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Neuroscience

लोकोमोटर गतिविधि परख के लिए अध्ययन circadian rhythms और पैरामीटर्स नींद ड्रोसोफिला Published: September 28, 2010 doi: 10.3791/2157
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1,3, 1,3
1Center for Advanced Biotechnology and Medicine, Rutgers University, 2Current Address: Department of Entomology, College of Agricultural and Environmental Sciences, University of California, Davis, 3Department of Molecular Biology and Biochemistry, Rutgers University

Summary

हम दैनिक हरकत की गतिविधि लय की रिकॉर्डिंग के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन

Abstract

अधिकांश जीवन रूपों सेलुलर, शारीरिक और व्यवहार घटना है कि अंतर्जात circadian द्वारा संचालित कर रहे हैं (≡ 24 घंटा) पेसमेकर या घड़ियों में दैनिक लय दिखा रहे हैं. मानव circadian प्रणाली में malfunctions कई रोगों या विकारों के साथ जुड़े रहे हैं. Circadian लय अंतर्निहित तंत्र की हमारी समझ की दिशा में बहुत प्रगति आनुवंशिक स्क्रीन से उभरा है, जिससे आसानी से मापा व्यवहार ताल एक घड़ी समारोह के बाहर पढ़ने के रूप में प्रयोग किया जाता है. ड्रोसोफिला का उपयोग अध्ययन सेलुलर और जैव रासायनिक कुर्सियां ​​circadian लय अंतर्निहित की हमारी समझ के लिए मौलिक योगदान दिया है. मानक circadian पढ़ने के लिए बाहर ड्रोसोफिला में मापा व्यवहार हरकत गतिविधि है. सामान्य में, निगरानी प्रणाली में विशेष रूप से डिजाइन उपकरणों कि ड्रोसोफिला के हरकत आंदोलन उपाय कर सकते हैं शामिल है . इन उपकरणों एक darkroom में स्थित है और अवरक्त प्रकाश की एक किरण की रुकावट का उपयोग करने के लिए व्यक्ति छोटे ट्यूबों के अंदर निहित मक्खियों की हरकत गतिविधि रिकॉर्ड पर आधारित कर रहे हैं पर्यावरण नियंत्रित इन्क्यूबेटरों में रखे जाते हैं. जब कई दिनों से मापा जाता है, ड्रोसोफिला प्रदर्शन गतिविधि और निष्क्रियता की दैनिक चक्र, एक व्यवहार ताल है कि जानवर अंतर्जात circadian प्रणाली द्वारा संचालित है . समग्र प्रक्रिया में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हरकत गतिविधि की निगरानी उपकरणों और डेटा विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के विकास के आगमन के साथ सरलीकृत किया गया है. हम Trikinetics इंक है, जो यहाँ वर्णित की प्रक्रिया है और वर्तमान में सबसे लोकप्रिय दुनिया भर में इस्तेमाल प्रणाली है से सिस्टम का उपयोग करें. हाल ही में, एक ही निगरानी उपकरणों ड्रोसोफिला में नींद व्यवहार का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. क्योंकि कई मक्खियों के दैनिक जगा नींद चक्र के साथ ही मापा जा सकता है और केवल 1 से 2 सप्ताह निरंतर हरकत गतिविधि डेटा के लायक आमतौर पर पर्याप्त है, इस प्रणाली के बड़े पैमाने पर स्क्रीन के लिए आदर्श है ड्रोसोफिला प्रकट बदल circadian या सोने गुणों की पहचान है.

Protocol

प्रोटोकॉल के समग्र डिजाइन चित्रा 1 में सचित्र है. हरकत गतिविधि की निगरानी पर्यावरण नियंत्रित एक darkroom में स्थित इन्क्यूबेटरों में रखे उपकरणों का उपयोग करने के लिए सेटअप करने के लिए पहले से इकट्ठा किया जा जरूरत है. एक बार पूरा हो गया है कि, प्रणाली सभी बाद हरकत गतिविधि लय माप में इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रत्येक प्रयोग के लिए, एक (i) के प्रायोगिक पशुओं तैयार है, जो ट्रांसजेनिक जानवर पैदा करने या आवश्यक पार की स्थापना, (ii) कांच गतिविधि एक खाद्य स्रोत युक्त ट्यूबों तैयार है, (iii) लोड गतिविधि ट्यूबों में मक्खियों करने में शामिल हैं और गतिविधि पर नज़र रखता कनेक्ट हो सकता है डेटा संग्रह प्रणाली है, और रिकॉर्ड (iv) और circadian या नींद मापदंडों की जांच करना चाहता है पर निर्भर करता है अलग अलग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण. इस के साथ साथ, हम समय जब निगरानी उपकरणों में मक्खियों पहले वांछित प्रकाश / पर्यावरण इन्क्यूबेटरों में अंधेरा शर्तों को उजागर कर रहे हैं के रूप में प्रयोग के "शुरू" को परिभाषित.

