Summary
Nous décrivons les procédures d'enregistrement quotidien des rythmes d'activité locomotrice des
Abstract
La plupart des formes de vie présentent des rythmes quotidiens cellulaire, des phénomènes physiologiques et comportementaux qui sont entraînés par circadien endogène (≡ 24 h) stimulateurs cardiaques ou des horloges. Dysfonctionnements dans le système circadien humain sont associés à de nombreuses maladies ou troubles. Beaucoup de progrès vers notre compréhension des mécanismes sous-jacents des rythmes circadiens a émergé de cribles génétiques permettant un rythme facile à mesurer de comportement est utilisé comme une lecture de la fonction horloge. Les études utilisant la drosophile ont apporté une contribution fondamentale à notre compréhension des bases cellulaires et biochimiques sous-jacentes des rythmes circadiens. Le comportement standard de circadien de lecture mesurées chez la drosophile est l'activité locomotrice. En général, le système de surveillance implique des dispositifs spécialement conçus qui peuvent mesurer les mouvements de locomotion de la drosophile. Ces dispositifs sont logés dans des incubateurs à environnement contrôlé situé dans une chambre noire et sont basées sur l'utilisation de l'interruption d'un faisceau de lumière infrarouge pour enregistrer l'activité locomotrice des mouches individuelles contenues à l'intérieur de petits tubes. Lorsqu'ils sont mesurés dans de nombreux jours, la drosophile présentent des cycles quotidiens de l'activité et l'inactivité, un rythme de comportement qui est régi par endogènes de l'animal système circadien. La procédure générale a été simplifiée avec l'avènement des appareils locomoteurs commercialement disponibles surveillance de l'activité et le développement de logiciels pour l'analyse des données. Nous utilisons le système de Trikinetics Inc, qui est la procédure décrite ici et il est actuellement le système le plus couramment utilisé dans le monde entier. Plus récemment, les dispositifs de surveillance ont même été utilisés pour étudier le comportement du sommeil chez la drosophile. Parce que le quotidien des cycles veille-sommeil des mouches peuvent être mesurées simultanément et seulement 1 à 2 semaines de données en continu de l'activité locomotrice est généralement suffisant, ce système est idéal pour les grands écrans pour identifier drosophile manifestant altéré les propriétés du rythme circadien ou dormir.
Protocol
La conception globale du protocole est illustré dans la figure 1. La configuration pour la surveillance de l'activité locomotrice utilisant des dispositifs logés dans des incubateurs à environnement contrôlé situé dans une chambre noire doit être assemblées en premier. Une fois que c'est terminé, le système peut être utilisé dans toutes les mesures ultérieures de locomotion rythme d'activité. Pour chaque expérience, on a (i) préparer les animaux de laboratoire, qui pourrait inclure générer des animaux transgéniques ou de la mise en place des croix nécessaires, (ii) de préparer l'activité tubes de verre contenant une source de nourriture, (iii) la charge des mouches dans des tubes de l'activité et de connecter des moniteurs d'activité au système de collecte de données, et (iv) enregistrer et analyser les données en utilisant des logiciels différents selon les paramètres du rythme circadien du sommeil ou l'on veut examiner. Ici, nous définissons le "départ" de l'expérience comme le moment où des mouches dans les dispositifs de surveillance sont d'abord exposés à la lumière désirée / conditions sombres dans les incubateurs de l'environnement.
1. Mise en place du Système de Surveillance activité locomotrice
- Le système de surveillance implique de nombreux équipements tels que des dispositifs de surveillance de spécialité, des incubateurs d'environnement qui ont la capacité de contrôle de la lumière diurne, des dispositifs de collecte de données, les ordinateurs et les matériels périphériques tels que le câblage pour relier les dispositifs de surveillance pour les appareils de collecte de données (figure 2). Instructions pour l'installation du Activity Monitoring drosophile (DAM) du système de collecte des données sont fournies par le fabricant (Trikinetics Inc.)
- Pour loger le système de surveillance de l'activité locomotrice, choisissez une pièce bien aérée, de préférence équipé d'un système de contrôle de température, d'être une chambre noire dédiée. Avec tous les systèmes électriques impliqués (par exemple l'informatique et les incubateurs) fonctionnant pendant une période prolongée de temps au sein d'une petite pièce et confiné, la chaleur excessive peut être générée conduisant à une augmentation rapide de la température de la pièce. Par conséquent, les incubateurs seront accablés par la charge de travail supplémentaire pour maintenir la température et plus susceptibles d'échouer au contrôle de la température. Nous constatons que même pour bien aérés, le passage de l'air conditionné en été à la chaleur dans l'automne / hiver, il peut être difficile de maintenir la température ambiante. Dans de tels cas une ventilation supplémentaire aurait pu être installé dans la chambre noire pour réduire le risque de surchauffe. En outre, il est préférable de désactiver incubateurs qui ne sont pas utilisés pour minimiser la production de chaleur inutile.
