи в непродовольственных конце активности трубки для подключения открытия и предотвратить летать от побега во время эксперимента, и в то же время позволяя воздушного потока в трубе. Кроме того, пластиковые колпачки с небольшими отверстиями (Trikinetics, Inc) может быть использован, чтобы закрыть отверстие.
- Убедитесь, что трубы укладывают на бок, пока летают просыпается, либо существует риск летать застрять в пищу.
- Вставьте трубки в деятельности мониторов. С новым, более компактные модели Trikinetics мониторов (Trikinetics DAM2 и DAM2-7), необходимо провести трубы в месте с резинками, чтобы инфракрасный луч проходит труба в центральное положение.
- Положите деятельности мониторов в инкубаторы и подключить их к системе сбора данных по телефонным проводам. Проверьте с помощью коллекции DAM системного программного обеспечения, чтобы убедиться, все мониторы подключены правильно и данные собираются от каждого из них. Монитор излучает инфракрасный луч по центру каждой трубы деятельности стекла. Двигательную активность мух, отражаются как сырые двоичные данные, где "один" записывается каждый раз инфракрасный луч, порвана или 'ноль' записывается в которой инфракрасный луч не нарушена.
5. Опытное конструкторское для записи данных для определения Циркадные Периодичность и амплитуда
- Мухи синхронизированы и увлеченные, выставляя их в нужное светлый / темный (LD) и температурный режим в течение 2-5 суток. Наиболее часто используемые увлечения условие светлый / темный цикл 12 часов света / 12 часов темного (12:12 LD) при 25 ° C. Это общепринятый стандарт состояние в основном базируется на мысли, что дрозофилы происходит от афро-экваториальных районах. При изучении циркадных ритмов есть некоторые фразеологии, что нужно, чтобы ознакомиться с. Относится к этому протоколу, время, когда гаснет свет на в инкубаторе определяется как zeitgeber время 0 (ZT0), а все остальное время являются относительными к этому значению (например, в 12:12 LD цикла, ZT12 это время, когда огни были выключены). При стандартных условиях 12:12 Л.Д., дикого типа дрозофилы обычно имеют два боя деятельности; одна вокруг ZT0 называется "утро" пик, а другой вокруг ZT12 называется пик "вечер" (рис. 3А). Утром и вечером приступы находятся под контролем эндогенных часы, но Есть также "испуга" ответы, которые преходящи всплески активности в ответ на светлые / темные переходы. Два дня увлечения является минимальным и может быть использовано, например, в больших экранов, которые отнимают много времени и направлена на измерительный автономный периодов в постоянной темноте (см. ниже, п. 2). Однако, если вы заинтересованы в изучении деятельности шаблоны во время дневной свет, темные цикла, предпочтительнее сохранить мухи в течение 4-5 дней в LD, чтобы получить больше данных. По сути, увеличение числа мух или количество дней, LD, в конечном счете данных (например, бассейн данных за последние двадней до полного двигательной активности LD) будет генерировать более надежные суточный профиль деятельности и измерений (например, время пика утром или вечером). Кроме того, ежедневное распределение активности варьируется в зависимости от длины дня (фотопериод) и температуры. Основной причиной для изменения светового дня и температуры от стандарта, если один хочет учиться как повседневной деятельности модели проходят сезонные адаптации (например, Чен и др. 2007). Дрозофилы может быть также увлекается ежедневных циклов температуры (например, Glaser и Stanewsky 2005. Sehadova и соавт. 2009). Температура циклов, которые отличаются лишь 2-3 ° С достаточно для ритмы увлекают деятельности.
- Свободный ход ритмов двигательной активности измеряются под постоянным темно и температурных условиях после увлекая за период закончится (см. выше, п. 1). Установка для световой цикл может быть изменен в любое время в темной фазы на последний день LD, что последующий день эксперимент представляет первый день DD. Семь дней сбора данных DD достаточно вычислить циркадный период и амплитуды (например, власть или сила ритма) мух. В целом, объем выборки по крайней мере 16 мух, необходимых для получения надежных автономный периодов для конкретного генотипа. Даже если вы заинтересованы только в измерении дневной активностью, он все еще лучший для измерения мух автономный периодов в ДД, как изменения в эндогенных период может изменить суточное распределение активности в LD. Например, мухи с длинными периодами эндогенных обычно обладают задержкой пика вечером в LD (см., например, рисунок 4).
