Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Assaying פעילות של תנועה כדי ללמוד בקצב היממה ושינה פרמטרים תסיסנית Published: September 28, 2010 doi: 10.3791/2157
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1,3, 1,3
1Center for Advanced Biotechnology and Medicine, Rutgers University, 2Current Address: Department of Entomology, College of Agricultural and Environmental Sciences, University of California, Davis, 3Department of Molecular Biology and Biochemistry, Rutgers University

Summary

אנו מתארים נוהלי רישום פעילות של תנועה יומי של מקצבים

Abstract

צורות חיים רוב התערוכה מקצבים יומיים, תופעות פיזיולוגיות והתנהגותיות הסלולר כי הם מונעים על ידי היממה אנדוגני (≡ 24 שעות) קוצבי לב או שעונים. תקלות במערכת היממה האדם קשורים מחלות או הפרעות רבות. התקדמות רבה לקראת להבנת המנגנונים מקצבי היממה התפתחה מתוך מסכי הגנטי שלפיו נמדד קצב התנהגותיים בקלות משמש מחוץ לקרוא תפקוד השעון. מחקרים באמצעות תסיסנית הפכו תרומות הזרע להבנת הבסיסים סלולריות ביוכימי הבסיסית מקצבי היממה. התנהגות היממה תקן נמדד לקריאה החוצה תסיסנית פעילות של תנועה. ככלל, מערכת ניטור כוללת התקנים שתוכננו במיוחד כי ניתן למדוד את התנועה של תנועה של תסיסנית. מכשירים אלו הם שוכנו חממות שבשליטת לסביבה הממוקם בחדר חושך והם מבוססים על שימוש הפרעה של קרן אור אינפרא אדום כדי להקליט את הפעילות של תנועה של זבובים בודדים הכלול בתוך שפופרות קטנות. כאשר בהסתכלות ימים רבים, תסיסנית התערוכה מחזורים יומיים של פעילות וחוסר פעילות, קצב התנהגות נשלטת על ידי מערכת היממה אנדוגני של החיה. ההליך הכולל הופשטה עם כניסתו של זמינים מסחרית פעילות של תנועה מכשירי ניטור ופיתוח של תוכנות לניתוח נתונים. אנו משתמשים במערכת של Trikinetics בע"מ, המהווה את ההליך המתואר כאן, היא כיום השיטה הפופולרית ביותר בשימוש ברחבי העולם. לאחרונה, מכשירי הניטור זהה שימשו כדי ללמוד את ההתנהגות לישון תסיסנית. מכיוון יומי התעוררות לישון מחזורים של זבובים רבים ניתן למדוד בו זמנית רק 1-2 שבועות בשווי של נתוני פעילות רציפה של תנועה בדרך כלל מספיק, המערכת הזו היא אידיאלית עבור בקנה מידה גדול מסכי לזהות תסיסנית מפגין תכונות היממה או לישון שינה.

Protocol

העיצוב הכולל של הפרוטוקול מתוארת באיור 1. ההתקנה לניטור פעילות של תנועה באמצעות מכשירים שוכנו חממות שבשליטת לסביבה הממוקם בחדר החושך צריך להיות התאספו הראשון. ברגע שזה מסתיים, המערכת יכולה לשמש כל פעילות מדידות עוקבות של תנועה וקצב. עבור כל ניסוי, יש (i) להכין את חיות הניסוי, אשר עשויים לכלול יצירת חיות טרנסגניות או הגדרת חוצה הכרחי, (ii) להכין את פעילות צינורות זכוכית המכיל מקור המזון, (iii) עומס זבובים לתוך צינורות פעילות ולהתחבר המנטרת את פעילות מערכת איסוף הנתונים, וכן (iv) להקליט ולנתח את הנתונים באמצעות תוכנה אחרת, תלוי מה הפרמטרים היממה או לישון אחד לא רוצה לבדוק. בזאת, אנו מגדירים את "התחל" של הניסוי כמו בזמן זבובים מכשירי ניטור נחשפים לראשונה באור הרצוי / תנאי כהה חממות הסביבה.