- Sceau de la salle à partir de sources de lumière externe. L'entrée peut être bouclé avec un porte tournante ou un rideau noir. Nous préférons une porte tournante car cela minimise les chances de la lumière indésirable dans la chambre noire. A l'intérieur la chambre noire, il n'est pas nécessaire de travailler complètement dans l'obscurité comme des mouches des fruits système circadien n'est pas sensible à la lumière infrarouge (et est beaucoup moins sensible à la lumière rouge par rapport à la lumière vert / bleu). Dans les cas où nous devons voir dans la chambre noire, mais encore veulent maintenir l'obscurité totale (par exemple, rapidement enlevant ou en ajoutant un dispositif de surveillance dans un incubateur qui est dans sa phase sombre), nous utilisons simplement une lampe torche standard qui est recouvert d'un rouge filtre. Alternativement ou en plus, si votre chambre noire a des lampes fluorescentes, les couvrir avec un papier filtre rouge ou avoir une lampe de bureau autonome à incandescence recouverte d'un papier filtre tel. Il est hautement improbable que l'exposition des mouches dans le noir à des expositions très brèves (quelques secondes) de la lumière rouge aura une incidence sur leurs horloges circadiennes. Aussi, bien que le système circadien de la drosophile est très sensible à la lumière visible, nous ne pensons pas grince peu de lumière dans la chambre noire sera consécutifs; en tout cas, une bonne pratique consiste à garder les portes incubateur qui surveille la maison de l'ouverture que lorsque nécessaires. En outre, seuls ouvrent un incubateur à un moment, ce qui réduira la possibilité d'un incubateur sur sa phase sombre étant exposés à la lumière d'un incubateur sur sa phase de lumière.
- Achat d'un approvisionnement ininterrompu de puissance (onduleur) unité d'urgence de sauvegarde qui a suffisamment de capacité de puissance pour alimenter les composants du système de surveillance de l'activité en cas de surtension, pointe, ou de panne de courant dans le bâtiment. Connectez l'onduleur de secours d'urgence pour le circuit de secours de l'immeuble, si disponible. Soyez conscient que même si votre équipement est branché sur une prise d'urgence pendant une panne d'électricité peut y avoir une courte période de transition que le système passe à la puissance d'urgence. Pendant cette transition, perte de puissance, même pour quelques secondes peut conduire à des ordinateurs fermant les lumières dans l'incubateur étant éteint. Ainsi, il est important de s'assurer que les ordinateurs utilisés pour recueillir les données d'activité et le système de contrôle des lumières dans l'incubateur ne sont pas seulement accroché dans l'alimentation de secours, mais aussi un onduleur. Si le système contrôle de l'éclairage dans l'incubateur n'est pas directement réglementée par l'incubateur (dans la plupart des cas, il est), puis il suffit de brancher l'incubateur dans l'émergencele pouvoir NCY sans onduleur, comme la perte du pouvoir pendant quelques secondes n'affectera pas la température de la chambre. Notez que, en général un dispositif UPS ne garder votre équipement course pour 5-30 min en l'absence de pouvoir; son but principal est de protéger contre la perte temporaire du pouvoir pendant la transition de régulier à l'alimentation de secours.
- Configurez un ordinateur, PC ou Macintosh, entièrement dédié à la collecte de données et / ou pour le contrôle de la lumière des incubateurs. Puisque le système DAM sera exécuté tous les temps et sans surveillance, il est recommandé que cet ordinateur un logiciel installé minimale, de préférence pas de connexion réseau pour minimiser le risque de s'écraser. En outre, le système a besoin de stockage de données portables, lecteur zip, par exemple, graveur CD / DVD ou USB, pour permettre le téléchargement des données collectées pour analyse ultérieure.
- Manuellement les lignes téléphoniques du réseau parfaitement autour des rayonnages des incubateurs à environnement contrôlé pour permettre à l'aise de brancher / débrancher des moniteurs d'activité. Les lignes téléphoniques standard, des adaptateurs, et les répartiteurs peuvent être achetés dans les magasins d'électronique commerciale et utilisés. Mettre en place plusieurs lignes téléphoniques d'une façon telle qu'elles vont converger en une seule ligne principale et s'étendent hors de l'incubateur de se connecter à l'ordinateur.
- Connectez les dispositifs de surveillance à l'intérieur du incubateurs à l'ordinateur via une unité d'interface d'alimentation (aka boîte bleue à partir Trikinetics Inc), qui sert à alimenter le moniteur d'activité (Trikinetics Inc) via la ligne téléphonique. Cette unité d'interface d'alimentation agit aussi comme une interface pour transférer des données de commutation de la ligne téléphonique à un câble USB. Contrôleur de la lumière en option dans la même unité dans laquelle le cordon d'alimentation du système d'éclairage incubateur peut être connecté, est disponible pour permettre le contrôle du programme d'éclairage circadien incubateur via l'ordinateur.
- Masque de lumière des sources possibles de LED de dispositif électronique ou mal joint pépinière porte avec du ruban de canard ou tissu noir pour assurer free-running rythmes sont mesurés en l'absence de la lumière indésirable.