- По завершении эксперимента, необработанные двоичные данные собраны с помощью программного обеспечения DAM Система загружается на портативное устройство хранения данных, например, USB-ключ.
- Необработанные двоичные данные обрабатываются с помощью DAM Filescan102X (Trikinetics, Inc) и суммируются на 15 и 30 минуты бункеров при анализе циркадных параметров, или от 1 до 5 бункеров минуту при анализе сна / отдыха параметров. В настоящее время пять смежных минут бездействия является стандартной четкости сна / отдыха у дрозофилы (Хендрикс и др., 2000;. Хо и Сегал 2005).
- Есть много различных способов анализа данных, собранных на DAM системы, но мы только предоставляем те методы, которые обычно используются в нашей лаборатории. Microsoft Excel используется для назначения генотипа к разным группам образца. FaasX программного обеспечения (М. Boudinot и Ф. Rouyer, Национальный центр La Recherche научное, Gif-сюр-Иветт Cedex, Франция) или Insomniac (Matlab-программы; Лесли Ashmore, Университет Питтсбурга, Пенсильвания) используются для изучения циркадных ( например, период и власти) или сна / отдыха (например, процент сна, означает остальные бой длина) параметров соответственно.
6. Представитель Результаты
По завершении этого протокола, можно использовать тот же набор данных, чтобы рассмотреть как циркадный и спать параметры экспериментальных животных в связи с контрольными животными.
Анализ циркадных параметров: Образование графики, иллюстрирующие повседневную деятельность опорно-двигательного или среднее деятельности мух в течение нескольких дней в LD или ДД условия могут быть созданы с помощью FaasX (рис. 3) дрозофилы обычно имеют два боя деятельности; одна вокруг ZT0 (или КТ. ) называется "утро" пик, а другой вокруг ZT12 (КТ 12) называется "вечерний" пик. Эти два боя деятельности контролируются эндогенным часы, и даже может наблюдаться в автономном условиях DD (рис. 3В). Изменения в сроках этих пиков активности легко наблюдать в образовании графики и может указывать на изменение свойств эндогенных часы. Еще одно свойство, что свидетельствует о нормальной работы часов упреждающий увеличение двигательной активности наблюдается в циклах Л. Д., который происходит до фактического темно-свет или светло-до темно-переходы (рис. 3А, стрелки). Такое поведение отчетливо наблюдается у диких мух типа (рис. 3А), но отсутствует в аритмической мутанты, такие как в 0 (рис. 3C) (Конопка и Бензер, PNAS, 1971). В случае в 0 мутантов, наблюдается "утро" и "вечер" пиков в LD чисто поразить ответы из-за резких изменений в свет / темно условиях (т.е. "clockless" мухи не ожидаем изменений в окружающей среде, а лишь реагируют на них ). Потери поведенческой ритмичность гораздо более выражены в ДД и в целом проявляется в полной потере утренние или вечерние пики двигательной активности (то есть случайные приступы активности и бездействия), как видно по 0 мухи (рис. 3D). В дополнение к образованию графики, опорно-двигательного данных о деятельности можно представить в виде двойной сюжет актограммы (FaasX), где два дня данные наносятся последовательно на каждой линии, но профиля последний день начинается следующая строка два дня стоит деятельности (рис. 4). Например, LD1 и 2 построены на первой линии тон актограммы. Следующая строка начинается с повторения LD2 и сопровождается LD3 и так далее. После этого формата, опорно-двигательного данных о деятельности, охватывающих весь эксперимент показан на актограммы. Actograms могут быть построены для каждого человека летать, либо за каждый летать генотипа. Одним из преимуществ actograms над образованием графы в том, что изменение длины периода суточных ритмов активности легко наблюдаемой (рис. 4). Кроме создания графиков и образования actograms, опорно-двигательного данных о деятельности из условия ДД могут быть представлены FaasX рассчитать продолжительность периода с помощью ряда различных программ, в том числе цикл-П.