1. הקמת מערכת ניטור פעילות של תנועה

  1. מערכת הניטור כוללת פריטי ציוד רבים כגון מעקב אחר התקנים מיוחדים, חממות הסביבה, כי יש את היכולת לשלוט באור יומי, התקני איסוף נתונים, מחשבים וחומרים היקפיים כגון חיווט לחיבור מכשירי ניטור של מכשירים לאיסוף נתונים (איור 2). הוראות להתקנת ניטור פעילות תסיסנית (DAM) מערכת איסוף הנתונים סופקו על ידי היצרן (Trikinetics Inc).
  2. לבית מערכת ניטור פעילות של תנועה, לבחור חדר מאוורר היטב, מצויד רצוי עם מערכת בקרת טמפרטורה, להיות החושך ייעודי. עם כל מערכות חשמל מעורב (למשל המחשב חממות) פועל במשך תקופה ארוכה של זמן בתוך חדר קטן, מוגבל, חום גבוה יכול להיווצר המוביל גידול מהיר בטמפרטורה של החדר. כתוצאה מכך, חממות יהיה עמוס עם עומס העבודה הנוסף כדי לשמור על טמפרטורה יותר סיכוי להיכשל בקרת טמפרטורה. אנו מוצאים כי אפילו מאוורר היטב חדרים, המעבר מיזוג אוויר בקיץ לחמם בחורף בסתיו / יכולים לעשות את זה קשה לשמור בטמפרטורת החדר. במקרים כאלה אוורור נוסף עשוי להיות מותקן בחדר חשוך כדי להפחית את הסיכון של התחממות יתר. כמו כן, מומלץ לכבות את החממות שאינן בשימוש כדי לצמצם את ייצור חום מיותר.
  3. חותם את החדר ממקורות אור חיצוניים. כניסה יכול להיות אטום עם דלת מסתובבת או וילון שחור. אנחנו מעדיפים דלת מסתובבת כמו זו מקטינה את הסיכוי של אור לא רצויים להיכנס החושך. בתוך החושך, אין צורך לעבוד לגמרי בחושך כמו זבובי מערכת היממה אינה רגישה אור אינפרא אדום (והוא הרבה פחות רגיש לאור אדום לעומת אור ירוק / כחול). במקרים בהם אנו צריכים לראות בחדר החושך, אבל עדיין רוצה לשמור על החושך הכללי (למשל, במהירות הסרת או הוספת מכשיר ניטור באינקובטור כי הוא בשלב האפל שלה), אנחנו פשוט להשתמש בפנס הרגיל מכוסה אדום המסנן. לחילופין או בנוסף, אם החושך שלך יש נורות ניאון, לכסות אותם בנייר מסנן אדום או אור שולחן עצמאי ליבון מכוסה בנייר מסנן כזה. אין זה סביר כי חשיפת זבובים בחושך חשיפה קצרה מאוד (כמה שניות) של אור אדום ישפיע שעונים היממה שלהם. כמו כן, למרות מערכת היממה של תסיסנית רגיש מאוד האור הנראה, אנחנו לא חושבים חריקות קטנה של אור בתוך החושך יהיה תוצאתי, ובכל מקרה, מנהג טוב הוא לשמור את הדלתות חממה כי מפקחת בית פתוח רק כאשר הצורך. כמו כן, רק לפתוח את אחד חממה בכל פעם כמו זה יהיה למזער את האפשרות של באינקובטור על השלב האפל שנחשף אור באינקובטור על שלב האור שלה.
  4. רכישה Power Supply ללא הפרעות (UPS) חירום גיבוי יחידה שיש לה מספיק יכולת wattage לשלטון את הרכיבים של מערכת ניטור פעילות במקרה של פרץ, ספייק, או הפסקת חשמל בבניין. חבר את יחידת גיבוי UPS חירום למעגל חירום לגיבוי של הבניין אם זמין. שים לב שגם אם הציוד מחובר לשקע חירום במהלך הפסקת חשמל לא יכולה להיות תקופת מעבר קצרה, שכן המערכת עוברת כוח חירום. במהלך המעבר, אובדן כוח אפילו כמה שניות יכול להוביל המחשבים כיבוי האורות ואת החממה להיות כבוי. לכן, חשוב להבטיח כי המחשבים משמשים לאיסוף נתוני הפעילות של מערכת השליטה אורות בחממה לא רק מחוברות לשלטון חירום אלא גם UPS. אם מערכת תאורה השליטה בחממה אינו מוסדר באופן ישיר על ידי החממה (ברוב המקרים זה), אז זה מספיק כדי לחבר את האינקובטור לתוך להגיחכוח ncy ללא UPS, כמו אובדן של כוח במשך כמה שניות לא ישפיע על טמפרטורת החדר. שימו לב בכלל מכשיר UPS רק לשמור על הציוד שלך לרוץ 50-30 דקות בהעדר כוח; המטרה העיקרית היא להגן מפני אובדן זמני של כוח במהלך המעבר מן הרגיל לשלטון חירום.
  5. הגדרת המחשב, PC או מקינטוש, המוקדש באופן מלא עבור איסוף נתונים ו / או שליטה לאור החממות. מאז מערכת DAM יהיה פועל כל הזמן, ללא השגחה, מומלץ כי במחשב זה יש להתקין תוכנה מינימלית, רצוי ללא חיבור לרשת כדי למזער את הסיכון של התרסקות. בנוסף, המערכת לצורכי אחסון נתונים ניידים, כגון כונן ה-zip, CD / DVD סופר, או ה-USB, כדי לאפשר הורדה של נתונים שנאספו לניתוח שלאחר מכן.
  6. ידנית לסדר את רשת קו הטלפון בצורה מסודרת סביב מדפים של חממות שבשליטת לסביבה על מנת לאפשר להקל על חיבור / ניתוק של צגים פעילות. קווי טלפון רגילים, מתאמים מפצלי ניתן לרכוש בחנויות אלקטרוניקה מסחרית בשימוש. הגדרת קווי טלפון מרובות בצורה כזאת כי הם יוכלו להתכנס לתוך שורה אחת הראשי להאריך מתוך האינקובטור כדי להתחבר למחשב.
  7. חבר את התקני ניטור בתוך החממות למחשב באמצעות ממשק יחידה אספקת החשמל (תיבת כחול aka מ Trikinetics Inc), המשמש את הכוח לפקח על פעילות (Trikinetics Inc) באמצעות קו הטלפון. זה ספק כוח יחידת ממשק פועלת גם ממשק להעברת נתונים מעבר מ קו הטלפון כבל USB. בקר אור אופציונלי באותה יחידה שבה קו כבל מתח של מערכת אור החממה יכול להיות מחובר, זמין כדי לאפשר שליטה על לוח הזמנים חממה היממה תאורה דרך המחשב.
  8. אפשרי מסכת האור מקורות LED של מכשיר אלקטרוני או כראוי חותם דלת החממה עם הקלטת ברווז או בד שחור כדי להבטיח חופשית פועל מקצבים נמדדים בהיעדר אור לא רצויים.