2. Préparation des animaux d'expérimentation
- Phénotypes comportementaux chez les mouches des fruits tels que la rythmicité circadienne et du sommeil / repos d'activité sont très sensibles aux différences génotypiques et l'âge des animaux d'essai (Koh et al. 2006). Par conséquent, il est essentiel d'évaluer ces phénotypes en utilisant des animaux de contrôle appropriées qui sont élevés dans les mêmes conditions environnementales et du même âge. En outre, il ya un dimorphisme sexuel dans la rythmicité circadienne (Helfrich-Foster, 2000). La pratique générale est d'utiliser les mouches adultes masculins qui sont élevés à 25 ° C et entre 1 à 5 jours, pour les dosages de l'activité locomotrice. Homme vole au lieu de mouches femelles sont traditionnellement utilisés en raison de ponte activité aura une incidence sur la mesure réelle de l'activité locomotrice. En raison de dimorphisme sexuel, parfois doser mouches femelles pourrait être instructif. Aliments contenant du simple 5% de saccharose et 2% d'agar Bacto permettra d'éviter les œufs des femelles vierges non de développer et de déplacement des larves écloses de causer compte l'activité erronée. Alternativement, les mouches femelles vierges peuvent être utilisés même si il pourrait y avoir des différences dans les profils d'activité entre accouplés et femelles vierges (Helfrich-Forster, J. Biol. Rythmes 2000).
- Lors de l'examen du rythme circadien et le sommeil / repos paramètres spécifiques des mouches mutantes d'intérêt, il est prudent de se croiser le stock mutants avec la souche de type sauvage de la même origine génétique, par exemple, ou w1118 yw. Cela permettra d'éliminer les modificateurs deuxième site génétique qui pourrait éventuellement le masque phénotype circadien ou le sommeil / repos. Comme il n'ya pas de crossing-over chez les hommes la drosophile, il est préférable d'effectuer le croisement en croisant les femelles mutantes avec les mâles de type sauvage. La souche de type sauvage servira aussi le contrôle approprié pour l'expérience. Semences à la fois le contrôle de type sauvage et mouches mutantes dans le même temps en standard drosophile alimentaires environ 10 à 14 jours avant l'expérience du rythme de l'activité locomotrice (voir Centre de Bloomington Stock drosophile pour la recette alimentaire; http://flystocks.bio.indiana.edu /). Dès l'éclosion de la descendance, de recueillir 1 à 5 jours anciens mouches mâles et les mettre de côté pour être utilisée pour les expériences.
- Avec les nombreux outils génétiques et des ressources telles que la surexpression, RNAi, et tissu-spécifique GAL4 lignes de mouche pilote disponible à partir des centres d'actions différentes dans le monde entier, il est possible de disséquer les effets de la surexpression ou de frapper vers le bas gènes spécifiques dans les tissus et temporelle spécifique manière (Brand et Perrimon 1993; McGuire et al 2004;.. Osterwalder et al 2001). Pour examiner circadiens et le sommeil / repos paramètres en utilisant cette approche, les mouches transportant constructions transgéniques avec des tissus spécifiques ou à la drogue inductible GAL4 pilote (mâles, par exemple) sont croisés aux mouches transportant constructions transgéniques avec des gènes cibles attachées à l'intervenant SAMU (par exemple les femelles vierges) environ 14 jours avant le début de l'activité locomotriceexpériences. Dès l'éclosion de la descendance, de recueillir 1 à 5 jours anciens mouches mâles et les mettre de côté pour être utilisée pour les expériences. Les lignées parentales utilisées pour la croix sont couramment utilisés comme témoins pour les expériences. Descendance de croisements des SAMU répondeur et GAL4 lignes pilote avec des mouches de type sauvage de la même origine génétique sont également des contrôles appropriés.
- Comme indiqué dans les étapes (2) et (3), la longueur du temps nécessaire pour la préparation des animaux de laboratoire varie considérablement selon la nature et la conception de l'expérience. Dans le cas où les animaux transgéniques doivent être générés ou si les régimes traversant besoin d'être exécutées, plus de temps sera évidemment nécessaire. Pour des raisons logistiques, il faut environ 14 jours à 25 ° C pour la drosophile à développer à partir d'oeufs de mouches adultes.
3. Préparation des tubes activité
- Tubes d'activité représentent l'habitat de la mouche pendant l'expérience. Ils sont minces (environ 5 mm de diamètre; noter, Trikinetics offre des tailles différentes selon les espèces de drosophiles à doser) 5 tubes en verre mm qui contiennent une substance alimentaire à une extrémité et branché avec un fil ou la prise en plastique à l'autre bout. Depuis des tubes de verre d'activité peuvent être réutilisées plusieurs fois, nous allons décrire les procédures de préparation en utilisant des tubes utilisés activité / nettoyés à partir d'expériences précédentes comme point de départ. Si vous utilisez des tubes nouvelle activité, il suffit de passer à l'étape (11).
- Il est préférable d'utiliser des tubes d'activité qui sont fraîchement réalisés depuis la nourriture à l'intérieur des tubes a une tendance à se dessécher et est contaminé par des champignons des heures supplémentaires même si stocké à 4 ° C. Ils sont généralement préparés quelques jours à une semaine d'avance sur le début de l'expérience. Il est donc important d'évaluer le nombre de tubes nécessaires pour chaque expérience avant de les préparer.
- Enlever les bouchons (plug fils ou en plastique) à partir des tubes d'activité utilisés et les mettre dans le bol en verre. Les tubes ne doivent remplir jusqu'à la moitié du bécher. Remplir le bécher avec l'eau du robinet, en veillant à plonger les tubes.
- Micro-ondes le bécher rempli de tubes de verre jusqu'à ce que l'eau arrive à ébullition rapide et complète pour faire fondre la cire et de la nourriture agar.
- Prenez garde que l'eau est chaude. Retirer le bécher du micro-ondes et remuer les tubes avec une spatule en plastique ou une pipette 10 ml pour permettre à la cire piégée à flotter vers le haut. Puis répétez l'étape (4).