Анализ сна / отдыха параметры: Используя современное определение сна / отдыха у дрозофилы (Хендрикс и др., 2000.), Что в пять смежных минут бездействия, можно проанализировать данные, записанные с опорно-двигательной активности анализов и исследовать несколько параметров сна использованием Insomniac (Л. Ashmore), Matlab-программы. Процент времени, который летит тратить сна может быть вычислена через разные промежутки времени, например, процентов сна каждый час (рис. 5А), или 12 часов (рис. 5B). Другие, более общие сна параметры, которые могут быть рассмотрены включают означает остальной бой длины (рис. 5С) и разбудить активность счет (рис. 5D). Среднее сна / отдыха бой длина мера того, насколько консолидированной сон и можно проиллюстрировать качество сна. Wake деятельности, как следует из названия, является мерой активности ставку, когда мухи проснулись. Этот параметр помогает различать мух, которые действительно пострадавших во время сна / отдыха поведения по сравнению с теми, которые или больны или гиперактивный. Например, мухи, которые просто больной может показаться, что спать больше, потому что они не столь мобильны. Для этих мух, их разбудить активность будет ниже по сравнению с контрольными животными.
Рисунок 1: Блок-схема с изложением основных шагов для опробования опорно-двигательного ритмов активности в дрозофилы процедуры представлены слева, а полезные комментарии предоставляются на праве.. Количество времени, необходимое для выполнения необходимых кресты и генетических манипуляций получить мух генотип права для конкретных экспериментов варьируется в зависимости от характера и дизайн эксперимента. Два шага, отмеченные звездочкой (*) обеспечивают сроки, когда взрослые мухи должны быть посеяны / вязка для генерации потомства соответствующего возраста (от 1 до 5 дней) для эксперимента.
Рисунок 2: Схема иллюстрирует связь между различными компонентами для дрозофилы двигательную активность сбор данных с использованием системы DAM выделенный компьютер используется для записи двигательной активности пунктам дрозофилы.. Активность мониторы размещены внутри инкубатора оснащены температуры и освещения (вкл / выкл) контроля. Компьютер может быть также использован для управления временем света вкл / выкл в инкубаторах, если источник питания системы освещения может быть подключен к блоку питания (опционально). Связь между компьютером и деятельности мониторов / инкубаторы находятся в ведении интерфейсного блока питания. Компьютер, блок питания и бизнес-инкубаторов (в случае управления освещением не зависит от компьютера) подключаются к электросети через UPC обеспечить непрерывный мониторинг деятельности и непрерывного освещения во время легкой фазы. Рекомендуется, чтобы соединить все электрические приборы в чрезвычайных резервных схем в объекте, если таковые имеются.
Рисунок 3. Образование графы генерируется с использованием FaasX показывает ежедневный ритм двигательной активности ритмических диких мух типа (0 Вт на мух проведения в трансгенов +) (А и В) по сравнению с аритмической Вт на 0 мутантов (С и D) Мужской мухи были сохранены при 25 ° С и увлеченные течение 4 дней в 12:12 LD (свет: темно) циклов и семь дней в DD (постоянная темнота). Для каждого шнура, опорно-двигательного уровни активности отдельных мух (п> 32) были измерены в 15-минутной бункеров и затем усредняются для получения репрезентативной группы профиль для этой линии. А и С показывают активность данных, полученных при усреднении второй и третий день в свет / темно цикла (Л. Д. 2-3) в то время как B и D показывают активность данных, полученных при усреднении второй и третий дни в постоянном темноте (DD 2-3 ). Вертикальные столбики представляют собой деятельность (в условных единицах), записанные в 15-минутной бункеров в течение светового периода (светло-серый) или темный период (темно-серый). Горизонтальные полосы в нижней части графы LD образования; белый, свет, черный, свет выключен. ZT0 и ZT12 представляют начала и конца светового дня соответственно. Для ДД образования графиков; а0 и CT12 ReprESENT начале и в конце субъективных день в постоянной темноте, обозначаемый в сером. В панели, М = утренний пик; E = вечером пик. Стрелки на панели представляют собой упреждающий поведение утренние и вечерние пики наблюдались в диких мух типа, которые отсутствуют в Вт на 0 аритмической мух.