2. הכנת חיות הניסוי

  1. פנוטיפים התנהגותיים כגון זבובי פירות המקצב היממה לישון / לנוח פעילות רגישים מאוד להבדלים genotypic והגיל של החיות הבדיקה (Koh et al. 2006). לכן, חשוב לבחון פנוטיפים אלה באמצעות בעלי חיים שליטה נכונה כי הם שגדלו בתנאים סביבתיים זהים בני אותו גיל. בנוסף, יש dimorphism מינית המקצב היממה (Helfrich-Foster 2000). הנוהג הכללי הוא להשתמש זבובים זכר בוגר, כי הם מגדלים 25 מעלות צלזיוס, בין יום 1-5 הישן מבחני פעילות של תנועה. זכר זבובים במקום זבובים הנשי משמשים באופן מסורתי בגלל ההטלה פעילות ישפיע מדידה נכונה של פעילות של תנועה. בגלל dimorphism מינית, זבובים נקבה לפעמים assaying יכול להיות אינפורמטיבי. מזון המורכב פשוט סוכרוז 5% ו -2% אגר bacto ימנע הביצים הלא בתולה נקבות מלפתח ותנועה של זחלים שבקעו גרימת ספירת פעילות שגויה. לחלופין, זבובים בתולה נקבה ניתן להשתמש למרות שאולי יש הבדלים בין פרופילי פעילות הזדווגו ואת בתולה הנקבות (Helfrich-פורסטר, J. Biol. מקצבים 2000).
  2. כאשר בוחנים היממה ולישון / שאר הפרמטרים של זבובים מוטנטים ספציפיים של עניין, זה נבון שולי ולא את המניה מוטציה עם זן פראי סוג של רקע גנטי זהה, למשל w1118 או YW. פעולה זו תסיר מכפילי האתר השני גנטי שעלול מסכה פנוטיפ היממה או שינה / מנוחה. מכיוון שאין לחצות, ושוב תסיסנית זכרים, עדיף לבצע את שולי ולא על ידי חציית הנקבות מוטציה עם wild-type זכרים. המתח wild-type ישמש גם לשלוט מתאים הניסוי. Seed הן את השליטה wild-type וזבובים מוטציה באותו זמן ברמת תסיסנית מזון על 10 עד 14 ימים לפני הניסוי פעילות של תנועה קצב (ראו Bloomington מרכז תסיסנית במלאי למתכון מזון; http://flystocks.bio.indiana.edu /). עם eclosion של הצאצאים, לאסוף 1-5 ימים זבובים זכרים ישנים והניח אותן בצד כדי לשמש בניסויים.
  3. בעזרת כלים גנטיים משאבים רבים כגון overexpression, RNAi, ורקמות ספציפי GAL4 לטוס הנהג קווי זמין ממרכזי מניות שונים ברחבי העולם, אפשר לנתח את ההשפעות של overexpressing או לדפוק למטה גנים ספציפיים רקמות ובזמן ספציפיים באופן (ברנד Perrimon 1993; מקגווייר et al 2004;.. Osterwalder et al 2001). כדי לבחון היממה ולישון / שאר הפרמטרים שימוש בגישה זו, זבובים נושאת בונה מהונדס עם רקמות ספציפיות או סמים ועין מתנהלת GAL4 הנהג (גברים למשל) הם חצו את הזבובים נושאת בונה מהונדס עם גנים היעד המחוברים המגיב כטב"מ (למשל נקבות בתולה) בסביבות 14 ימים לפני תחילת הפעילות של תנועהניסויים. עם eclosion של הצאצאים, לאסוף 1-5 ימים זבובים זכרים ישנים והניח אותן בצד כדי לשמש בניסויים. הקווים הורים המשמשים חוצים את המשמשים באופן שגרתי כפקדי עבור הניסויים. הצאצאים של צלבים של כטב"מים המגיב ו GAL4 קווי הנהג עם זבובים סוג של פרא רקע גנטי זהה גם בקרות מתאימות.
  4. כפי שצוין צעדים (2) ו - (3), את משך הזמן הדרוש להכנת חיות הניסוי משתנה מאוד בהתאם לאופי ועיצוב הניסוי. במקרה שבו בעלי חיים מהונדס צורך שנוצר או אם תוכניות המעבר צריך להיות מוצא להורג, יותר זמן יהיה ברור שיהיה צורך. מסיבות לוגיסטיות, זה לוקח בערך 14 ימים של 25 מעלות תסיסנית לפתח מן הביצים זבובים בוגרים.