- Retirer le bécher du micro-ondes et attendez qu'il refroidisse. Mettre le bécher dans la chambre froide (si elle est disponible) permettra d'accélérer le processus.
- Comme l'eau se refroidit, la cire se recueillir sur la surface de l'eau et se solidifie progressivement. Il suffit d'enlever la cire solidifiée par la main. Cela devrait se débarrasser de la plupart de la cire sur les tubes.
- Transférer les tubes de l'activité dans un bécher de nouveau avec de l'eau fraîche du robinet et répétez les étapes (4) et (5).
- Comme la plupart de la cire a été supprimé dans l'étape (7), il n'est pas nécessaire d'attendre que la cire se solidifier. Il suffit de vider l'eau du bécher et le transfert des tubes dans un autre bêcher de nouvelles. Prenez garde que l'eau est encore chaude.
- Répétez les étapes (4) et (5) pour la dernière fois. Verser l'eau hors du bécher et attendre pour les tubes d'activité à se refroidir.
- Chargez-les verticalement dans 250 ml ou béchers en verre de 500 ml. Assurez-vous qu'ils ne sont pas trop serrés. Les stériliser en utilisant un autoclave avec un cycle de séchage ou tout simplement utiliser un four de séchage pour sécher les tubes.
- Par ailleurs, pour préparer la nourriture à charger dans les tubes d'activité, faire une solution de saccharose à 5% (Sigma) et 2% d'agar Bacto (BD) dans de l'eau distillée ou l'eau du robinet. Autoclave pour stériliser la solution. La nourriture autoclavés peuvent être utilisées immédiatement ou stockées dans 4 ° C pendant une période de temps prolongée. Une fois que la nourriture se solidifie, on aura besoin d'ondes et de le liquéfier afin de remplir les tubes. Portion inutilisée de la nourriture peut être stocké et utilisé à une date ultérieure.
- La nourriture devrait idéalement se situer autour de 65 ° C lorsqu'il est utilisé pour remplir les tubes d'activité. Si elle est trop chaude, la condensation trop de s'accumuler à l'intérieur des tubes. Si elle n'est pas assez chaude, la nourriture va se solidifier avant que les tubes sont régulièrement remplis. Pour remplir les tubes d'activité avec de la nourriture, l'utilisation d'une pipette 10 ml à la pipette la solution des aliments liquides le long de la paroi intérieure du bécher en verre, en laissant la solution la nourriture pour remplir le tube d'activité à partir du bas, jusqu'à ce que les tubes sont remplis d'un tiers avec la solution. Agiter le bécher autour doucement pour s'assurer que tous les tubes, en particulier celles dans le milieu du bécher, sont uniformément rempli de solution alimentaire. Attendez que la nourriture pour solidifier complètement soit à température ambiante ou à 4 ° C. Passez à l'étape suivante une fois que la condensation à l'intérieur du tube de verre se dissiper.
- Pour enlever les tubes d'activité du bécher, pousser les tubes vers le fond du bécher et tordre les tubes dans le même temps afin que les aliments solidifié l'intérieur des tubes et le fonddu bécher vont se séparer. Prenez les tubes hors du bécher, de préférence comme un bouquet unique.
- Nettoyer les tubes un par un avec des serviettes en papier pour enlever l'excès de nourriture sur la surface externe des tubes. Réglez les tubes de côté dans un récipient propre.
- Prenez un chauffe-bloc de laboratoire généraux, sans le support du tube et le couvercle du chauffage ainsi soigneusement avec plusieurs couches de papier d'aluminium solide. Ajouter paraffine (cire) pastilles dans le chauffage en aluminium-alignés ainsi à fondre.
- Tenir les tubes à la fin de non-alimentaires et trempette à la fin la nourriture dans la cire fondue. Trempez la partie ciré dans un bécher rempli d'eau froide afin d'accélérer la solidification de la cire. Répéter une fois. Trempage des tubes ciré dans l'eau permettra d'éviter les tubes de coller ensemble.
- Les tubes peuvent être utilisées immédiatement ou stockées dans un récipient hermétique à 4 ° C pour une utilisation dans une semaine. Un stockage prolongé mènera à une déshydratation excessive de la nourriture. Si les tubes sont conservés à 4 ° C, veillez à les réchauffer à température ambiante en les laissant sur le banc de haut avant de l'utiliser.
4. Chargement mouches dans des tubes de l'activité et locomoteur Système de surveillance de l'activité
- Avant le chargement des mouches dans des tubes de l'activité, allumez les incubateurs qui seront utilisées pour abriter les surveille l'activité. Réglez la température en utilisant les contrôles mis en incubateur et le régime de la lumière / obscurité en utilisant le contrôleur de lumière DAM système ou le incubateurs propre système de contrôle de lumière en fonction de la conception expérimentale souhaitée. Le temps nécessaire pour charger les mouches dans les tubes d'activité devrait être suffisante pour que la température se stabilise.
- Anesthésier les mouches avec du dioxyde de carbone.
- Utilisez un pinceau fin pour doucement le transfert une mouche dans un tube d'activité.
- Prenez au milieu d'une seule pièce de fil qui est d'environ un demi-pouce avec une pince fine et insérer le fil dans l'extrémité non-alimentaire du tube activité pour boucher l'ouverture et à prévenir la volée de s'échapper lors de l'expérience, tout à la même le temps permet à l'air dans le tube. Alternativement, des bouchons en plastique avec de petits trous (Trikinetics, Inc) peut être utilisé pour fermer l'ouverture.