Рисунок 4:. Дважды участок актограммы генерируется с использованием программного обеспечения FaasX иллюстрирующие опорно-двигательного данные активности мух дикого типа, короткие, или длительного периода Мужской мухи хранились при температуре 25 ° С и вовлеченного в течение 4 дней в 12:12 циклов Л. следуют восемь дней в постоянной темноте (DD) для расчета автономный период (т) с использованием цикла-P в FaasX. Три летать линий с дикими период типа [Вт на 0, в +; по 0 мутант проведения в + трансгенов], длительный период [Вт на 0, в (S47A); по 0 мутант проведения в (S47A) трансгенов], и короткий период [со за 0, в (S47D); по 0 мутант проведения в (S47D) трансгенов] показано здесь (Chiu и др. 2008.). X-ось представляет ZT или КТ время в LD или ДД соответственно, а Y-ось представляет количественными показателями деятельности (в произвольных единицах) подведены в 15-минутной бункеров. Красной пунктирной линии соединяют вечером пики за каждый день экспериментов. Обратите внимание, что во время LD вечером пик «вынуждены» сохранить синхронно с 24-часового цикла Л.Д., тогда как в DD автономный период может отклоняться с 24 час. Например, для мух с короткими периодами времени вечером деятельности будет происходить раньше на каждый последующий день в DD (когда заговор против 24 масштабе времени час, как показано на рисунке), тогда как сдвиг вправо наблюдается для мух с длинными периоды.
. Рисунок 5: Количественная сна параметров в дрозофилы Мухи (Canton-S, CS) подвергались стандартного цикла 12:12 LD при 25 ° C. Insomniac (Л. Ashmore) был использован для обработки данных и Microsoft Excel был использован для создания диаграмм показано здесь. По меньшей мере 70 мух были объединены для получения группы средних и погрешности (стандартная ошибка среднего) показано на рисунке. () Базовый сна рассчитывается каждый час; показана представитель суточного цикла. (B) Базовый сон представитель суточного цикла рассчитывается каждые 12 часов. (C) Средняя продолжительность каждого боя остальные рассчитываются в 12-часовом шагом. (D) Курсы пробуждения активности рассчитывается каждые 12 часов.
Discussion
В этом протоколе были описаны процедуры для измерения дрозофилы двигательную активность ритмы, надежных поведенческих выход летать циркадных часов, который используется как стандартный отсчет часов функцию. Этот анализ был использован в крупных экранов для новых мутантов часы (например, Конопка и Бензер 1971;. Dubruille и др. 2009) и постоянно используется для вскрыть и понять функции часов в естественных условиях. Он также был использован для изучения цикла сна разбудить у мух, даже несмотря на недавние сообщения предполагают, что видео цифровой анализ является гораздо более надежным в количественном сна, чем с помощью ритмов двигательной активности (Zimmerman и соавт. 2008). При использовании опорно-двигательного ритмы активности, чтобы проанализировать сон, процент сна в дневное время, как правило, завышены.
Для обеспечения успеха и воспроизводимость этого протокола, она имеет решающее значение для анализа мух, которые сходны по возрасту, генетический фон, и вырос на тех же условиях, как поведенческие фенотипы у плодовых мушек, таких как циркадный ритмичность и сна / отдыха деятельности очень чувствительны на все эти факторы. При использовании нескольких инкубаторов для одного эксперимента, важно убедиться, что все инкубаторы при ожидаемой температуре, так как некоторые циркадных параметров может меняться в зависимости от температуры. Одно слово предостережения, когда рассматриваете покупку инкубаторов для работы с мухами, не все люди созданы равными. Хотя мы не решаемся рекомендовать какой-либо конкретной единицы Есть много вариантов. Хороший ресурс для поиска компаний, которые продают инкубаторы для работы дрозофилы предоставляется в <www.flybase.org>. Некоторые компании даже продают "дрозофилы циркадный" инкубаторы, в которых дополнительные функции, такие, как уже проводной для системы Trikinetics и температуры наращивает (например, Tritech). Важные функции включают возможность для суточного управления светом и хороший контроль температуры в диапазоне физиологических дрозофилы (~ 15-30 ° C). Цены и размеры инкубатора очень сильно варьируются, но с новыми деятельности наблюдателей из Trikinetics, даже небольшие инкубаторы могут разместиться целый ряд этих устройств. Кроме того, хотя инкубаторы с контролем влажности могут быть использованы, это дополнительная функция не нужна, если вы размещаете небольшую кастрюлю с водой, чтобы обеспечить влажность (50-70% это хорошо). Наконец, хотя мы обычно используем FaasX и Insomniac для анализа данных в этом протоколе, Есть альтернативные программы и программное обеспечение доступно (Rosato и Kyriacou 2006), например, ClockLab (ActiMetrics), Брандейс Ритм пакет (Д. Уилер, Бейлор медицинский колледж, Хьюстон ) и МАЗ (Zordan и соавт. 2007).