3. הכנת צינורות פעילות

  1. צינורות פעילות מייצגים את הגידול לטוס במהלך הניסוי. הם דקים (כ - 5 מ"מ קוטר; לב, Trikinetics מציעה בגדלים שונים בהתאם למין תסיסנית להיות assayed) 5 מ"מ צינורות זכוכית המכילים חומר מזון בקצה אחד מחובר עם חוט או תקע פלסטיק בקצה השני. מאז פעילות צינורות זכוכית ניתן לעשות שימוש חוזר מספר פעמים, נתאר את ההליכים הכנה באמצעות צינורות פעילות בשימוש / זקוקים לניקוי מניסויים קודמים כנקודת המוצא. אם אתה משתמש צינורות פעילות חדשה, פשוט לדלג לשלב (11).
  2. עדיף להשתמש צינורות פעילות כי הם עשו מאז מזון טרי בתוך הצינורות יש נטייה להתייבש מקבל מזוהמים עם פטריות שעות נוספות, גם כאשר מאוחסנים 4 ° C. הם מוכנים בדרך כלל כמה ימים עד שבוע לפני תחילת הניסוי. לכן חשוב להעריך את מספר צינורות הדרושים כל ניסוי לפני הכנת אותם.
  3. הסר את המצתים (תקע חוט או פלסטיק) מתוך צינורות פעילות להשתמש ולשים אותם לתוך כוס זכוכית גדול. צינורות צריך רק למלא עד חצי כוס. ממלאים את הכוס במי ברז, והקפד להטביע את הצינורות.
  4. מיקרוגל כוס התמלא צינורות זכוכית עד שהמים מגיעים לרתיחה מלאה מהיר כדי להמיס את השעווה מזון אגר.
  5. קח מזהירים כי המים חמים. הסר את כוס מן במיקרוגל ומערבבים צינורות עם מרית פלסטיק או פיפטה 10 מ"ל לאפשר שעווה לכודים לצוף למעלה. לאחר מכן חזור על שלב (4).
  6. הסר את כוס מן במיקרוגל ולחכות לו להתקרר. לשים את הגביע בחדר קר (אם הוא זמין) תאיץ את התהליך.
  7. כמו המים מתקרר, שעווה תאסוף על פני המים בהדרגה מתמצק. כל שעליך לעשות הוא להסיר את השעווה הקרושה ביד. זה צריך להיפטר ביותר של שעווה על הצינורות.
  8. העברת צינורות פעילות חדשה עם כוס מי ברז טריים שלבים (4) ו - (5).
  9. מאחר שמרבית השעווה הוסרה בשלב (7), אין צורך לחכות השעווה לחזק. פשוט לשפוך את המים מתוך הכוס ולהעביר את הצינורות לתוך כוס אחר חדש. קח זהירות שהמים עדיין חמים.
  10. חזור על שלבים (4) ו - (5) בפעם האחרונה. יוצקים את המים מתוך הכוס ולחכות צינורות פעילות להתקרר.
  11. טען אותם אנכית לתוך כוסות זכוכית 250 מ"ל או 500ml. ודא שהם לא ארוזים חזק מדי. לעקר אותם באמצעות החיטוי עם מחזור יבש או פשוט להשתמש בתנור ייבוש לייבש את הצינורות.
  12. בנפרד, להכין אוכל לטעון לתוך הצינורות הפעילות, ליצור פתרון של סוכרוז 5% (Sigma) ו -2% אגר Bacto (BD) במים מזוקקים או מי ברז. החיטוי לעקר את הפתרון. האוכל autoclaved ניתן להשתמש מיד או לאחסן 4 ° C במשך תקופה ארוכה של זמן. לאחר האוכל מבצרת, אחד יצטרכו מיקרוגל לנזל אותו על מנת למלא את הצינורות. חלק בשימוש של מזון ניתן לאחסן ולהשתמש בהם במועד מאוחר יותר.
  13. מזון אידיאלי צריך להיות סביב 65 מעלות צלזיוס כאשר נעשה שימוש למילוי צינורות פעילות. אם זה חם מדי, יותר מדי עיבוי יצטברו בתוך הצינורות. אם זה לא מספיק חם, האוכל יהיה לגבש לפני הצינורות מלאים שווה. כדי למלא את צינורות עם פעילות המזון, השתמש פיפטה 10 מ"ל פיפטה אל הפתרון מזון נוזלי לאורך הקיר הפנימי של כוס הזכוכית, המאפשרת את הפתרון מזון כדי למלא את הצינור הפעילות מלמטה למעלה, עד הצינורות הם שליש מלא עם פתרון. כוס מערבולת סביב בעדינות כדי לוודא שכל הצינורות, בעיקר באמצע כוס, מתמלאים באופן שווה עם פתרון מזון. חכו המזון כדי לחזק לחלוטין או בטמפרטורת החדר או 4 ° C. המשך לשלב הבא לאחר עיבוי בתוך צינורות זכוכית להתפוגג.
  14. כדי להסיר את פעילות צינורות מן הקנקן, לדחוף את צינורות לעבר תחתית כוס ו לסובב את הצינורות בו זמנית, כך אוכל מוצק בתוך הצינורות ואת התחתוןשל כוס תהיה נפרדת. קח את הצינורות מתוך כוס, רצוי כמו חבורה אחת.
  15. נקו את צינורות אחד אחד עם מגבות נייר כדי להסיר את עודפי המזון על פני השטח החיצוני של החצוצרות. הגדר את הצינורות הצידה במיכל נקי.
  16. קח את תנור כללי לחסום מעבדה ללא בעל הצינור לכסות את חימום טוב בזהירות עם כמה שכבות של נייר אלומיניום חזק. הוסף (שעווה) כדורי פרפין לתוך החימום מצופה אלומיניום גם להינמס.
  17. החזק את הצינורות בסוף שאינם מזון ו לטבול את קצה מזון לתוך השעווה נמסה. טובלים את החלק שעווה לתוך כוס זכוכית מלאה מים קרים כדי לזרז את מיצוק שעווה. חזור פעם אחת. טבלו את צינורות שעווה לתוך המים תמנע את צינורות יידבקו זה לזה.
  18. צינורות ניתן להשתמש מיד, או לאחסן בכלי אטום על 4 מעלות צלזיוס לשימוש בתוך שבוע. אחסון ממושך יוביל ייבוש יתר של המזון. אם צינורות מאוחסנים 4 ° C, לוודא לחמם אותם עד טמפרטורת הסביבה על ידי השארת אותם על גבי ספסל לפני השימוש.

4. טוען זבובים לתוך צינורות פעילות מערכת ניטור פעילות של תנועה

  1. לפני טעינת זבובים לתוך צינורות פעילות, להפעיל את החממות אשר ישמשו לבית המנטרת את פעילות. כוונו את הטמפרטורה באמצעות שולטת בחממה ולהגדיר את משטר אור / חושך באמצעות מערכת DAM אור הבקר או החממות מערכת בקרה משל אור על פי תכנון הניסוי הרצוי. הזמן הדרוש לטעינת זבובים לתוך צינורות הפעילות צריכה להיות מספיק כדי לייצב את הטמפרטורה.
  2. הרדימי הזבובים עם פחמן דו חמצני.
  3. שימוש במכחול דק בעדינות כדי להעביר זבוב בודד לתוך צינור פעילות.
  4. תפוס באמצע מקשה אחת של חוט זה סביב חצי אינץ' עם מלקחיים בסדר להכניס את חוט לתוך סוף שאינם מזון של הצינור פעילות שיסתום את הפתח ולמנוע לטוס לברוח במהלך הניסוי, תוך אותו זמן ומאפשר זרימת אוויר לתוך הצינור. לחלופין, כובעי פלסטיק עם חורים קטנים (Trikinetics, Inc) ניתן להשתמש כדי לסגור את הפתח.
  5. ודא צינורות מונחים על צדם עד לטוס מתעורר, או אחר יש את הסיכון של הזבוב להיתקע לאוכל.
  6. הכנס את צינורות לתוך המסכים פעילות. עם מודל חדש יותר, קומפקטית יותר של צגי Trikinetics (Trikinetics DAM2 ו DAM2-7), יש צורך להחזיק את הצינורות במקום עם גומיות כדי להבטיח את קרן אינפרא אדום עובר צינור במיקום מרכזי.
  7. שים את המנטרת את פעילות לתוך החממות ואת לחבר אותם למערכת איסוף הנתונים באמצעות חוטי טלפון. בדוק באמצעות מערכת תוכנה DAM אוסף כדי לוודא שכל המסכים מחוברים כראוי נתונים נאספים מכל אחד מהם. הצג פולט קרן אור אינפרא אדום החוצה את מרכז הפעילות של כל צינור זכוכית. פעילות של תנועה של הזבובים נרשמות נתונים בינאריים גלם שם "אחד" נרשם בכל פעם קרן אינפרא אדום שבור או 'אפס' מוקלט שבו קרן אינפרא אדום לא שבור.