- Assurez-vous que les tubes sont fixés sur leurs côtés jusqu'à la volée se réveille, sinon on court le risque de la mouche coincé à la nourriture.
- Insérer les tubes dans les surveille l'activité. Avec le modèle plus récent, plus compact des moniteurs Trikinetics (Trikinetics DAM2 et DAM2-7), il est nécessaire de maintenir les tubes en place avec des élastiques afin de s'assurer que le faisceau infrarouge passe le tube à la position du centre.
- Mettez les moniteurs d'activité dans les incubateurs et les brancher au système de collecte de données via les fils téléphoniques. Vérifiez à l'aide du logiciel de collecte de DAM système pour s'assurer que tous les moniteurs sont branché correctement et les données sont recueillies auprès de chacun d'eux. Le moniteur émet faisceau de lumière infrarouge à travers le centre d'activité de chaque tube de verre. L'activité locomotrice des mouches sont enregistrées en tant que données binaires brutes où "l'on" est enregistré chaque fois que le faisceau infrarouge est rompu ou un «zéro» est enregistrée dans lequel le faisceau infrarouge n'est pas cassé.
5. Conception expérimentale pour enregistrer les données pour la détermination de la périodicité circadienne et Amplitude
- Les mouches sont synchronisés et entraînés en les exposant au régime désiré de lumière / obscurité (LD) et de la température pendant 2-5 jours pleins. La condition entraînement le plus couramment utilisé est un cycle lumière / obscurité de 12 heures de lumière / 12 heures sombres (12:12 DL) à 25 ° C. Cette condition standard généralement acceptée est essentiellement basée sur l'idée que la drosophile proviennent de Afro-équatoriale endroits. Lorsque l'on étudie les rythmes circadiens il ya une certaine phraséologie que l'on doit se familiariser avec. Concernant le présent Protocole, le moment où les lumières s'éteignent dans l'incubateur est défini comme le temps zeitgeber 0 (ZT0) et tous les autres moments sont relatives à cette valeur (par exemple, dans un cycle de 12h12 LD, ZT12 est le moment où le les lumières sont éteintes). Dans des conditions standard LD 12:12, de type sauvage de Drosophila melanogaster présentent généralement deux épisodes de l'activité, l'une centrée autour ZT0 appelée "le matin" de pointe et une autre autour ZT12 appelée "soirée" de pointe (figure 3A). Les combats matin et du soir sont contrôlés par l'horloge endogène mais il ya aussi "sursaut" des réponses qui sont des éclats passagère de l'activité en réponse à des transitions de lumière / obscurité. Deux jours de l'entraînement est le minimum et pourrait être utilisé, par exemple, dans de grands écrans qui sont plus longs et sont orientées vers la mesure de free-running périodes dans l'obscurité constante (voir ci-dessous, étape 2). Toutefois, si vous êtes intéressés à étudier les schémas d'activité quotidienne pendant un cycle lumière-obscurité, il est préférable de maintenir les mouches pendant 4-5 jours en LD afin d'obtenir davantage de données. Essentiellement, l'augmentation du nombre de mouches ou le nombre de jours de DL dans l'analyse des données finales (par exemple, les données provenant des deux dernièresjours de dollars de l'activité locomotrice LD) va générer plus fiable des profils d'activité diurne et mesures (par exemple, le calendrier de pointe du matin ou du soir). Par ailleurs, la distribution quotidienne de l'activité varie en fonction de la longueur du jour (photopériode) et la température. Une des principales raisons pour modifier la photopériode ou la température de la norme est si l'on voulait étudier comment les modèles d'activité quotidienne subissent une adaptation saisonnière (par exemple, Chen et al 2007). Drosophile peut aussi être entraînée à des cycles de température quotidienne (par exemple Glaser et Stanewsky 2005.; Sehadova et al. 2009). Les cycles de température qui varient de seulement 2-3 ° C sont suffisantes pour entraîner les rythmes d'activité.
- Libres sous les rythmes d'activité locomotrice est mesurée sous sombres constante et les conditions de température après la période d'entraîneur est terminée (voir ci-dessus, l'étape 1). Le réglage pour le cycle de lumière peuvent être modifiés à tout moment dans la phase d'obscurité sur le dernier jour de telle sorte que la journée subséquente de l'expérience représente le premier jour de JJ LD. Sept jours de DD de collecte des données est suffisante pour calculer la période circadienne et l'amplitude (par exemple, la puissance ou la force du rythme) de mouches. En règle générale, un échantillon d'au moins 16 mouches est nécessaire pour obtenir des données fiables free-running périodes d'un génotype particulier. Même si l'on s'intéresse uniquement à mesurer l'activité diurne, il est toujours préférable de mesurer les mouches "free-running périodes dans DD comme des changements dans la période endogène peut modifier la distribution quotidienne de l'activité en LD. Par exemple, les mouches avec de longues périodes endogènes présentent généralement des pics soir retardé en LD (par exemple, voir Figure 4).
- A l'issue de l'expérience, des données binaires brutes recueillies à l'aide du logiciel système DAM est téléchargé sur un périphérique de stockage de données portables, par exemple une clé USB.