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами NIH NIH34958 И. Е и NS061952 для JC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila activity monitor (DAM) | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | DAM2 or DAM5 | DAM2 monitors are more compact, and more can fit into a single incubator |
| Power supply interface unit (for DAM system) | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | PSIU9 | Includes PS9-1 AC Power Supply |
| Light controller | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | LC6 | |
| Pyrex glass tubes | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | PGT5, PGT7, and PGT10 | |
| Plastic activity tube caps | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | CAP5 | Yarn can be used instead of plastic caps. |
| DAM System data collection software | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | Versions available for both Mac and PC | |
| FaasX software | Centre National de la Recherche Scientifique | Only for Mac | |
| Insomniac 2.0 software | University of Pittsburgh School of Medicine | Runs on Matlab. Can be used on both PC and Macintosh. | |
| Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. Percival incubator | Percival Scientific, Inc. | I-30BLL | Interior space dimension:Width: 65cm;Height: 86cm;Depth: 55cm |
| Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. DigiTherm Heating/Cooling Incubator with Circadian Timed Lighting and Timed Temperature | Tritech Research, Inc. | 05DT2CIRC001 | Interior space dimension:Width: 36m;Height: 56m;Depth: 28cm |
| APC Smart-UPS 2200VA 120V (Emergency power backup unit) | APC | SU2200NET | Output Power Capacity of 1600 Watts |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| TissuePrep Paraffin pellets | Fisher Scientific | T565 | Melting point 56°C-57°C |
| Block heater | VWR international | 12621-014 |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Chen, W. F., Low, K. H., Lim, C., Edery, I. Thermosensitive splicing of a clock gene and seasonal adaptation. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 72, 599-606 (2007).
- Chiu, J. C., Vanselow, J. T., Kramer, A., Edery, I. The phospho-occupancy of an atypical SLIMB-binding site on PERIOD that is phosphorylated by DOUBLETIME controls the pace of the clock. Genes Dev. 22, 1758-1772 (2008).
- Dubruille, R., Murad, A., Rosbash, M., Emery, P. A constant light-genetic screen identifies KISMET as a regulator of circadian photoresponses. PLoS Genet. 12, e1000787-e1000787 (2009).
- Glaser, F. T., Stanewsky, R. Temperature synchronization of the Drosophila circadian clock. Curr Biol. 15, 1352-1363 (2005).
- Helfrich-Förster, C. Differential control of morning and evening components in the activity rhythm of Drosophila melanogaster- sex-specific differences suggest a different quality of activity. J Biol Rhythms. 15, 135-154 (2000).
- Hendricks, J. C., Finn, S. M., Pancleri, K. A., Chavkin, J., Williams, J., Sehgal, A., Pack, A. I. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25, 129-138 (2000).
- Ho, K. S., Sehgal, A. Drosophila melanogaster: an insect model for fundamental studies of sleep. Methods Enzymol. 393, 772-793 (2005).
- Koh, K., Evans, J. M., Hendricks, J. C., Sehgal, A. A Drosophila model for age-associated changes in sleep: wake cycles. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 13843-13847 (2006).
- Konopka, R. J., Benzer, S. Clock mutants of Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci USA. 68, 2112-2116 (1971).
- McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends Genet. 20, 384-391 (2004).
- Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. A conditional tissue-specific transgene expression system using inducible GAL4. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12596-12601 (2001).
- Rosato, E., Kyriacou, C. P. Analysis of locomotor activity rhythms in Drosophila. Nature Protocols. 1, 559-568 (2006).
- Sehadova, H., Glaser, F. T., Gentile, C., Simoni, A., Giesecke, A., Albert, J. T., Stanewsky, R. Temperature entrainment of Drosophila's circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain. Neuron. 64, 251-266 (2009).
- Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. A video method to study Drosophila sleep. Sleep. 31, 1587-1598 (2008).
- Zordan, M. A., Benna, C., Mazzotta, G. Monitoring and analyzing Drosophila circadian locomotor activity. In Circadian Rhythms Methods and Protocols. Rosato, E. , Methods in Molecular Biology series. Humana. Totowa, New Jersey. (2007).