5. עיצוב ניסיוני כדי לרשום נתונים על קביעת מחזוריות היממה Amplitude ו

  1. זבובים מסונכרנים נגרר על ידי חשיפת אותם המשטר אור / חושך (LD) ואת הטמפרטורה הרצויה עבור 2-5 ימים מלאים. התנאי entrainment הנפוץ ביותר הוא מחזור אור / חושך של 12 שעות אור / 12 שעות חושך (00:12 LD) בשעה 25 ° C. מצב זה סטנדרטיים מקובלים מבוססת בעיקרה על המחשבה תסיסנית שמקורה אפרו המשוונית מיקומים. כאשר לומדים מקצבי היממה יש כמה המילים כי אחד צריך להכיר. רלוונטיים לפרוטוקול זה, הזמן שבו האורות נדלקים בחממה מוגדר זמן zeitgeber 0 (ZT0) ואת כל הפעמים האחרות הן ביחס ערך (למשל, LD 12:12 מחזור, ZT12 הוא הזמן שבו האורות כבויים). תחת תנאים סטנדרטיים 12:12 LD, פראי סוג תסיסנית melanogaster בדרך כלל מציגים שתי תקופות של פעילות, אחד סביב ZT0 כינה "בוקר" שיא נוסף סביב ZT12 כינה "ערב" שיא (איור 3A). התקפי בוקר וערב נשלטים על ידי השעון אנדוגני אבל יש גם "להקפיץ" התגובות הן התפרצויות חולף של פעילות בתגובה אור / חושך מעברים. יומיים של entrainment הוא מינימום יכול לשמש, למשל, מסכים גדולים כי הם יותר זמן רב מיועדים למדוד חופשי ריצה תקופות בחשכה מתמדת (ראו להלן, שלב 2). עם זאת, אם אתם מעוניינים ללמוד את דפוסי הפעילות במהלך מחזור אור כהה מדי יום, עדיף לשמור על זבובים במשך 4-5 ימים LD כדי להשיג נתונים נוספים. בעיקרו של דבר, הגדלת מספר זבובים או את מספר הימים LD בניתוח הנתונים הסופיים (למשל, נתונים בריכה משתי האחרונהימים בשווי של פעילות של תנועה LD) יפיק יותר אמין פרופילי פעילות יומית מדידות (למשל, העיתוי של השיא בבוקר או בערב). יתר על כן, הפצה יומית של פעילות משתנה כפונקציה של אורך היום (photoperiod) וטמפרטורה. הסיבה העיקרית לשנות את photoperiod או הטמפרטורה מן הסטנדרט אם אחד רצה ללמוד איך דפוסי הפעילות היומית לעבור התאמה עונתית (למשל חן et al 2007). תסיסנית יכול להיות גם לרכבת כדי מחזורי טמפרטורה יומית (למשל גלזר Stanewsky 2005. Sehadova et al. 2009). מחזורי טמפרטורה כי להשתנות רק 2-3 מעלות צלזיוס מספיקים כדי לעלות לרכבת מקצבים פעילות.
  2. חינם הפעלת פעילות מקצבים של תנועה נמדדים תחת כהה מתמיד בתנאי טמפרטורה לאחר תקופת entraining נגמר (ראה לעיל, שלב 1). ההגדרה למחזור האור ניתן לשנות בכל עת בשלב כהה ביום האחרון של LD כזה יום לאחר מכן הניסוי מייצג את היום הראשון של DD. שבעה ימים של איסוף נתונים DD מספיק כדי לחשב את תקופת היממה ואת משרעת (למשל, כוח או כוח של קצב) של זבובים. באופן כללי, גודל מדגם של לפחות 16 זבובים הכרחי כדי להשיג אמינות חופשי ריצה תקופות גנוטיפ מסוים. גם אם הוא מעוניין רק למדידת פעילות יומי, היא עדיין הטובה ביותר למדוד חופשי להפעיל את "זבובים תקופות DD כמו שינויים בתקופה אנדוגני יכול לשנות את חלוקת יומי של פעילות LD. לדוגמה, זבובים עם תקופות אנדוגני ארוך בדרך כלל התערוכה פסגות ערב מאוחרת ב LD (למשל, ראה איור 4).
  3. בסיום הניסוי, נתונים בינאריים גלם שנאספו באמצעות תוכנת מערכת DAM מורד למכשיר נייד אחסון נתונים, כגון מפתח USB.
  4. נתונים בינאריים גלם מעובד באמצעות סכר Filescan102X (Trikinetics, Inc) ו סיכם ל -15 ו -30 פחי דקה בעת ניתוח הפרמטרים היממה, או 1-5 דקות פחי בניתוח לישון / שאר הפרמטרים. כיום, חמש דקות של חוסר פעילות רציפה היא סטנדרטית של שינה / מנוחה תסיסנית (הנדריקס et al 2000;. Ho ו Sehgal 2005).
  5. ישנן דרכים רבות כדי לנתח את הנתונים שנאספו על מערכת DAM אבל אנחנו רק מספקים בשיטות אלו בשימוש שגרתי במעבדה שלנו. Microsoft Excel משמש להקצות גנוטיפ קבוצות מדגם שונות. FaasX תוכנה (M. Boudinot ופ Rouyer, המרכז הלאומי de la משוכלל ונדיר Scientifique, GIF-sur-איווט Cedex, צרפת) או Insomniac (Matlab מבוססת התוכנית, לסלי Ashmore, אוניברסיטת פיטסבורג, פנסילבניה) משמשים כדי לבחון היממה ( תקופת השלטון למשל ו) או שינה / מנוחה (למשל לישון אחוז, כלומר שאר התקף אורך) פרמטרים בהתאמה.

6. נציג תוצאות

עם השלמת פרוטוקול זה, ניתן להשתמש באותם נתונים להגדיר לבחון פרמטרים הן היממה ולישון של חיות הניסוי ביחס החיות שליטה.