1. लोकोमोटर गतिविधि की निगरानी प्रणाली की स्थापना

  1. निगरानी प्रणाली विशेषता निगरानी उपकरणों, पर्यावरण इन्क्यूबेटरों कि प्रतिदिन प्रकाश नियंत्रण के लिए क्षमता है, डाटा संग्रह उपकरणों, कंप्यूटर और डेटा संग्रह डिवाइस (चित्रा 2) के लिए निगरानी उपकरणों से कनेक्ट करने के लिए तारों जैसे परिधीय सामग्री जैसे कई उपकरण आइटम शामिल है. ड्रोसोफिला गतिविधि (बांध) निगरानी डेटा संग्रह प्रणाली स्थापित करने के लिए निर्देश (Trikinetics इंक) निर्माता द्वारा प्रदान की जाती हैं.
  2. हरकत गतिविधि की निगरानी प्रणाली का घर, एक अच्छी तरह हवादार कमरा, अधिमानतः तापमान नियंत्रण प्रणाली से सुसज्जित चुनते हैं, के लिए एक समर्पित darkroom हो. सभी विद्युत शामिल सिस्टम (जैसे कंप्यूटर और इन्क्यूबेटरों) एक छोटे और सीमित कमरे के भीतर समय की एक विस्तारित अवधि के लिए चलाने के साथ, अत्यधिक गर्मी कमरे के तापमान में तेजी से वृद्धि करने के लिए अग्रणी उत्पन्न किया जा सकता है. नतीजतन, इन्क्यूबेटरों तापमान और अधिक तापमान नियंत्रण में विफल होने की संभावना को बनाए रखने के लिए अतिरिक्त काम का बोझ के साथ बोझ हो जाएगा. हमें लगता है कि अच्छी तरह हवादार कमरे के लिए भी, गर्मियों में एयर कंडीशनिंग से संक्रमण / गिर सर्दियों में गर्मी के लिए यह मुश्किल के लिए कमरे के तापमान बनाए रखने के लिए कर सकते हैं. ऐसे मामलों में अतिरिक्त वेंटिलेशन अंधेरे कमरे में स्थापित किया जाना है overheating के जोखिम को कम सकता है. इसके अलावा, यह सबसे अच्छा है के लिए रवाना अनावश्यक गर्मी के उत्पादन को कम करने के लिए इन्क्यूबेटरों है कि उपयोग में नहीं हैं बारी.
  3. बाहरी प्रकाश स्रोतों से कमरे सील. प्रवेश एक परिक्रामी दरवाजा या काले पर्दे के साथ बंद हो सील कर सकते हैं. हम एक परिक्रामी दरवाजा पसंद के रूप में इस अवांछित darkroom में प्रवेश प्रकाश की संभावना minimizes. Darkroom के अंदर, यह पूरी तरह से अंधेरे में काम के रूप में फल मक्खियों circadian प्रणाली अवरक्त प्रकाश के प्रति संवेदनशील नहीं है (और बहुत कम हरी / नीले प्रकाश की तुलना में लाल बत्ती के प्रति संवेदनशील है) के लिए आवश्यक नहीं है. मामलों में जहां हम darkroom में देखने की जरूरत है, लेकिन अभी भी समग्र अंधेरे (उदाहरण के लिए, जल्दी हटाने या एक मशीन है कि अपने अंधेरे चरण में है में एक निगरानी उपकरण जोड़ने) बनाए रखना चाहते हैं, हम तो सिर्फ एक मानक टॉर्च कि एक लाल के साथ कवर किया जाता है का उपयोग करें फिल्टर. वैकल्पिक रूप से या के अलावा, यदि आपके darkroom फ्लोरोसेंट रोशनी है, उन्हें लाल फिल्टर पेपर के साथ कवर या एक खड़े अकेले गरमागरम डेस्क ऐसे फिल्टर पेपर के साथ कवर प्रकाश है. यह अत्यधिक संभावना नहीं है कि लाल बत्ती की बहुत संक्षिप्त जोखिम (कुछ ही सेकंड) के लिए अंधेरे में मक्खियों को उजागर उनके circadian घड़ियों को प्रभावित करेगा है. इसके अलावा, हालांकि ड्रोसोफिला के circadian प्रणाली बहुत दृश्य प्रकाश के प्रति संवेदनशील है, हमें लगता है कि darkroom में प्रकाश के छोटे creaks परिणामी हो जाएगा नहीं है, किसी भी मामले में, एक अच्छा अभ्यास इनक्यूबेटर दरवाजे रखने के लिए है कि घर पर नज़र रखता है केवल जब खुला आवश्यक है. इसके अलावा, केवल इस रूप में एक समय में एक इनक्यूबेटर खोलने जा रहा है एक मशीन से अपने प्रकाश चरण पर प्रकाश के संपर्क में अपने अंधेरे चरण पर एक मशीन की संभावना को कम कर देंगे.
  4. खरीद एक निर्बाध विद्युत आपूर्ति (यूपीएस) आपातकालीन बैकअप इकाई है कि पर्याप्त वाट क्षमता भारी उछाल, कील, इमारत में या बिजली की विफलता के मामले में गतिविधि की निगरानी प्रणाली के घटकों बिजली क्षमता है. यदि उपलब्ध हो तो इमारत की आपातकालीन बैकअप सर्किट यूपीएस आपातकालीन बैकअप इकाई कनेक्ट. पता है कि भले ही अपने उपकरणों एक शक्ति आउटेज के दौरान एक आपातकालीन आउटलेट में plugged है वहाँ एक छोटी अवधि के संक्रमण के रूप में इस प्रणाली आपातकालीन शक्ति के लिए स्विच कर सकते हैं. है कि संक्रमण के दौरान शक्ति के भी कुछ सेकंड के लिए नुकसान नीचे बंद इनक्यूबेटर बंद कर दिया जा रहा है में कंप्यूटर और रोशनी करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है करने के लिए सुनिश्चित करें कि कंप्यूटर गतिविधि डेटा और इनक्यूबेटर में रोशनी नियंत्रण प्रणाली केवल आपातकालीन शक्ति के रूप में नहीं आदी रहे हैं, लेकिन यह भी एक यूपीएस इकट्ठा किया जा रहा है. यदि इनक्यूबेटर में प्रकाश व्यवस्था के नियंत्रण प्रणाली सीधे इनक्यूबेटर (यह ज्यादातर मामलों में है) द्वारा विनियमित नहीं है, तो यह उभरने में इनक्यूबेटर प्लग करने के लिए पर्याप्त हैncy एक यूपीएस के बिना कुछ ही सेकंड के लिए सत्ता के नुकसान के रूप में, बिजली कक्ष तापमान को प्रभावित नहीं करेगा. नोट: है कि सामान्य रूप में एक यूपीएस डिवाइस केवल अपने उपकरणों को बिजली के अभाव में 5-30 मिनट के लिए चल रखेंगे, इसका मुख्य उद्देश्य आपातकालीन शक्ति के लिए नियमित रूप से संक्रमण के दौरान सत्ता के अस्थायी नुकसान के खिलाफ की रक्षा है.
  5. एक कंप्यूटर, पीसी या Macintosh, पूरी तरह से डेटा संग्रह और / या इन्क्यूबेटरों के प्रकाश नियंत्रण के लिए समर्पित सेट. के बाद से बांध प्रणाली सभी समय और नायाब चल रहा होगा, यह अनुशंसित है कि इस कंप्यूटर न्यूनतम सॉफ्टवेयर, अधिमानतः कोई नेटवर्क कनेक्शन स्थापित किया है दुर्घटनाग्रस्त के जोखिम को कम. इसके अलावा, सिस्टम पोर्टेबल डेटा भंडारण, जैसे ज़िप ड्राइव, सीडी / डीवीडी लेखक, या USB की जरूरत है, बाद के विश्लेषण के लिए एकत्र आंकड़ों के डाउनलोड करने के लिए अनुमति.
  6. मैन्युअल रूप से टेलीफोन लाइन नेटवर्क बड़े करीने से पर्यावरण नियंत्रित इन्क्यूबेटरों के ठंडे बस्ते में डालने के आसपास plugging / गतिविधि पर नज़र रखता के unplugging के आराम की अनुमति की व्यवस्था. मानक टेलीफोन लाइनों, एडेप्टर, और splitters वाणिज्यिक इलेक्ट्रॉनिक स्टोर में खरीदा जा सकता है है और इस्तेमाल किया. एक ऐसी है कि वे एक मुख्य लाइन में एकाग्र और इनक्यूबेटर बाहर का विस्तार करने के लिए कंप्यूटर से कनेक्ट रास्ते में कई टेलीफोन लाइनों को सेट करें.
  7. एक बिजली की आपूर्ति अंतरफलक (उर्फ ब्लू बॉक्स Trikinetics इंक से) इकाई, जो टेलीफोन लाइन के माध्यम से गतिविधि पर नजर रखने (Trikinetics इंक) के सत्ता में कार्य करता है के माध्यम से कंप्यूटर के लिए इन्क्यूबेटरों अंदर निगरानी उपकरणों कनेक्ट. यह बिजली की आपूर्ति अंतरफलक इकाई भी टेलीफोन लाइन से यूएसबी केबल स्विचन डेटा अंतरण के लिए एक अंतरफलक के रूप में कार्य करता है. एक ही इकाई में इनक्यूबेटर प्रकाश व्यवस्था की बिजली लाइन कॉर्ड से जोड़ा जा सकता है, में वैकल्पिक प्रकाश नियंत्रक करने के लिए कंप्यूटर के माध्यम से circadian इनक्यूबेटर प्रकाश अनुसूची के नियंत्रण की अनुमति के लिए उपलब्ध है.
  8. मास्क से संभव प्रकाश स्रोतों इलेक्ट्रॉनिक डिवाइस या बतख टेप या काला करने के लिए मुक्त चल लय सुनिश्चित करने के कपड़ा के साथ अनुचित तरीके से सील इनक्यूबेटर दरवाजा एलईडी अवांछित प्रकाश के अभाव में मापा जाता है.

2. प्रयोगात्मक पशु की तैयारी

  1. फल में व्यवहार phenotypes जैसे circadian rhythmicity और नींद / आराम गतिविधि बहुत परीक्षण पशुओं के genotypic और उम्र मतभेद (कोह एट अल 2006.) प्रति संवेदनशील हैं मक्खियों . इसलिए, यह इन phenotypes का उपयोग उचित नियंत्रण जानवरों है कि एक ही पर्यावरण की स्थिति में और एक ही उम्र के पाला जाता है का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, वहाँ circadian rhythmicity में यौन द्विरूपता (Helfrich - फोस्टर 2000) है. सामान्य व्यवहार के वयस्क नर मक्खियों कि 25 में पाला जाता है डिग्री सेल्सियस और 1 से 5 दिन हरकत गतिविधि assays के लिए पुराने के बीच है. का उपयोग करने के लिए है पुरुष महिला मक्खियों के बजाय मक्खियों पारंपरिक रूप से इस्तेमाल कर रहे हैं क्योंकि अंडे बिछाने गतिविधि हरकत गतिविधि का सच माप को प्रभावित करेगा. यौन द्विरूपता के कारण, कभी कभी मादा मक्खियों परख करने की क्रिया जानकारीपूर्ण हो सकता है. केवल 5% sucrose और 2% bacto अगर मिलकर विकासशील और गलत गतिविधि की गिनती के कारण से रची लार्वा के आंदोलन से खाद्य गैर कुंवारी महिलाओं के अंडे को रोकने जाएगा. वैकल्पिक रूप से, कुंवारी महिला मक्खियों हालांकि वहाँ गतिविधि प्रोफाइल में mated और कुंवारी महिलाओं (Helfrich फोरस्टर, जे बॉय लय 2000.) के बीच मतभेद हो सकता है इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. Circadian और नींद / आराम हित के विशिष्ट उत्परिवर्ती मक्खियों के मापदंडों की जांच, यह समझदारी है एक ही आनुवंशिक पृष्ठभूमि, जैसे w1118 या YW के जंगली प्रकार के तनाव के साथ उत्परिवर्ती शेयर outcross. यह दूसरा साइट आनुवंशिक संशोधक है कि संभावित circadian या नींद आराम / phenotype मुखौटा हो सकता है निकाल देंगे. के बाद से वहाँ कोई पार से अधिक ड्रोसोफिला पुरुषों में, यह जंगली प्रकार के पुरुषों के साथ उत्परिवर्ती महिलाओं पार करके outcross प्रदर्शन बेहतर है . जंगली - प्रकार तनाव भी प्रयोग के लिए उपयुक्त नियंत्रण के रूप में सेवा करेंगे. बीज दोनों नियंत्रण जंगली प्रकार और हरकत गतिविधि लय प्रयोग के बारे में 10 से 14 दिनों पहले मानक ड्रोसोफिला भोजन में एक ही समय में उत्परिवर्ती मक्खियों (ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक केंद्र खाद्य नुस्खा के लिए देख; http://flystocks.bio.indiana.edu /). संतान के eclosion पर, 1 से 5 दिन पुराने नर मक्खियों को इकट्ठा करने और उन्हें सेट अलग प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा.
  3. कई आनुवंशिक overexpression, आरएनएआई, और ऊतक विशिष्ट GAL4 ड्राइवर मक्खी अलग स्टॉक केन्द्रों से दुनिया भर में उपलब्ध लाइनों जैसे उपकरणों और संसाधनों के साथ, यह संभव है में overexpressing या दस्तक नीचे विशिष्ट जीन के प्रभाव को काटना ऊतक और लौकिक - विशेष (ब्रांड और Perrimon 1993, McGuire एट अल 2004;. Osterwalder एट अल 2001) तरीके से. Circadian जांच और नींद / आराम इस दृष्टिकोण का उपयोग कर पैरामीटर, ऊतक विशेष या दवा inducible GAL4 ड्राइवर (जैसे पुरुषों) लक्ष्य जीन यूएएस प्रत्युत्तर (जैसे कुंवारी महिलाओं) के लिए संलग्न के साथ ट्रांसजेनिक constructs लेकर मक्खियों को पार कर रहे हैं के साथ ट्रांसजेनिक constructs ले जाने मक्खियों हरकत गतिविधि के शुरू होने से पहले लगभग 14 दिनोंप्रयोगों. संतान के eclosion पर, 1 से 5 दिन पुराने नर मक्खियों को इकट्ठा करने और उन्हें सेट अलग प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा. पैतृक पार करने के लिए प्रयोग किया जाता लाइनों नियमित रूप से प्रयोगों के लिए नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है. यूएएस प्रत्युत्तर और GAL4 एक ही आनुवंशिक पृष्ठभूमि के जंगली प्रकार मक्खियों के साथ ड्राइवर लाइनों के पार से संतान भी उचित नियंत्रण कर रहे हैं.
  4. के रूप में चरणों में संकेत (2) और (3), प्रायोगिक पशुओं की तैयारी के लिए समय की लंबाई की जरूरत बहुत प्रकृति और प्रयोग के डिजाइन पर निर्भर करता है. मामले में है जहां ट्रांसजेनिक जानवर या उत्पन्न हो सकता है अगर पार योजनाओं को निष्पादित करने की आवश्यकता है, और अधिक समय जाहिर की जरूरत होगी की जरूरत है. सैन्य कारणों के लिए, के बारे में 14 दिनों यह 25 बजे लेता ° सी ड्रोसोफिला के लिए अंडे से वयस्क मक्खियों के लिए विकसित करने के लिए .

3. गतिविधि ट्यूबें तैयार

  1. गतिविधि ट्यूब प्रयोग के दौरान उड़ वास का प्रतिनिधित्व करते हैं. वे पतले होते हैं (व्यास में 5 मिमी के बारे में, ध्यान दें, Trikinetics ड्रोसोफिला के लिए assayed प्रजातियों पर निर्भर करता है अलग आकार प्रदान करता है) 5 मिमी ग्लास ट्यूब कि एक अंत में खाद्य पदार्थ होते हैं और यार्न या दूसरे छोर पर प्लास्टिक प्लग के साथ plugged. के बाद से कांच गतिविधि ट्यूबों कई बार reused किया जा सकता है, हम प्रारंभिक बिंदु के रूप में पिछले प्रयोगों से इस्तेमाल किया / uncleaned गतिविधि ट्यूबों का उपयोग करके तैयारी प्रक्रियाओं का वर्णन होगा. यदि आप नई गतिविधि ट्यूब का उपयोग कर रहे हैं, बस कदम (11) को छोड़.
  2. यह गतिविधि ट्यूबों कि हौसले के बाद ट्यूबों के अंदर भोजन सूख प्रवृत्ति है और हो जाता कवक के साथ दूषित समयोपरि भी जब 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जाता है का उपयोग करने के लिए बेहतर है वे आम तौर पर प्रयोग के शुरू के एक सप्ताह आगे के लिए एक कुछ दिनों के लिए तैयार हैं. इसलिए यह महत्वपूर्ण है के लिए उन्हें तैयार करने से पहले एक प्रयोग के लिए आवश्यक ट्यूबों की संख्या का आकलन करने के लिए.
  3. इस्तेमाल गतिविधि ट्यूब से प्लग (धागा या प्लास्टिक प्लग) निकालें और उन्हें बड़े गिलास बीकर में डाल दिया. ट्यूबों केवल आधा बीकर को भरने चाहिए. नल का पानी के साथ बीकर भरें, ट्यूबों डूब करने के लिए सुनिश्चित करें.
  4. माइक्रोवेव बीकर ग्लास ट्यूब के साथ भरा जब तक पानी मोम पिघल और अगर भोजन पूर्ण तेजी फोड़ा करने के लिए आता है.
  5. सावधानी रखना है कि पानी गर्म है. बीकर को माइक्रोवेव से निकालें और एक रंग या प्लास्टिक की 10 एमएल विंदुक फंस मोम शीर्ष पर फ्लोट करने की अनुमति के साथ ट्यूबों हलचल. फिर कदम (4) दोहराएँ.
  6. माइक्रोवेव से बीकर निकालें और प्रतीक्षा के लिए इसे शांत करने. ठंडे कमरे में बीकर लाना (अगर यह) उपलब्ध है प्रक्रिया को गति देगा.
  7. के रूप में पानी शांत होता है, मोम पानी की सतह पर जमा है और धीरे - धीरे solidifies जाएगा. बस जम मोम हाथ से हटा दें. यह ट्यूब पर मोम के अधिकांश से छुटकारा मिलना चाहिए.
  8. ताजा पानी के नल और दोहराने कदम (4) और (5) के साथ एक नया बीकर गतिविधि ट्यूबों स्थानांतरण.
  9. के बाद से मोम की सबसे कदम (7) में हटा दिया गया है, यह जमना मोम के लिए प्रतीक्षा करने के लिए आवश्यक नहीं है. बस बीकर के बाहर पानी डालना और एक और नया बीकर में ट्यूबों हस्तांतरण. सावधानी रखना है कि पानी अभी भी गर्म है.
  10. दोहराएँ कदम (4) और (5) पिछली बार के लिए. बीकर के बाहर पानी डालो और गतिविधि ट्यूबों के लिए प्रतीक्षा करने के लिए शांत हो जाओ.
  11. उन्हें 250 एमएल या 500ml कांच beakers में खड़ी लोड. यकीन है कि वे बहुत कस कर नहीं भरे होते हैं. उन्हें एक सूखा चक्र के साथ एक autoclave का उपयोग कर या बस एक सुखाने ओवन का उपयोग करने के लिए ट्यूबों सूखी जीवाणुरहित.
  12. उधर गतिविधि ट्यूब में लोड करने के लिए खाना तैयार करने के लिए, 5% (सिग्मा) आसुत पानी या पानी के नल में और 2% Bacto अगर sucrose (बी) के एक समाधान है. आटोक्लेव समाधान बाँझ. autoclaved भोजन तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या समय की एक विस्तारित अवधि के लिए 4 ° C में संग्रहीत. एक बार भोजन solidifies, एक माइक्रोवेव के लिए की जरूरत है और यह क्रम में ट्यूब भरने दव्र बनाना होगा. भोजन की अप्रयुक्त भाग और संग्रहीत किया जा सकता है एक बाद की तारीख पर इस्तेमाल किया.
  13. भोजन आदर्श 65 के आसपास होना चाहिए डिग्री सेल्सियस जब गतिविधि ट्यूबों भरने के लिए इस्तेमाल किया. अगर यह बहुत गर्म है, बहुत अधिक संक्षेपण ट्यूब अंदर जमा करेंगे. अगर यह काफी गर्म नहीं है, भोजन जमना पहले ट्यूबों समान रूप से भर रहे हैं. खाने के साथ गतिविधि ट्यूबों भरने के लिए, एक 10 एमएल पिपेट का उपयोग करने के लिए कांच बीकर के अंदर दीवार के साथ तरल खाद्य समाधान पिपेट, भोजन समाधान नीचे से गतिविधि ट्यूब भरने के लिए अनुमति देता है, जब तक ट्यूब एक तिहाई भरा समाधान के साथ. भंवर धीरे आसपास बीकर के लिए सुनिश्चित करें कि सभी ट्यूबों, विशेष रूप से बीकर के बीच में हैं, बनाने के समान रूप से खाद्य समाधान के साथ भर रहे हैं. भोजन के लिए रुको करने के लिए पूरी तरह से कमरे के तापमान या 4 डिग्री सेल्सियस पर या तो जमना अगले कदम के लिए आगे बढ़ें एक बार ग्लास ट्यूब के अंदर संक्षेपण फैलने.
  14. बीकर से गतिविधि ट्यूबों को हटाने के लिए, बीकर के नीचे की ओर ट्यूबों धक्का और एक ही समय में इतनी ट्यूबों मोड़ कि ट्यूबों के अंदर जम भोजन और नीचेबीकर के अलग होगा. बीकर के बाहर ट्यूबों अधिमानतः एक एकल गुच्छा के रूप में ले लो.
  15. एक कागज तौलिये ट्यूबों के बाहरी सतह पर अतिरिक्त भोजन निकालने के साथ एक ट्यूबों साफ करें. एक साफ कंटेनर में ट्यूबों अलग सेट.
  16. ट्यूब धारक के बिना एक सामान्य प्रयोगशाला ब्लॉक हीटर ले लो और हीटिंग मजबूत एल्यूमीनियम पन्नी की कई परतों के साथ अच्छी तरह से ध्यान से कवर. आयल छर्रों (मोम) एल्यूमीनियम लाइन हीटिंग के लिए अच्छी तरह से पिघल में जोड़ें.
  17. गैर खाद्य अंत में ट्यूबों को पकड़ो और पिघला मोम भोजन अंत में डुबकी. एक गिलास ठंडे पानी से भरा करने के लिए मोम solidification की गति बीकर में लच्छेदार भाग डुबकी. एक बार दोहराएँ. पानी में लच्छेदार ट्यूब की सूई एक साथ चिपके से ट्यूबों को रोकने जाएगा.
  18. ट्यूबों सही इस्तेमाल किया जा सकता है, या ° 4 में एक सप्ताह के भीतर उपयोग के लिए सी एक airtight कंटेनर में संग्रहित है. लम्बे समय तक भंडारण भोजन की अत्यधिक सुखाने के लिए नेतृत्व करेंगे. यदि ट्यूब 4 ° C पर संग्रहीत हैं, उन्हें बेंच शीर्ष पर उन्हें छोड़ने से पहले का उपयोग करने के लिए परिवेश के तापमान को गर्म करने के लिए सुनिश्चित करें.

4. लोड हो रहा है गतिविधि ट्यूब और लोकोमोटर गतिविधि की निगरानी प्रणाली में मक्खियों

  1. पहले गतिविधि ट्यूबों में मक्खियों लोड हो रहा है कि गतिविधि पर नज़र रखता है घर के लिए इस्तेमाल किया जाएगा इन्क्यूबेटरों पर बारी है. इनक्यूबेटर नियंत्रण का उपयोग कर तापमान को समायोजित करें और / प्रकाश अंधेरे वांछित प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार बांध सिस्टम प्रकाश नियंत्रक या इन्क्यूबेटरों स्वयं प्रकाश नियंत्रण प्रणाली का उपयोग कर शासन सेट. गतिविधि ट्यूबों में मक्खियों को लोड करने के लिए आवश्यक समय तापमान को स्थिर करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए.
  2. कार्बन डाइऑक्साइड के साथ मक्खियों anesthetize.
  3. ठीक एक तूलिका का प्रयोग करने के लिए धीरे एक गतिविधि ट्यूब में एक एकल मक्खी हस्तांतरण.
  4. यार्न का एक टुकड़ा है कि ठीक संदंश के साथ आधा इंच के आसपास है और गैर खाद्य गतिविधि ट्यूब के अंत में धागा डालने के प्लग खोलने और प्रयोग के दौरान भागने से रोकने के उड़ के बीच पकड़ो, जबकि उसी में समय ट्यूब में airflow की इजाजत दी. वैकल्पिक रूप से, छोटे छेद (Trikinetics इंक) के साथ प्लास्टिक की टोपियां को खोलने बंद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  5. सुनिश्चित करें कि ट्यूबों अपने पक्ष पर निर्धारित कर रहे हैं जब तक उड़ जागता है, या किसी और वहाँ भोजन करने के लिए अटक मक्खी का खतरा है.
  6. गतिविधि पर नज़र रखता में ट्यूब डालें. Trikinetics पर नज़र रखता है नए, अधिक कॉम्पैक्ट मॉडल (Trikinetics DAM2 और DAM2-7) के साथ, यह रबर बैंड के साथ जगह में ट्यूबों पकड़ करने के लिए सुनिश्चित करें कि अवरक्त किरण केंद्र की स्थिति पर ट्यूब गुजरता के लिए आवश्यक है.
  7. इन्क्यूबेटरों में गतिविधि पर नज़र रखता रखो और उन्हें टेलीफोन के तारों के माध्यम से डेटा संग्रह प्रणाली को हुक. बांध सिस्टम संग्रह सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए यकीन है कि सब पर नज़र रखता आदी रहे हैं ठीक से और उनमें से प्रत्येक से डेटा एकत्र किया जा रहा है की जाँच करें. मॉनिटर प्रत्येक गिलास गतिविधि के केंद्र ट्यूब भर प्रकाश अवरक्त बीम का उत्सर्जन करता है. मक्खियों की हरकत गतिविधि कच्चे द्विआधारी डेटा है जहाँ "एक" हर बार अवरक्त किरण टूटी हुई है या एक 'शून्य' दर्ज की गई है जिसमें अवरक्त बीम टूटा नहीं है दर्ज की गई है के रूप में दर्ज हैं.

5. प्रायोगिक डिजाइन Circadian आवधिकता और आयाम के निर्धारण के लिए डेटा रिकार्ड

  1. मक्खियों सिंक्रनाइज़ कर रहे हैं और उन्हें 2-5 पूर्ण दिनों के लिए वांछित / प्रकाश अंधेरे (एलडी) और तापमान शासन को उजागर कर entrained. सबसे अधिक इस्तेमाल किया entrainment हालत 12 घंटे / प्रकाश अंधेरे चक्र प्रकाश / 12 बजे अंधेरे (00:12 LD) 25 डिग्री सेल्सियस है यह आम तौर पर स्वीकार किए जाते हैं मानक हालत अनिवार्य रूप से सोचा था कि ड्रोसोफिला एफ्रो - भूमध्य स्थानों से उत्पन्न पर आधारित है. जब circadian लय का अध्ययन वहाँ कुछ पदावली है कि एक की जरूरत के साथ परिचित बनने के लिए है. इस प्रोटोकॉल के लिए प्रासंगिक है, समय है जब रोशनी पर जाने इनक्यूबेटर में zeitgeber 0 समय (ZT0) और अन्य सभी बार है कि मूल्य (उदाहरण के लिए, 12:12 LD चक्र में रिश्तेदार हैं के रूप में परिभाषित किया गया है, ZT12 समय है जब रोशनी बंद कर दिया जाता है). मानक 12:12 LD शर्तों के तहत, जंगली प्रकार ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर आमतौर पर गतिविधि के दो मुकाबलों के प्रदर्शन, एक के आसपास केंद्रित ZT0 "सुबह" पीक और ZT12 चारों ओर एक और "शाम" चोटी (चित्रा 3A) करार दिया करार दिया. सुबह और शाम मुकाबलों अंतर्जात घड़ी द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं लेकिन वहाँ भी कर रहे हैं "डराना" प्रतिक्रियाओं / प्रकाश अंधेरे संक्रमण के जवाब में गतिविधि के क्षणिक फटने कर रहे हैं. Entrainment के दो दिनों का न्यूनतम है और उदाहरण के लिए, बड़ी स्क्रीन है कि अधिक समय लेने वाली हैं और लगातार अंधेरे में मुक्त चल अवधि (नीचे देखें, चरण 2) को मापने की दिशा में सक्षम हैं में इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, अगर आप एक दैनिक प्रकाश अंधेरे चक्र के दौरान गतिविधि पैटर्न का अध्ययन करने में रुचि रखते हैं, यह LD में 4-5 दिनों के लिए मक्खियों को बनाए रखने के बेहतर है तो के रूप में और अधिक डेटा प्राप्त करने के लिए. मूलतः, से पिछले दो मक्खियों की संख्या या अंतिम डेटा विश्लेषण में LD दिनों की संख्या (जैसे, पूल डेटा में वृद्धिLD हरकत गतिविधि के लायक दिन) और अधिक विश्वसनीय प्रतिदिन गतिविधि प्रोफाइल और माप (उदाहरण के लिए, सुबह या शाम के शिखर के समय) उत्पन्न करेगा. इसके अलावा, गतिविधि के दैनिक वितरण (photoperiod) दिन लंबाई और तापमान के एक समारोह के रूप में बदलता है. Photoperiod या मानक से तापमान में फेरबदल के लिए एक प्रमुख कारण है, अगर एक अध्ययन कैसे दैनिक गतिविधि पैटर्न मौसमी अनुकूलन (2007 जैसे चेन एट अल) से गुजरना चाहता है ड्रोसोफिला भी दैनिक तापमान चक्र (जैसे Glaser और 2005 Stanewsky entrained जा सकता है. Sehadova एट अल 2009). तापमान चक्र है कि केवल 2-3 के हिसाब से बदलती डिग्री सेल्सियस चढ़ना गतिविधि लय के लिए पर्याप्त हैं.
  2. मुफ्त चल हरकत गतिविधि लय लगातार अंधेरे और तापमान की शर्तों के तहत entraining अवधि के बाद समाप्त हो गया है (ऊपर देखने के लिए, चरण 1) मापा जाता है. प्रकाश चक्र के लिए सेटिंग LD कि इस तरह के प्रयोग के बाद दिन डीडी के पहले दिन का प्रतिनिधित्व करता है के अंतिम दिन पर अंधेरे चरण में कभी भी बदला जा सकता है. डीडी डेटा संग्रह के सात दिनों के circadian अवधि और मक्खियों के आयाम (उदाहरण के लिए, या लय की शक्ति और ताकत) की गणना करने के लिए पर्याप्त है. सामान्य में, कम से कम 16 मक्खियों का एक नमूना आकार के लिए एक विशेष जीनोटाइप के लिए विश्वसनीय मुक्त चल अवधि प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. यहां तक ​​कि अगर एक ही दीन गतिविधि को मापने में दिलचस्पी है, यह अभी भी सबसे अच्छा है अंतर्जात अवधि में परिवर्तन LD में गतिविधि के दैनिक वितरण में परिवर्तन कर सकते हैं के रूप में 'मक्खियों डीडी में मुक्त चल अवधि को मापने. उदाहरण के लिए, लंबी अंतर्जात के समय के साथ मक्खियों आमतौर पर LD में देरी शाम चोटियों प्रदर्शन (उदाहरण के लिए, चित्रा 4).
  3. प्रयोग के समापन पर, कच्चे द्विआधारी डेटा बांध सिस्टम सॉफ्टवेयर का उपयोग एक पोर्टेबल डेटा भंडारण युक्ति, जैसे USB कुंजी पर डाउनलोड किया जाता है एकत्र की.
  4. कच्चे द्विआधारी डेटा बांध Filescan102X (Trikinetics इंक) का उपयोग संसाधित है और 15 और 30 मिनट के डिब्बे में अभिव्यक्त किया जब circadian पैरामीटर, या 1 से 5 मिनट के डिब्बे का विश्लेषण जब नींद / आराम पैरामीटर का विश्लेषण. वर्तमान में, निष्क्रियता के पांच सन्निहित मिनट / ड्रोसोफिला में नींद और आराम के मानक परिभाषा (Hendricks एट अल 2000, हो और सहगल 2005 ).
  5. बांध सिस्टम पर एकत्र आंकड़ों का विश्लेषण करने के लिए, लेकिन हम केवल उन तरीकों नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता प्रदान करेगा वहाँ कई अलग अलग तरीके हैं. Microsoft Excel के जीनोटाइप अलग नमूना समूहों को असाइन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. FaasX (एम. Boudinot और एफ Rouyer, केंद्र में राष्ट्रीय डी ला Recherche Scientifique, Cedex Gif-sur-Yvette, फ्रांस) सॉफ्टवेयर या इन्सोम्नियाक (Matlab आधारित कार्यक्रम है, Leslie ऐशमोर, विश्वविद्यालय पिट्सबर्ग, फिलीस्तीनी अथॉरिटी) circadian की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है ( जैसे अवधि और बिजली) या नींद / (उदाहरण के प्रतिशत नींद, लंबाई डटकर बाकी मतलब) बाकी क्रमशः पैरामीटर.

6. प्रतिनिधि परिणाम

इस प्रोटोकॉल के पूरा होने पर, एक ही नियंत्रण जानवरों के संबंध में प्रायोगिक पशुओं के दोनों circadian और नींद मापदंडों की जांच करने के लिए सेट डेटा का उपयोग कर सकते हैं.

Circadian मापदंडों का विश्लेषण: शिक्षा LD या डीडी स्थितियों में कई दिनों से दैनिक हरकत गतिविधियों या मक्खियों की औसत गतिविधियों illustrating रेखांकन FaasX (चित्रा 3) का उपयोग करते हुए उत्पन्न किया जा सकता है है ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर आम तौर पर गतिविधि के दो मुकाबलों प्रदर्शन, एक ZT0 ( या सीटी के आसपास केंद्रित है. ) "सुबह" पीक और ZT12 (12 सीटी) कहा "शाम" चोटी के आसपास एक करार दिया. गतिविधियों के इन दो मुकाबलों अंतर्जात घड़ी द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं, और मुक्त चल डीडी शर्तों (3B चित्रा) में भी मनाया जा सकता है. इन गतिविधि चोटियों के समय में परिवर्तन को आसानी से शिक्षा रेखांकन में मनाया जा सकता है और अंतर्जात घड़ी के गुणों में परिवर्तन का संकेत हो सकता है. एक और संपत्ति है कि उचित घड़ी समारोह का संकेत है हरकत गतिविधि में अग्रिम वृद्धि LD चक्र में मनाया कि वास्तविक अंधेरे से प्रकाश या प्रकाश के लिए अंधेरे संक्रमण (चित्रा 3A, तीर) से पहले होता है. यह व्यवहार जंगली प्रकार मक्खियों (चित्रा 3A) में स्पष्ट रूप से मनाया जाता है, लेकिन ऐसे 0 (चित्रा 3C) (Konopka और Benzer, PNAS, 1971) के अनुसार अतालता म्यूटेंट में अनुपस्थित है. प्रति 0 म्यूटेंट के मामले में, मनाया "सुबह" और "शाम" LD में चोटियों विशुद्ध रूप से डराना / प्रकाश अंधेरे की स्थिति में अचानक परिवर्तन (जैसे 'clockless' मक्खियों पर्यावरण परिवर्तन की आशा नहीं की वजह से प्रतिक्रिया कर रहे हैं लेकिन केवल उन पर प्रतिक्रिया ). डीडी व्यवहार rhythmicity की हानि में और अधिक स्पष्ट है और आम तौर पर हरकत गतिविधि की सुबह हो या शाम चोटियों के कुल नुकसान (यानी गतिविधि और निष्क्रियता के यादृच्छिक मुकाबलों), के रूप में प्रति 0 मक्खियों (चित्रा 3 डी) में देखा में प्रकट होता है. शिक्षा रेखांकन के अलावा, हरकत गतिविधि डेटा डबल साजिश (FaasX) actogram, जहां डेटा के दो दिनों के sequentially प्रत्येक पंक्ति पर प्लॉट किए जाते हैं के रूप में प्रतिनिधित्व किया जा सकता है है, लेकिन पिछले दिन प्रोफ़ाइल दो गतिविधि के मूल्य दिनों की अगली पंक्ति (चित्रा शुरू ) 4. उदाहरण के लिए, LD1 और 2 टी की पहली पंक्ति पर प्लॉट किए जाते हैंवह actogram. अगली पंक्ति LD2 के एक दोहराने के साथ शुरू होता है और LD3 और इतने पर द्वारा पीछा किया है. इस प्रारूप के बाद, हरकत गतिविधि पूरे प्रयोग फैले डेटा actogram में सचित्र है. Actograms प्रत्येक व्यक्ति मक्खी के लिए प्लॉट किया जा सकता है है, या प्रत्येक मक्खी जीनोटाइप के लिए. शिक्षा रेखांकन अधिक actograms की एक लाभ यह है कि दैनिक गतिविधि लय की अवधि की लंबाई में परिवर्तन आसानी से नमूदार (चित्रा 4). शिक्षा रेखांकन और actograms पैदा करने के अलावा, डीडी हालत से हरकत गतिविधि डेटा FaasX करने के लिए प्रस्तुत किया जा सकता है अवधि साइकिल - पी सहित विभिन्न कार्यक्रमों के एक नंबर का उपयोग लंबाई की गणना.

नींद / आराम पैरामीटर का विश्लेषण नींद / ड्रोसोफिला में आराम (Hendricks एट अल 2000), जो निष्क्रियता के पांच सन्निहित मिनट है, एक हरकत गतिविधि assays से दर्ज आंकड़ों का विश्लेषण और इन्सोम्नियाक का उपयोग एकाधिक नींद मापदंडों की जांच कर सकते हैं की वर्तमान परिभाषा का उपयोग करके: (एल एशमोर), एक Matlab आधारित कार्यक्रम. समय है कि सो खर्च मक्खियों का प्रतिशत अलग अलग समय अंतराल पर गणना की जा सकती है, उदाहरण के प्रतिशत हर घंटे (चित्रा 5A), या 12 घंटे (चित्रा 5B) सो जाओ. अन्य अधिक सामान्य नींद मानकों कि जांच की जा शामिल कर सकते हैं लंबाई डटकर बाकी (चित्रा 5C) ​​और जगा गतिविधि गिनती (चित्रा 5D) मतलब है. मीन नींद / लंबाई डटकर बाकी कैसे समेकित नींद है की एक उपाय है और नींद की गुणवत्ता का वर्णन कर सकते हैं. जागो गतिविधि, के रूप में अपने नाम से पता चलता है, गतिविधि दर का एक उपाय है जब मक्खियों जाग रहे हैं. यह पैरामीटर है कि वास्तव में उन है कि या तो बीमार या अतिसक्रिय हैं बनाम नींद / आराम व्यवहार में प्रभावित हैं मक्खियों के बीच अंतर करने में मदद करता है. उदाहरण के लिए, मक्खियों कि बस बीमार हैं करने के लिए और अधिक सो क्योंकि वे के रूप में मोबाइल नहीं कर रहे हैं लग सकता है. इन मक्खियों के लिए, अपने जाग गतिविधि के संबंध में कम हो सकता है के लिए पशुओं को नियंत्रित करेंगे.

चित्रा 1
चित्रा 1: फ़्लोचार्ट ड्रोसोफिला में हरकत गतिविधि लय परख करने की क्रिया के लिए प्रमुख कदम रूपरेखा प्रक्रियाओं बाईं तरफ प्रस्तुत कर रहे हैं जबकि सहायक टिप्पणियों सही पर प्रदान की जाती हैं. . करने के लिए आवश्यक पार और आनुवंशिक जोड़तोड़ प्रदर्शन करने के लिए विशिष्ट प्रयोगों के लिए सही जीनोटाइप के साथ मक्खियों प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय की मात्रा प्रकृति और प्रयोग के डिजाइन पर निर्भर करता है चर रहा है. दो तारांकनों (*) के साथ चिह्नित कदम जब वयस्क मक्खियों वरीयता प्राप्त / प्रयोग के लिए उपयुक्त उम्र (1 से 5 पुराने दिनों) के progenies उत्पन्न करने के लिए mated की जरूरत के लिए समय सीमा प्रदान करते हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2: तारों आरेख ड्रोसोफिला हरकत गतिविधि डेटा बांध सिस्टम का उपयोग कर संग्रह के लिए विभिन्न घटकों के बीच कनेक्शन illustrating एक समर्पित कंप्यूटर ड्रोसोफिला की हरकत गतिविधि मायने रखता है रिकॉर्ड करने के लिए प्रयोग किया जाता है.. गतिविधि पर नज़र रखता है तापमान और प्रकाश (बंद / पर) नियंत्रण के साथ सुसज्जित इन्क्यूबेटरों के अंदर रखे जाते हैं. कंप्यूटर भी इन्क्यूबेटरों में / ऑफ में प्रकाश की समय नियंत्रण यदि प्रकाश व्यवस्था की शक्ति का स्रोत विद्युत आपूर्ति इकाई (वैकल्पिक) के लिए कांटे की शकल कर सकते हैं करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कंप्यूटर और गतिविधि पर नज़र रखता है / इन्क्यूबेटरों के बीच संचार को बिजली की आपूर्ति अंतरफलक इकाई द्वारा प्रबंधित कर रहे हैं. कंप्यूटर, बिजली की आपूर्ति इकाई और इन्क्यूबेटरों (अगर प्रकाश नियंत्रण कंप्यूटर के स्वतंत्र है) एसी शक्ति आउटलेट के माध्यम से UPC से जुड़े हैं प्रकाश चरण के दौरान गतिविधि की निर्बाध निगरानी और सतत प्रकाश सुनिश्चित. यह सुविधा में आपातकालीन बैकअप सर्किट सभी बिजली के उपकरणों से कनेक्ट करने के लिए, यदि उपलब्ध है की सिफारिश की है.

चित्रा 3
चित्रा 3: शिक्षा FaasX लयबद्ध जंगली प्रकार मक्खियों (0 प्रति w के एक + प्रति transgene ले जाने मक्खियों) (एक और बी) बनाम अतालता w के प्रति 0 म्यूटेंट (सी और डी) के दैनिक हरकत गतिविधि लय दिखाने का उपयोग करने के लिए उत्पन्न रेखांकन पुरुष मक्खियों रखा गया था. 25 में डिग्री सेल्सियस और 12:12 LD में 4 दिनों के लिए entrained चक्र (प्रकाश: अंधेरे) डीडी (लगातार अंधेरे) में सात दिनों के द्वारा पीछा किया. प्रत्येक उड़ लाइन के लिए 15 मिनट डिब्बे में, व्यक्तिगत मक्खियों (n 32>) की हरकत गतिविधि का स्तर मापा गया और फिर उस लाइन के लिए एक समूह प्रोफ़ाइल प्रतिनिधि प्राप्त औसत है. ए और सी गतिविधि / प्रकाश अंधेरे चक्र में दूसरे और तीसरे दिन (2-3 LD) के औसत से उत्पन्न जबकि बी और डी गतिविधि लगातार अंधेरे में दूसरे और तीसरे दिन के औसत (2-3 डीडी से उत्पन्न डेटा दिखाने के लिए डेटा दिखाने के लिए ). अनुलंब पट्टियाँ गतिविधि (मनमाना इकाइयों में) प्रकाश (प्रकाश ग्रे) अवधि या अंधेरे अवधि (अंधेरे ग्रे) के दौरान 15 मिनट के डिब्बे में दर्ज प्रतिनिधित्व करते हैं. LD शिक्षा रेखांकन के तल पर क्षैतिज सलाखों, सफेद, पर रोशनी, काले, बंद रोशनी. ZT0 और ZT12 photoperiod के शुरू अंत क्रमशः का प्रतिनिधित्व करते हैं. CT0 और CT12 repr, डीडी शिक्षा रेखांकन के लिएलगातार अंधेरे परिस्थितियों में व्यक्तिपरक दिन के प्रारंभ और अंत में, ग्रे पट्टी द्वारा चिह्नित esent. पैनल ए, एम = सुबह चोटी, ई = शाम चोटी. पैनल में तीर एक सुबह और शाम को जंगली प्रकार मक्खियों, जो 0 अतालता मक्खियों प्रति w में अनुपस्थित रहे हैं में मनाया चोटियों के अग्रिम व्यवहार का प्रतिनिधित्व करते हैं.

चित्रा 4
चित्रा 4: डबल साजिश FaasX जंगली प्रकार, संक्षेप में, या लंबी अवधि के साथ मक्खियों के हरकत गतिविधि डेटा illustrating के सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए उत्पन्न actogram पुरुष मक्खियों 25 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था और आठ द्वारा पीछा 12:12 LD चक्र में 4 दिनों के लिए entrained लगातार अंधेरे (डीडी) में मुक्त चल (टी) अवधि FaasX में साइकिल - पी का उपयोग कर की गणना के लिए दिन. तीन जंगली प्रकार की अवधि के साथ उड़ लाइनों [0 प्रति w, प्रति +; प्रति 0 उत्परिवर्ती + transgene प्रति ले जाने के लंबी अवधि [0 प्रति w; प्रति (S47A), 0 प्रति उत्परिवर्ती (S47A) transgene प्रति ले जाने] कम, और अवधि [ w 0 प्रति; (S47D) प्रति;] 0 उत्परिवर्ती प्रति transgene (S47D) ले जाने के प्रति यहाँ दिखाए जाते हैं (Chiu एट अल 2008.). X-अक्ष क्रमशः LD या डीडी में ZT या सीटी समय का प्रतिनिधित्व करता है, और वाई अक्ष गतिविधि (मनमाना इकाइयों) की गिनती 15 मिनट डिब्बे में अभिव्यक्त का प्रतिनिधित्व करता है. लाल बिंदीदार लाइनों प्रयोगों के प्रत्येक दिन के लिए शाम चोटियों कनेक्ट. ध्यान दें कि LD दौरान शाम चोटी 'मजबूर' 24 घंटा LD चक्र के साथ synchrony बनाए रखने के लिए, जबकि डीडी में मुक्त चल अवधि 24 घंटे से विचलित कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, शाम गतिविधि का संक्षिप्त अवधि के साथ मक्खियों के लिए समय पहले डीडी (जब एक 24 घंटा समय के पैमाने के खिलाफ प्लॉट किए जाते हैं, जैसा कि यहाँ दिखाया गया है) में एक के बाद एक दिन पर होते हैं, जबकि सही करने के लिए एक बदलाव मक्खियों के लिए लंबे समय के साथ मनाया जाता है अवधि.

चित्रा 5
चित्रा 5: मक्खियों ड्रोसोफिला में नींद मापदंडों बढ़ाता (केण्टन एस, सीएस) को 25 डिग्री सेल्सियस पर मानक 12:12 LD चक्र से अवगत कराया गया Insomniac (एल एशमोर) के लिए डेटा और Microsoft Excel में यहाँ दिखाया चार्ट उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था की प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया गया था. कम से कम 70 मक्खियों के लिए समूह के औसत और त्रुटि सलाखों (मतलब की मानक त्रुटि) दिखाया प्राप्त करने के लिए जमा थे. (ए) आधारभूत हर घंटे गणना की नींद; दिखाया एक प्रतिनिधि दैनिक चक्र है. (बी) के प्रतिनिधि दैनिक चक्र के आधारभूत नींद हर 12 घंटे की गणना. (सी) प्रत्येक बाकी की औसत लंबाई मुक्केबाज़ी में 12 घंटे की वेतन वृद्धि में गणना. (डी) जागने गतिविधि की दर हर 12 घंटे की गणना.

Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हम ड्रोसोफिला हरकत गतिविधि लय, मक्खी circadian घड़ियों घड़ी समारोह के मानक readout के रूप में प्रयोग किया जाता है की एक विश्वसनीय व्यवहार उत्पादन मापने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन किया. इस परख उपन्यास घड़ी म्यूटेंट (. जैसे Konopka और Benzer 1971, Dubruille एट अल २,००९) के लिए बड़े पैमाने पर स्क्रीन में इस्तेमाल किया गया है और लगातार काटना और vivo में घड़ी समारोह को समझने के लिए इस्तेमाल किया. यह भी मक्खियों में नींद जगा चक्र का अध्ययन इस्तेमाल किया गया, हालांकि हाल ही में रिपोर्ट का सुझाव है कि वीडियो डिजिटल विश्लेषण हरकत गतिविधि लय का उपयोग की तुलना में नींद बढ़ाता में और अधिक विश्वसनीय है (Zimmerman एट अल 2008 .). जब हरकत गतिविधि लय का उपयोग करने के लिए नींद का विश्लेषण, दिन में नींद का प्रतिशत overestimated हो जाते हैं.

सफलता और इस प्रोटोकॉल के reproducibility सुनिश्चित करने के लिए, यह परख मक्खियों कि उम्र, आनुवंशिक पृष्ठभूमि में समान हैं के लिए महत्वपूर्ण है, और एक ही परिस्थितियों में पाला है, के रूप में फल में व्यवहार phenotypes जैसे circadian rhythmicity और नींद / आराम गतिविधि मक्खियों बहुत संवेदनशील होते हैं इन सभी कारकों के लिए. जब एक ही प्रयोग के लिए एकाधिक इन्क्यूबेटरों का उपयोग, यह सुनिश्चित करें कि सभी इन्क्यूबेटरों प्रत्याशित तापमान पर हैं के बाद से कुछ circadian मापदंडों तापमान के एक समारोह के रूप में बदल सकते हैं बनाने महत्वपूर्ण है. सावधानी से एक शब्द जब मक्खियों के साथ काम करने के लिए इन्क्यूबेटरों की खरीद पर विचार नहीं सभी समान बनाया जाता है. जब तक हम वहाँ कई विकल्प हैं किसी विशेष इकाई की सिफारिश करने में संकोच. कंपनियों है कि ड्रोसोफिला काम के लिए इन्क्यूबेटरों बेचते हैं खोजने के लिए एक अच्छा संसाधन <www.flybase.org> पर प्रदान की जाती है . कुछ कंपनियों ने भी "ड्रोसोफिला circadian इन्क्यूबेटरों" बेचते हैं, जिसमें अतिरिक्त सुविधाओं को उपलब्ध हैं, जैसे पहले से ही Trikinetics प्रणाली और तापमान ramping (जैसे, Tritech) के लिए वायर्ड. महत्वपूर्ण सुविधाएँ प्रतिदिन प्रकाश नियंत्रण और ड्रोसोफिला के शारीरिक रेंज में अच्छा तापमान नियंत्रण के लिए करने की क्षमता शामिल (15-30 ~ डिग्री सेल्सियस) . मूल्य और इन्क्यूबेटरों का आकार बहुत भिन्न है, लेकिन नए Trikinetics से गतिविधि पर नज़र रखता है के साथ, यहाँ तक कि छोटे इन्क्यूबेटरों इन उपकरणों की काफी संख्या को समायोजित कर सकते हैं. इसके अलावा, हालांकि, आर्द्रता नियंत्रण के साथ इन्क्यूबेटरों में इस्तेमाल किया जा सकता है, यह जोड़ा सुविधा के रूप में लंबे समय के रूप में आवश्यक आप पानी के साथ एक छोटे पैन जगह नमी (50-70% ठीक है) प्रदान नहीं है. अंत में, यद्यपि हम नियमित रूप से डेटा विश्लेषण के लिए इस प्रोटोकॉल में FaasX और इन्सोम्नियाक का उपयोग करने के लिए, वहाँ वैकल्पिक कार्यक्रमों और सॉफ्टवेयर उपलब्ध हैं (Rosato और Kyriacou 2006), जैसे (ActiMetrics) ClockLab, ब्राण्डैस ताल पैकेज (डी. व्हीलर, चिकित्सा, ह्यूस्टन के Baylor कॉलेज ), और MAZ (2007 Zordan एट अल.).

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम में मैं ई और NS061952 एनआईएच NIH34958 जे.सी. को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila activity monitor (DAM) Trikinetics Inc.; Waltham, MA DAM2 or DAM5 DAM2 monitors are more compact, and more can fit into a single incubator
Power supply interface unit (for DAM system) Trikinetics Inc.; Waltham, MA PSIU9 Includes PS9-1 AC Power Supply
Light controller Trikinetics Inc.; Waltham, MA LC6
Pyrex glass tubes Trikinetics Inc.; Waltham, MA PGT5, PGT7, and PGT10
Plastic activity tube caps Trikinetics Inc.; Waltham, MA CAP5 Yarn can be used instead of plastic caps.
DAM System data collection software Trikinetics Inc.; Waltham, MA Versions available for both Mac and PC
FaasX software Centre National de la Recherche Scientifique Only for Mac
Insomniac 2.0 software University of Pittsburgh School of Medicine Runs on Matlab. Can be used on both PC and Macintosh.
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. Percival incubator Percival Scientific, Inc. I-30BLL Interior space dimension:Width: 65cm;Height: 86cm;Depth: 55cm
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. DigiTherm Heating/Cooling Incubator with Circadian Timed Lighting and Timed Temperature Tritech Research, Inc. 05DT2CIRC001 Interior space dimension:Width: 36m;Height: 56m;Depth: 28cm
APC Smart-UPS 2200VA 120V (Emergency power backup unit) APC SU2200NET Output Power Capacity of 1600 Watts
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Bacto Agar BD Biosciences 214010
TissuePrep Paraffin pellets Fisher Scientific T565 Melting point 56°C-57°C
Block heater VWR international 12621-014

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References

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तंत्रिका विज्ञान 43 अंक circadian ताल हरकत गतिविधि ड्रोसोफिला अवधि नींद Trikinetics
लोकोमोटर गतिविधि परख के लिए अध्ययन circadian rhythms और पैरामीटर्स नींद<em> ड्रोसोफिला</em
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Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila. J. Vis. Exp. (43), e2157, doi:10.3791/2157 (2010).

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