- Les données binaires brutes sont traitées à l'aide DAM Filescan102X (Trikinetics, Inc) et résumée dans les 15 et 30 bacs minute lors de l'analyse des paramètres du rythme circadien, ou 1 à 5 bacs minute lors de l'analyse du sommeil / repos paramètres. Actuellement, à cinq minutes d'inactivité est contiguë à la définition standard de sommeil / repos chez la drosophile (Hendricks et al 2000;. Ho et Sehgal 2005).
- Il ya de nombreuses façons d'analyser les données recueillies sur le système de DAM, mais nous ne fournirons à ces méthodes couramment utilisées dans notre laboratoire. Microsoft Excel est utilisée pour assigner le génotype à des groupes d'échantillons. FaasX logiciel (M. Boudinot et F. Rouyer, Centre National de la Recherche Scientifique, Gif-sur-Yvette Cedex, France) ou Insomniac (Matlab basée sur des programmes; Leslie Ashmore, Université de Pittsburgh, PA) sont utilisées pour examiner circadien ( période d'exemple et de pouvoir) ou le sommeil / repos (sommeil par exemple, pourcentage, la moyenne reste Bout longueur) respectivement, les paramètres.
6. Les résultats représentatifs
A l'issue de ce protocole, on peut utiliser le même ensemble de données pour examiner les paramètres à la fois du rythme circadien et le sommeil des animaux de laboratoire par rapport aux animaux témoins.
L'analyse des paramètres du rythme circadien: des graphiques illustrant l'Éducation activités locomotrices quotidienne ou les activités moyenne de mouches sur plusieurs jours en LD ou les conditions de DD peut être généré à l'aide FaasX (figure 3) Drosophila melanogaster présentent généralement deux épisodes de l'activité, l'une centrée autour ZT0 (ou CT. ) appelle "le matin" de pointe et une autre autour ZT12 (CT 12) appelle «du soir» de pointe. Ces deux épisodes d'activités sont contrôlés par l'horloge endogène, et peut même être observée dans des conditions de JJ free-running (figure 3B). Les changements dans le calendrier de ces pics d'activité peut facilement être observée dans l'éducation et des graphiques peuvent indiquer un changement dans les propriétés de l'horloge endogène. Une autre propriété qui est indicatif de la fonction d'horloge approprié est l'augmentation d'anticipation de l'activité locomotrice observée dans les cycles de LD qui survient avant les transitions réelles du sombre au clair ou à foncé (figure 3A, flèches). Ce comportement est clairement observé chez des mouches de type sauvage (figure 3A), mais est absente chez les mutants arythmiques tels que par 0 (figure 3C) (Konopka et Benzer, PNAS, 1971). Dans le cas de la 0 par des mutants, l'observe "le matin" et "soir" pics de LD sont les réponses purement sursaut dû à de brusques changements de lumière / l'obscurité (c'est à dire «sans horloge" mouches ne anticiper les changements environnementaux, mais simplement d'y réagir ). Perte de la rythmicité comportementale est beaucoup plus prononcée dans les DD et se manifeste généralement dans la perte totale des pics matin ou le soir de l'activité locomotrice (c'est à dire des épisodes aléatoire de l'activité et d'inactivité), comme en témoigne par 0 mouches (figure 3D). En plus des graphiques d'éducation, les données de l'activité locomotrice peut être représenté comme Actogram double intrigue (FaasX), où deux jours de données sont tracées de façon séquentielle sur chaque ligne, mais le profil de la dernière journée commence la ligne suivante de deux jours de dollars de l'activité (graphique 4). Par exemple, LD1 et 2 sont tracées sur la première ligne de tIl Actogram. La ligne suivante commence par une répétition de LD2 et LD3 est suivie et ainsi de suite. Suite à ce format, les données de l'activité locomotrice couvrant toute l'expérience est illustré dans le Actogram. Actograms peuvent être tracées pour chaque mouche individuels, ou pour chaque génotype voler. Un avantage de plus actograms graphiques éducation est qu'un changement dans la durée de la période des rythmes d'activité quotidienne est facilement observable (figure 4). En plus de générer des graphiques d'éducation et de actograms, les données de l'activité locomotrice de la condition DD peut être soumis à FaasX pour calculer la durée de la période à l'aide d'un certain nombre de programmes différents, y compris le cycle-P.
Analyse de sommeil / repos paramètres: En utilisant la définition actuelle de sommeil / repos chez la drosophile (Hendricks et al 2000.), Qui est à cinq minutes d'inactivité contigus, on peut analyser les données enregistrées à partir des dosages de l'activité locomotrice et d'examiner de multiples paramètres du sommeil à l'aide d'Insomniac (L. Ashmore), un programme basé sur Matlab. Le pour cent du temps qui vole passer à dormir peut être calculée à différents intervalles de temps, pour cent, par exemple toutes les heures de sommeil (figure 5A), ou 12 heures (figure 5B). Autres paramètres du sommeil les plus courantes qui peuvent être examinés comprennent signifie le repos match longueur (figure 5C) et compter l'activité sillage (figure 5D). Moyenne du sommeil / repos match longueur est une mesure de la façon dont le sommeil est consolidée et peut illustrer la qualité du sommeil. L'activité Wake, comme son nom l'indique, est une mesure du taux d'activité lorsque les mouches sont éveillés. Ce paramètre permet de différencier les mouches qui sont vraiment touchés dans le sommeil / repos comportements par rapport à ceux qui sont malades ou hyperactif. Par exemple, les mouches qui sont tout simplement malade peut sembler à dormir plus, parce qu'ils ne sont pas aussi mobiles. Pour ces mouches, leur activité foulée sera plus faible par rapport aux animaux témoins.
Figure 1: Diagramme indiquant les principales étapes pour le dosage de rythmes d'activité locomotrice chez la drosophile Les procédures sont présentées sur la gauche tout commentaires utiles sont fournis sur la droite.. Le montant de temps requis pour effectuer traverse nécessaire et les manipulations génétiques pour obtenir les mouches avec le génotype droit à des expériences spécifiques est variable selon la nature et la conception de l'expérience. Les deux étapes marquées par des astérisques (*) fournissent les délais pour quand les mouches adultes ont besoin d'être semées / accouplés à générer des descendances de l'âge approprié (1 à 5 jours) pour l'expérience.
Figure 2: Schéma de câblage illustrant les liens entre les différentes composantes de l'activité locomotrice chez la drosophile collecte de données utilisant le système DAM Un ordinateur dédié est utilisé pour enregistrer les impulsions de l'activité locomotrice de la drosophile.. Surveille l'activité sont logés à l'intérieur des incubateurs équipés avec la température et l'éclairage (On / Off) de contrôle. L'ordinateur peut également être utilisé pour contrôler la synchronisation de la lumière On / Off dans des incubateurs, si la source d'alimentation du système d'éclairage peut être raccordé à l'unité d'alimentation (en option). Les communications entre l'ordinateur et surveille l'activité / incubateurs sont gérés par l'unité d'interface d'alimentation. L'ordinateur, l'unité d'alimentation et les incubateurs (si le contrôle de l'éclairage est indépendant de l'ordinateur) sont connectés à la prise de courant via l'UPC pour assurer la surveillance ininterrompue de l'activité et l'éclairage en continu durant la phase de la lumière. Il est recommandé de connecter tous les appareils électriques des circuits de sauvegarde d'urgence dans l'établissement, s'il est disponible.
Figure 3:. Education graphiques générés à l'aide FaasX montrant quotidienne rythmes d'activité locomotrice rythmique mouches de type sauvage (W par 0 mouches portant un transgène par +) (A et B) vs arythmique W par 0 mutants (C et D) des mouches mâles ont été conservées à 25 ° C et entraînés pendant 4 jours dans LD 12:12 (lumière: obscurité) cycles, suivis de sept jours en DD (obscurité constante). Pour chaque ligne de vol, les niveaux de l'activité locomotrice des mouches individuels (n> 32) ont été mesurés dans des bacs de 15 minutes et ensuite la moyenne pour obtenir un profil de groupe représentant pour cette ligne. A et C montrent les données d'activité généré par la moyenne des deuxième et troisième jours de cycle lumière / obscurité (LD 2-3) tandis que B et D montrent les données d'activité généré par la moyenne des deuxième et troisième jours dans l'obscurité permanente (DD 2-3 ). Les barres verticales représentent l'activité (en unités arbitraires) a enregistré en 15 minutes les bacs durant la période de la lumière (gris clair) ou la période sombre (gris foncé). Les barres horizontales au bas de l'éducation des graphiques LD; blanc, lumières, noir, tous feux éteints. ZT0 et ZT12 représentent le début et la fin de la photopériode, respectivement. Pour les graphiques d'éducation JJ; CT0 et CT12 reprESENT le début et la fin de la journée subjective constante des conditions sombres, désigné par la barre grise. Dans la partie A, M = pointe du matin; E = pointe du soir. Les flèches dans le panneau A représente le comportement d'anticipation des pics le matin et le soir observés chez les mouches de type sauvage, qui sont absents dans W par 0 mouches arythmique.
Figure 4:. Actogram double intrigue générés en utilisant le logiciel FaasX illustrant des données de l'activité locomotrice des mouches de type sauvage, de courte ou longue période mouches mâles ont été conservés à 25 ° C et entraînés pendant 4 jours dans les cycles de LD 12:12 suivis par huit jours dans l'obscurité permanente (DD) pour le calcul de la période de free-running (t) à l'aide du cycle-P dans FaasX. Trois lignes de voler avec période de type sauvage [W par 0; par +; par 0 mutant transportant par + transgène], longue période [W par 0; par (S47a); par 0 mutant transportant par (S47a) transgène] période, à court et [w par 0; par (S47D); par 0 mutant transportant par (S47D) transgène] sont présentés ici (Chiu et al 2008).. Axe X représente le temps ZT ou CT en LD ou DD, respectivement, et l'axe Y représente l'activité compte (unités arbitraires) résume en 15 minutes bacs. Les pointillés rouges connecter les sommets du soir pour chaque jour de l'expérimentation. Notez que durant le pic de LD soirée est «forcé» pour maintenir synchronie avec le cycle de 24 h LD, alors que dans la période de JJ free-running peuvent s'écarter de 24 heures. Par exemple, pour les mouches avec de courtes périodes de la chronologie de l'activité du soir se produira plus tôt chaque jour successif dans DD (quand comploté contre une échelle de 24 h de temps, comme montré ici), alors qu'un déplacement vers la droite est observé pour les mouches avec de longues périodes.
. Figure 5: Quantifier les paramètres du sommeil chez la drosophile mouches (Canton-S; CS) ont été exposés à la norme 12:12 LD cycle à 25 ° C. Insomniac (L. Ashmore) a été utilisé pour traiter les données et Microsoft Excel a été utilisé pour générer les graphiques présentés ici. Au moins 70 mouches ont été regroupées pour obtenir des moyennes de groupe et barres d'erreur (erreur standard de la moyenne) montré. (A) le sommeil de base calculée à chaque heure; montré est un cycle représentatif journalier. (B) le sommeil de base du cycle quotidien représentatifs calculée toutes les 12 heures. (C) Durée moyenne de chaque match reste calculée en 12 incréments d'une heure. (D) Taux d'activité de veille calculée toutes les 12 heures.
Discussion
Dans ce protocole, nous avons décrit les procédures de mesure des rythmes d'activité locomotrice chez la drosophile, une sortie fiable du comportement de la mouche des horloges circadiennes qui est utilisé comme l'affichage standard de la fonction horloge. Ce test a été utilisé à grande échelle d'écrans pour les mutants horloge roman (par exemple Konopka et Benzer 1971;. Dubruille et al 2009) et est constamment utilisé pour disséquer et comprendre la fonction d'horloge in vivo. Il a également été utilisée pour étudier le cycle veille sommeil chez des mouches, même si de récents rapports suggèrent que l'analyse vidéo numérique est beaucoup plus fiable pour quantifier le sommeil que d'utiliser des rythmes d'activité locomotrice (Zimmerman et al. 2008). Lors de l'utilisation des rythmes d'activité locomotrice d'analyser le sommeil, le pourcentage de sommeil dans la journée ont tendance à être surestimées.
Pour assurer le succès et la reproductibilité de ce protocole, il est essentiel de mouches de dosage qui sont du même âge, les antécédents génétiques, et élevés dans les mêmes conditions, comme dans les phénotypes comportementaux des mouches des fruits tels que la rythmicité circadienne et du sommeil / repos d'activité sont très sensibles à tous ces facteurs. Lors de l'utilisation des incubateurs multiples pour une seule expérience, il est important de s'assurer que tous les incubateurs sont à la température prévue, car certains paramètres circadiens peut changer en fonction de la température. Un mot de prudence lorsqu'ils envisagent l'achat d'incubateurs pour travailler avec des mouches; tous ne sont pas créés égaux. Alors que nous hésitons à recommander une unité particulière quelconque il ya plusieurs options. Une bonne ressource pour trouver des entreprises qui vendent des incubateurs pour les travaux de drosophile est fourni à <www.flybase.org>. Certaines entreprises vendent même "drosophile circadiens" incubateurs, où des fonctionnalités supplémentaires sont disponibles, comme déjà câblé pour le système et la montée en puissance Trikinetics température (par exemple, Tritech). Les caractéristiques importantes incluent la possibilité pour le contrôle de la lumière diurne et contrôle des températures dans la gamme physiologique de la drosophile (~ 15-30 ° C). Les prix et les tailles d'incubateurs varient beaucoup, mais avec les nouveaux surveille l'activité du Trikinetics, même petites couveuses pouvant accueillir un bon nombre de ces appareils. Aussi, bien que les incubateurs avec contrôle d'humidité peut être utilisée, cette fonctionnalité ajoutée n'est pas nécessaire aussi longtemps que vous placez une petite casserole avec de l'eau pour fournir l'humidité (50-70% est très bien). Enfin, bien que nous utilisent couramment FaasX et Insomniac d'analyse des données dans ce protocole, il existe des programmes alternatifs et des logiciels disponibles (Rosato et Kyriacou 2006), par exemple ClockLab (ActiMetrics), Forfait Rythme de Brandeis (D. Wheeler, du Baylor College of Medicine, à Houston ), et MAZ (Zordan et al. 2007).
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH NIH34958 à I. E et NS061952 à JC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila activity monitor (DAM) | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | DAM2 or DAM5 | DAM2 monitors are more compact, and more can fit into a single incubator |
| Power supply interface unit (for DAM system) | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | PSIU9 | Includes PS9-1 AC Power Supply |
| Light controller | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | LC6 | |
| Pyrex glass tubes | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | PGT5, PGT7, and PGT10 | |
| Plastic activity tube caps | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | CAP5 | Yarn can be used instead of plastic caps. |
| DAM System data collection software | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | Versions available for both Mac and PC | |
| FaasX software | Centre National de la Recherche Scientifique | Only for Mac | |
| Insomniac 2.0 software | University of Pittsburgh School of Medicine | Runs on Matlab. Can be used on both PC and Macintosh. | |
| Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. Percival incubator | Percival Scientific, Inc. | I-30BLL | Interior space dimension:Width: 65cm;Height: 86cm;Depth: 55cm |
| Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. DigiTherm Heating/Cooling Incubator with Circadian Timed Lighting and Timed Temperature | Tritech Research, Inc. | 05DT2CIRC001 | Interior space dimension:Width: 36m;Height: 56m;Depth: 28cm |
| APC Smart-UPS 2200VA 120V (Emergency power backup unit) | APC | SU2200NET | Output Power Capacity of 1600 Watts |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| TissuePrep Paraffin pellets | Fisher Scientific | T565 | Melting point 56°C-57°C |
| Block heater | VWR international | 12621-014 |
References
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