ניתוח פרמטרים היממה: גרפים החינוך הממחישות פעילויות של תנועה יומי או פעילויות הממוצע של זבובים על פני כמה ימים ב LD או תנאים DD יכול להיות שנוצר באמצעות FaasX (איור 3) תסיסנית melanogaster בדרך כלל התערוכה שתי תקופות של פעילות, אחד סביב ZT0 (או CT. ) כינה "בוקר" שיא נוסף סביב ZT12 (CT 12) כינה שיא "הערב". שני אלה התקפי פעילויות נשלטים על ידי השעון אנדוגני, ואף ניתן שנצפתה חופשית פועל התנאים DD (איור 3B). שינויים עיתוי אלה פסגות פעילות יכול בקלות להיות שנצפתה גרפים החינוך עשוי להצביע על שינוי המאפיינים של השעון אנדוגני. עוד מאפיין זה מעיד על תפקוד השעון הנכון הוא הגידול בפעילות מקדימה של תנועה שנצפתה מחזורים LD המתרחשת לפני המעברים כהה ל-אור או אור אל חושך בפועל (איור 3A, חיצים). התנהגות זו נצפתה בבירור זבובים סוג בר (איור 3A), אך נעדרת מוטנטים arrhythmic כמו לכל 0 (איור 3 ג) (Konopka ו Benzer, PNAS, 1971). במקרה של 0 מוטנטים לכל, את "בוקר" ציין ואת "ערב" פסגות ב LD יש תגובות בהלה אך ורק בשל שינויים פתאומיים אור / חושך התנאים ("clockless" כלומר זבובים לא צופים שינויים סביבתיים, אלא רק להגיב להם ). הפסד של המקצב התנהגותי הוא הרבה יותר בולט ב DD ובדרך כלל באה לידי ביטוי תוך אובדן מוחלט של פסגות בוקר או ערב של פעילות של תנועה (התקפי אקראי כלומר פעילות וחוסר פעילות), כפי שניתן לראות לכל 0 זבובים (איור 3D). בנוסף גרפים החינוך, נתוני הפעילות של תנועה יכול להיות מיוצג כפי actogram העלילה פעמיים (FaasX), שם יומיים של נתונים הם זממו ברצף על כל שורה, אלא פרופיל של היום האחרון מתחיל את השורה הבאה של יומיים בשווי של פעילות (תרשים 4). לדוגמה, LD1 ו 2 נרשמות על השורה הראשונה של tהוא actogram. השורה הבאה מתחילה לחזור של LD2 ואחריו LD3 וכן הלאה. בעקבות בתבנית זו, הנתונים על הפעילות של תנועה פורש את הניסוי כולו מתואר actogram. Actograms ניתן להתוות עבור לטוס בנפרד, או עבור כל גנוטיפ לעוף. אחד היתרונות של actograms על גרפים החינוך היא כי שינוי אורך תקופת מקצבים הפעילות היומי הנצפה בקלות (איור 4). מלבד יצירת גרפים חינוך actograms, נתוני הפעילות של תנועה ממצב DD ניתן להגיש עד FaasX כדי לחשב את אורך התקופה באמצעות מספר תוכניות שונות, כולל P-Cycle.

ניתוח של שינה / מנוחה פרמטרים: באמצעות ההגדרה הנוכחית של שינה / מנוחה תסיסנית (הנדריקס et al 2000.), אשר חמש דקות של חוסר פעילות רציפה, אפשר לנתח את הנתונים רשמה מבחני פעילות של תנועה ולבחון פרמטרים שינה מרובות באמצעות Insomniac (ל Ashmore), תוכנית Matlab מבוסס. אחוז הזמן טס לבלות שינה ניתן לחשב במרווחי זמן שונים, למשל אחוז לישון כל שעה (איור 5 א), או 12 שעות (איור 5 ב). פרמטרים אחרים שינה שכיחות יותר כי ניתן לבחון כוללים מתכוון לנוח התקף אורך (איור 5c) ופעילות בעקבות לספור (איור 5D). ממוצע לישון / לנוח התקף אורך הוא מדד של כמה המאוחד לישון הוא יכול להמחיש את איכות השינה. פעילות Wake, כפי שהשם מרמז, הוא מדד של קצב פעילות כאשר הזבובים ערים. פרמטר זה מסייע להבחין בין זבובים המושפעות באמת שינה / מנוחה מול התנהגויות אלה חולה או היפראקטיביים. לדוגמה, זבובים, כי הם פשוט חולה אולי נראה לישון יותר כי הם לא ניידים. עבור זבובים אלה, בעקבות הפעילות שלהם תהיה נמוכה יותר ביחס לשליטה בחיות.

איור 1
איור 1: תרשים זרימה המפרט את השלבים העיקריים עבור assaying מקצבי פעילות של תנועה בתוך תסיסנית ההליכים מוצגים בצד שמאל תוך הערות מועילות ניתנים בצד ימין.. משך הזמן הדרוש לביצוע חוצה הדרושים מניפולציות גנטיות להשיג זבובים עם גנוטיפ את הזכות לניסויים מסוימים משתנה בהתאם לאופי ועיצוב הניסוי. שני צעדים המסומנים בכוכבית (*) לספק את מסגרת הזמן כאשר זבובים בוגרים צריכים להיות seeded / הזדווגו ליצור progenies בגיל המתאים (1 עד 5 ימים) לצורך הניסוי.

איור 2
איור 2: תרשים חיווט הממחישות את הקשרים בין רכיבים שונים לאיסוף נתונים תסיסנית פעילות של תנועה באמצעות מערכת סכר מחשב ייעודי משמש כדי להקליט את הפעילות של תנועה עבירות של תסיסנית.. מפקחת פעילות שוכנות בתוך חממות מצויד הטמפרטורה והתאורה (On / Off) שליטה. המחשב יכול לשמש גם לשלוט בעיתוי של אור On / Off ב חממות אם מקור הכוח של מערכת תאורה יכול להיות מחוברת יחידת ספק כוח (אופציונלי). התקשורת בין המחשב לבין המנטרת את פעילות / חממות מנוהלות על ידי יחידת אספקת חשמל ממשק. , המחשב אספקת חשמל יחידת וחממות (אם השליטה התאורה אינה תלויה במחשב) המחוברים לשקע החשמל באמצעות UPC ניטור רצוף כדי להבטיח פעילות רציפה תאורה בשלב האור. מומלץ לחבר את כל המכשירים החשמליים כדי הגיבוי מעגלים חירום במתקן, אם זמין.

איור 3
איור 3:. החינוך גרפים שנוצר באמצעות FaasX מראה פעילות של תנועה יומי של מקצבים קצביים זבובים סוג בר (w 0 זבובים לכל נושא לכל transgene +) (A ו-B) לעומת arrhythmic w לכל 0 מוטנטים (C ו-D) זבובים זכרים הוחזקו במהירות של 25 ° C ו נגרר במשך 4 ימים ב 12:12 LD (אור: כהה) מחזורים ואחריו שבעה ימים DD (חושך קבוע). עבור כל שורה לעוף, רמות פעילות של תנועה של זבובים בודדים (n> 32) נמדדו פחי 15 דקות ואחר כך ממוצעים להשיג פרופיל הקבוצה נציג עבור קו זה. A ו-C להציג את הנתונים פעילות המופק בממוצע בימים השני והשלישי במחזור אור / חושך (LD 2-3), בעוד B ו-D להציג את הנתונים פעילות המופק בממוצע בימים השני והשלישי בחשכה מתמדת (ד.ד. 2-3 ). הקווים האנכיים מייצגים את הפעילות (ביחידות שרירותיות) נרשמו 15 דקות פחי בתקופת האור (אפור בהיר) או תקופת כהה (אפור כהה). ברים אופקית בחלק התחתון של גרפים LD החינוך; לבן, אורות, שחור, באורות כבויים. ZT0 ו ZT12 מייצגים את ההתחלה והסיום של photoperiod בהתאמה. עבור גרפים DD החינוך; CT0 ו CT12 represent ההתחלה והסיום של יום סובייקטיבי בתנאי חושך קבוע, כונה על ידי בר האפור. בפאנל, מ = שיא בוקר: E = שיא הערב. החיצים בלוח מייצגים התנהגות מקדימה של פסגות בוקר וערב שנצפתה זבובים סוג בר, אשר נעדרים w לכל 0 זבובים בקצב לא סדיר.

איור 4
איור 4:. פעמיים העלילה actogram שנוצר באמצעות התוכנה FaasX הממחישות נתוני פעילות של תנועה של זבובים עם סוג בר, קצר, או תקופה ארוכה זבובים זכרים הוחזקו במהירות של 25 ° C ו נגרר במשך 4 ימים במחזורים 12:12 LD בעקבות שמונה ימים בחשכה מתמדת (DD) לצורך חישוב תקופת חופשית פועל (t) באמצעות מחזור-P ב FaasX. שלושה לטוס בקווים בתקופה סוג בר [w ל 0; לכל +; לכל 0 מוטציה שנשא לכל + transgene], תקופה ארוכה [w ל 0; לכל (S47A); לכל 0 מוטציה שנשא לכל transgene (S47A)] תקופה, קצר [w לכל 0; לכל (S47D); לכל 0 נושאת מוטציה לכל (S47D) transgene] מוצגים כאן (Chiu et al 2008).. ציר ה-X מייצג ZT או CT זמן LD או DD בהתאמה, ציר Y מייצג את ספירת פעילות (יחידות שרירותיות) סיכם לתוך 15 דקות פחי. קווים מנוקדים אדום להתחבר הפסגות ערב עבור כל יום של הניסויים. שים לב במהלך LD שיא הערב הוא "נאלץ" כדי לשמור על סינכרון עם מחזור LD 24 שעות, ואילו DD התקופה חופשית פועל יכול לסטות 24 שעות. לדוגמה, עבור זבובים עם תקופות קצרות התזמון של פעילות הערב תתרחש מוקדם יותר בכל יום רצופים DD (כאשר זמם נגד בהיקף 24 שעות הזמן, כפי שמוצג כאן), בעוד שינוי ימינה הוא ציין לזבובים עם ארוך תקופות.

איור 5
. איור 5: כימות הפרמטרים לישון תסיסנית זבובים (קנטון-S: CS) נחשפו מחזור רגיל LD 12:12 במהירות של 25 ° C. Insomniac (L. Ashmore) שימש כדי לעבד את הנתונים ואת Microsoft Excel היה השתמשו כדי ליצור את התרשימים המוצגים כאן. לפחות 70 זבובים היו ונקווה להשיג את הממוצעים בקבוצה וברים שגיאה (שגיאת התקן של הממוצע) הראו. (א) לישון Baseline מחושב מדי שעה, המוצג מחזור יומי נציג. (ב) שינה Baseline מחזור יומי נציג מחושב כל 12 שעות. (ג) אורך ממוצע של שאר כל התקף מחושב במרווחים של 12 שעות. (ד) שיעור פעילות ערות מחושב כל 12 שעות.

Discussion

בפרוטוקול זה, אנו תיאר נהלים למדידת פעילות של תנועה תסיסנית מקצבים, פלט התנהגות אמינה של שעונים היממה לטוס המשמש readout רמת תפקוד השעון. Assay זה נעשה שימוש בקנה מידה גדול עבור מסכי מוטנטים שעון הרומן (למשל Konopka ו Benzer 1971;. Dubruille et al 2009) והוא משמש הרף לנתח ולהבין פונקציה שעון in vivo. הוא שימש גם ללמוד בעקבות מחזור השינה אצל זבובי, על אף הפרסומים האחרונים מראים כי ניתוח וידאו דיגיטלי הוא הרבה יותר אמין לכימות לישון מאשר באמצעות פעילות מקצבים של תנועה (צימרמן et al. 2008). בעת שימוש במקצבים פעילות של תנועה לנתח לישון, אחוז לישון בשעות היום נוטים להפריז.

כדי להבטיח את ההצלחה שחזור של פרוטוקול זה, הוא קריטי זבובים assay הדומים גיל, רקע גנטי, שגדלו באותם תנאים, כפי פנוטיפים התנהגותיים כגון זבובי פירות המקצב היממה לישון / לנוח פעילות רגישים מאוד לכל הגורמים הללו. בעת שימוש חממות מרובים עבור ניסוי בודד, חשוב לוודא חממות כל בטמפרטורה הצפויה מאז כמה פרמטרים היממה עשויה להשתנות כפונקציה של הטמפרטורה. מילה אחת של זהירות כאשר שוקלים רכישת חממות לעבודה עם זבובים, לא כולם נוצרו שווים. בעוד אנו מהססים להמליץ ​​על כל יחידה מיוחדת יש אפשרויות רבות. משאב טוב למצוא חברות שמוכרות חממות לעבודה תסיסנית מסופק על <www.flybase.org>. חלק מהחברות אפילו למכור "תסיסנית היממה" חממות, שבו תכונות נוספות זמינים, כמו חוטית כבר למערכת Trikinetics ו ramping טמפרטורה (למשל, Tritech). התכונות החשובות כוללים את היכולת לשלוט באור יומי בקרת טמפרטורה טובה בטווח הפיזיולוגי של תסיסנית (~ 15-30 ° C). מחירים וגדלים של חממות להשתנות הרבה, אבל עם צגים פעילות חדשה מ Trikinetics, גם חממות קטן יכול להכיל מספר לא מבוטל של מכשירים אלה. כמו כן, למרות חממות עם בקרת לחות ניתן להשתמש בתכונה זו הוסיפה אינו הכרחי, כל עוד אתה במקום מחבת קטנה עם מים כדי לספק לחות (50-70% זה בסדר). לבסוף, למרות שאנחנו משתמשים באופן שגרתי FaasX ו Insomniac לניתוח נתונים בפרוטוקול זה, ישנן תוכניות חלופיות תוכנות זמין (Rosato ו Kyriacou 2006), למשל ClockLab (ActiMetrics), חבילה ברנדייס Rhythm (ד 'וילר, ביילור לרפואה, יוסטון ), ו MAZ (Zordan et al. 2007).

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH NIH34958 ל י ה ו NS061952 אל JC

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila activity monitor (DAM) Trikinetics Inc.; Waltham, MA DAM2 or DAM5 DAM2 monitors are more compact, and more can fit into a single incubator
Power supply interface unit (for DAM system) Trikinetics Inc.; Waltham, MA PSIU9 Includes PS9-1 AC Power Supply
Light controller Trikinetics Inc.; Waltham, MA LC6
Pyrex glass tubes Trikinetics Inc.; Waltham, MA PGT5, PGT7, and PGT10
Plastic activity tube caps Trikinetics Inc.; Waltham, MA CAP5 Yarn can be used instead of plastic caps.
DAM System data collection software Trikinetics Inc.; Waltham, MA Versions available for both Mac and PC
FaasX software Centre National de la Recherche Scientifique Only for Mac
Insomniac 2.0 software University of Pittsburgh School of Medicine Runs on Matlab. Can be used on both PC and Macintosh.
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. Percival incubator Percival Scientific, Inc. I-30BLL Interior space dimension:Width: 65cm;Height: 86cm;Depth: 55cm
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. DigiTherm Heating/Cooling Incubator with Circadian Timed Lighting and Timed Temperature Tritech Research, Inc. 05DT2CIRC001 Interior space dimension:Width: 36m;Height: 56m;Depth: 28cm
APC Smart-UPS 2200VA 120V (Emergency power backup unit) APC SU2200NET Output Power Capacity of 1600 Watts
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Bacto Agar BD Biosciences 214010
TissuePrep Paraffin pellets Fisher Scientific T565 Melting point 56°C-57°C
Block heater VWR international 12621-014

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  2. Chen, W. F., Low, K. H., Lim, C., Edery, I. Thermosensitive splicing of a clock gene and seasonal adaptation. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 72, 599-606 (2007).
  3. Chiu, J. C., Vanselow, J. T., Kramer, A., Edery, I. The phospho-occupancy of an atypical SLIMB-binding site on PERIOD that is phosphorylated by DOUBLETIME controls the pace of the clock. Genes Dev. 22, 1758-1772 (2008).
  4. Dubruille, R., Murad, A., Rosbash, M., Emery, P. A constant light-genetic screen identifies KISMET as a regulator of circadian photoresponses. PLoS Genet. 12, e1000787-e1000787 (2009).
  5. Glaser, F. T., Stanewsky, R. Temperature synchronization of the Drosophila circadian clock. Curr Biol. 15, 1352-1363 (2005).
  6. Helfrich-Förster, C. Differential control of morning and evening components in the activity rhythm of Drosophila melanogaster- sex-specific differences suggest a different quality of activity. J Biol Rhythms. 15, 135-154 (2000).
  7. Hendricks, J. C., Finn, S. M., Pancleri, K. A., Chavkin, J., Williams, J., Sehgal, A., Pack, A. I. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25, 129-138 (2000).
  8. Ho, K. S., Sehgal, A. Drosophila melanogaster: an insect model for fundamental studies of sleep. Methods Enzymol. 393, 772-793 (2005).
  9. Koh, K., Evans, J. M., Hendricks, J. C., Sehgal, A. A Drosophila model for age-associated changes in sleep: wake cycles. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 13843-13847 (2006).
  10. Konopka, R. J., Benzer, S. Clock mutants of Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci USA. 68, 2112-2116 (1971).
  11. McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends Genet. 20, 384-391 (2004).
  12. Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. A conditional tissue-specific transgene expression system using inducible GAL4. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12596-12601 (2001).
  13. Rosato, E., Kyriacou, C. P. Analysis of locomotor activity rhythms in Drosophila. Nature Protocols. 1, 559-568 (2006).
  14. Sehadova, H., Glaser, F. T., Gentile, C., Simoni, A., Giesecke, A., Albert, J. T., Stanewsky, R. Temperature entrainment of Drosophila's circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain. Neuron. 64, 251-266 (2009).
  15. Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. A video method to study Drosophila sleep. Sleep. 31, 1587-1598 (2008).
  16. Zordan, M. A., Benna, C., Mazzotta, G. Monitoring and analyzing Drosophila circadian locomotor activity. In Circadian Rhythms Methods and Protocols. Rosato, E. , Methods in Molecular Biology series. Humana. Totowa, New Jersey. (2007).

Tags

Neuroscience גיליון 43 מקצב צירקדי פעילות של תנועה תסיסנית תקופה לישון Trikinetics
Assaying פעילות של תנועה כדי ללמוד בקצב היממה ושינה פרמטרים<em> תסיסנית</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D.… More

Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila. J. Vis. Exp. (43), e2157, doi:10.3791/2157 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter