Summary
우리는 매일 운전하는 활동 리듬을 녹음 절차를 설명
Abstract
대부분의 생명체는 내생 circadian에 의해 주도 아르 휴대폰, 생리 및 행동 현상 (≡ 24 시간) 맥박 조정기 또는 시계의 일상 리듬을 나타냅니다. 인간 circadian 시스템에 고장이 다수의 질병 또는 질환과 관련있다. 쉽게 측정 행동 리듬이 클럭 기능의 읽기 아웃으로 사용됩니다 의하여 circadian 리듬을 기본 메커니즘에 대한 우리의 이해쪽으로 진행 유전 화면에서 등장했습니다. Drosophila를 사용하여 연구 circadian 리듬을 기본 세포와 생화학 기지에 대한 우리의 이해에 정액 기여를 만들었습니다. 읽기 아웃 Drosophila의 측정 표준 circadian 행동이 운전하는 활동입니다. 일반적으로 모니터링 시스템은 Drosophila의 전위의 움직임을 측정할 수있는 특별히 고안된 장치를 포함합니다. 이러한 장치는 암실에 위치한 작은 튜브에 포함된 개별 파리의 전위의 활동을 기록하는 적외선 빛의 광선의 중단을 사용을 기반으로하는 환경 관리 incubators에 보관되어 있습니다. 몇 일 동안 측정하면, Drosophila은 활동이 없으면 매일주기, 동물의 내생 circadian 시스템에 의해 지배되는 행동 리듬을 나타냅니다. 전체 절차는 상용 운전하는 활동 모니터링 장치의 출현 및 데이터 분석을위한 소프트웨어 프로그램의 개발과 함께 간단하게되었습니다. 우리는 여기서 설명하는 절차이며, 현재 세계적으로 사용되는 가장 인기있는 시스템입니다 Trikinetics 주식 회사에서 시스템을 사용합니다. 최근 같은 감시 장치 Drosophila에서 잘 동작을 연구하는 데 사용되었습니다. 많은 파리의 일상 웨이크 - 수면주기가 동시에 측정 및 연속 운전하는 활동 데이터만을 1-2주 가치가 일반적으로 충분합니다 수 있기 때문에,이 시스템은 Drosophila 낸 변경 circadian 또는 수면 속성을 식별하기 위해 대규모 스크린에 이상적입니다.
Protocol
프로토콜의 전체적인 디자인은 그림 1에서 그림입니다. 암실에있는 환경 관리 incubators 안에 보관되어 장치를 사용하여 전위의 활동을 모니터링 설정 먼저 조립해야합니다. 일단 완료 즉, 시스템은 이후의 모든 전위의 활동 리듬 측정에 사용할 수 있습니다. 각 실험, 하나는 (3) 부하가 활동 튜브로 파리, (2) 식품 소스를 포함하는 유리 활동 튜브를 준비 유전자 변형 동물을 생성하거나 필요한 십자가를 설정 포함하고 활동 모니터를 연결할 수있는, (I)는 실험 동물을 준비한다 데이터 수집 시스템 및 (IV) 기록하고 하나는 검사 뭘 원하는지 circadian 또는 수면 매개 변수에 따라 다른 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석할 수 있습니다. 여기에, 우리는 감시 장치에 파리가 먼저 원하는 조명 / 환경 incubators에 어두운 조건에 노출되는 시간 실험의 "시작"을 정의합니다.
1. 전위의 활동 모니터링 시스템 설정
- 모니터링 시스템은 전문 모니터링 장치, 낮의 빛을 제어 능력을 가지고 환경 incubators, 데이터 수집 장치, 컴퓨터 및 데이터 수집 장치 (그림 2)에 감시 장치를 연결하는 배선으로 주변 재료로 다양한 장비 아이템을 포함한다. Drosophila 활동 모니터링 (DAM) 데이터 수집 시스템을 설치하기위한 지침은 제조 업체 (Trikinetics 주식 회사)에 의해 제공됩니다.
- 전위의 활동 모니터링 시스템을 수용하기 위해 전용 암실로, 선호 온도 제어 시스템이 장착된 통풍이 잘되는 객실을 선택합니다. 관련된 모든 전기 시스템 (컴퓨터와 incubators 등) 작고 제한된 공간 내에서 오랜 기간 동안 실행을 통해 과도한 열이 객실의 온도가 급격하게 증가로 이어지는 생성할 수 있습니다. 따라서, incubators는 온도 및 온도 조절에 실패 가능성을 유지하기 위해 추가 작업 부하와 함께 부담한다. 우리는 심지어 환기가 잘되는 객실, 여름에는 에어컨의 전환이 어려운 실내 온도를 유지시킬 수있는 가을 / 겨울에는 열을 것을 발견했습니다. 이러한 경우에는 추가적인 환기는 과열의 위험을 줄이기 위해 어두운 방에 설치할 수도 있습니다. 또한, 불필요한 열 생산을 최소화하기 위해 사용되지 않은 incubators을 해제하는 것이 좋습니다.
- 외부 광원에서 방을 봉쇄. 입구가 회전 문 또는 검은색 커튼과 함께 봉쇄 수 있습니다. 이 암실을 입력 불필요한 빛의 가능성을 최소화로 우리는 회전 문을 선호합니다. 암실 안에서, 그것은 열매가 circadian 시스템 (녹색 / 청색 광에 비해 빨간 불빛이 훨씬 덜 민감합니다) 적외선로 구분하지 않습니다 파리로 어둠 속에서 완전히 작동 필요가 없습니다. 우리가 암실에서 볼 필요하지만 여전히 전반적인 어둠 (예, 신속하게 제거 또는 어두운 단계에 인큐베이터에서 모니터링 장치를 추가) 유지하려는 경우, 우리는 단순히 빨간색으로 뒤덮혀있다 표준 손전등을 사용하여 필터. 또는 또는 이외에, 당신의 암실은 형광등이있다면, 빨간색 필터 종이를 커버 또는 여과지로 덮여 독립 실행형 백열 데스크 빛을 있습니다. 그것은 빨간 불빛이 매우 짧은 노출 (몇 초)에 어둠 속에서 파리를 노출하는 것이 자신의 circadian 시계에 영향을 미칠 것이 매우 않을 수 있습니다. Drosophila의 circadian 시스템이 가시 광선에 매우 민감한 있지만 또한, 우리는 암실에 빛나는 작은 삐걱은 결과적 될 것이라고 생각하지, 어떤 경우에 좋은 연습은 집에 모니터가있는 경우에만 개방되는 배양기 문을을 유지하는 것입니다 필요합니다. 또한, 단 이번처럼 한 번에 하나의 보육을 오픈하는 것은 빛을 위상에 인큐베이터에서 빛에 노출되고 그 어두운 단계에 보육의 가능성을 최소화합니다.
- 건물에 급증, 스파이크, 또는 전원 장애의 경우에는 전력 활동 모니터링 시스템의 구성 요소를 충분히 와트 용량을 중단 전원 공급 장치 (UPS) 비상 백업 장치를 구입하십시오. 가능하면 건물의 비상 백업 회로에 UPS 긴급 백업 장치를 연결합니다. 시스템이 비상 전원 스위치와 같은 장비는 정전 동안 비상 콘센트에 연결하더라도 짧은 전환 기간이있을 수있다는 점에 유의하십시오. 그 변화하는 동안, 심지어 몇 초 동안 전원 손실이 인큐베이터가 해제되는에 종료 컴퓨터와 불빛으로 이어질 수 있습니다. 그러므로, 그것은 컴퓨터가 작업 데이터와 보육의 조명을 제어하는 시스템에만 비상 전력에 합류 아니라 또한 UPS를 수집하는 데 사용되고 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 보육의 조명을 제어하는 시스템을 직접 배양기 (대부분의 경우 그것이)에 의해 규제되지 않은 경우, 다음의 등장에 배양기를 플러그 충분합니다몇 초 동안 전력의 손실로 UPS없이 ncy 전원, 챔버 온도에 영향을 미치지 않습니다. 일반적으로 UPS 장치는 권력의 부재에 장비가 50-30 분 계속 실행됩니다, 그 주요 목적은 비상 전원에서 정기적으로 전환하는 동안 일시적으로 전원 손실로부터 보호하는 것입니다.
- 완벽하게 데이터 수집 및 / 또는 incubators 빛의 제어를위한 전용 컴퓨터, PC 또는 Macintosh를 설정합니다. DAM 시스템은 모든 시간과 무인 실행되기 때문에, 그것은이 컴퓨터가 최소한의 소프트웨어가 충돌의 위험을 최소화하기 위해, 선호에는 네트워크 연결을 설치하지 않았 것을 권장합니다. 또한, 시스템은 이후의 분석을 위해 수집된 데이터의 다운로드를 허용하기 위해, 휴대용 데이터 저장, 예 : Zip 드라이브, CD / DVD 작가, 또는 USB 필요합니다.
- 수동으로 연결해 / 활동 모니터 뽑기의 용이성을 허용하도록 환경 제어 incubators의 선반 주위에 깔끔하게 전화 회선 네트워크를 마련. 표준 전화선, 어댑터 및 스플리터는 상업적인 전자 상점에서 구입하여 사용할 수 있습니다. 그들은 하나의 메인 라인에 수렴하고 컴퓨터에 연결하는 인큐베이터 밖으로 확장할 수있는 방법으로 여러 전화 회선을 설정합니다.
- 전화선을 통해 전원 활동 모니터를 (Trikinetics 주식 회사)에 제공 전원 공급 장치 인터페이스 장치 (Trikinetics 주식 회사에서 일명 블루 상자)를 통해 컴퓨터에 incubators 내부의 감시 장치를 연결합니다. 이 전원 공급 장치 인터페이스 장치는 전화선에서 USB 케이블로 전환 데이터 전송을위한 인터페이스 역할을합니다. 보육 조명 시스템의 전원 라인 코드가 연결된 수있는 동일한 단위에서 선택 라이트 컨트롤러는 컴퓨터를 통해 circadian 보육 조명 일정 제어를 허용하기 위해 사용할 수 있습니다.
- 전자 장치 또는 오리 테이프 또는 무료 실행 리듬을 보장하기 위해 검은 천으로 부적절하게 밀봉 보육 도어의 LED에서 마스크 가능한 광원이 불필요한 빛의 부재 단위로 측정됩니다.
2. 실험 동물의 준비
- 과일의 행동 phenotypes는 활동이 시험 동물의 genotypic과 연령의 차이 (코 외. 2006) 매우 민감합니다 circadian rhythmicity과 수면 / 휴식처럼 날아. 따라서 동일한 환경 조건과 같은 시대의 reared 아르 적절한 제어 동물을 사용하여 이러한 phenotypes을 평가하는 데있어 매우 중요합니다. 또한, circadian rhythmicity의 성적 동종 이형 (헬프 리치 - 포스터 2000)가 있습니다. 일반적인 연습은 25 reared 아르 성인 남성이 파리 ° C와 전위의 활동 assays에 대한 오래된 1-5일 사이.를 사용하는 것입니다 남자는 달걀 누워 활동 전위의 활동의 진정한 측정에 영향을 미칠 것이기 때문에 전통적으로 사용하는 대신 여성의 파리 파리. 때문에 성적 동종 이형의, 가끔은 시금 여성 파리 정보를 수 있습니다. 단지 5 %의 자당과 2% bacto 한천로 구성된 식품 잘못된 활동 카운트를 유발하는 개발하고 부화 유충의 움직임 이외의 처녀 암컷의 난자를 방지할 수 있습니다. 성관계와 처녀 암컷 (헬프 리치 포스터, J. Biol. 리듬 2000) 사이의 활동 프로파일의 차이가있을 수 있지만 또한, 처녀 암컷 파리를 사용할 수 있습니다.
- circadian과 수면 / 휴식 관심의 특정 돌연변이 파리의 매개 변수를 검토하면, 그것은 동일한 유전 배경, 예 : w1118 또는 yw의 야생 타입 변형과 돌연변이 주식을 outcross 하셔도됩니다. 이것은 잠재적으로 circadian 또는 수면 / 휴식 표현형을 마스크 수도 두번째 사이트 유전 수정자를 제거합니다. 가 없기 때문에 더 크로싱 오버 Drosophila 남성에 그것이 야생 형 남성과 돌연변이 여자를 건너하여 outcross을 수행하는 것이 좋습니다.이 야생 형 변종 또한 실험에 적합한 제어 역할을합니다. 시드 모두 야생 형 제어 및 약 10~14일 전위의 활동 리듬 실험하기 전에 표준 Drosophila 음식을 동시에 돌연변이 파리 (식품 제조법을 블루밍턴 Drosophila 증권 센터를 참조하십시오; http://flystocks.bio.indiana.edu /). 자손의 eclosion되면 1-5일 중년 남성이 파리를 수집하고 실험에 사용할 수 그들을 따로 설정할 수 있습니다.
- 이러한 overexpression, RNAi, 전세계 다른 주식 센터에서 제공 조직을 특정 GAL4 드라이버 플라이 라인으로 많은 유전 도구와 자원, 그것은에있는 overexpressing의 효과나 두드리는 다운 특정 유전자를 해부하다 할 수 있습니다 조직과 측두엽 특정 방식 (브랜드 및 Perrimon 1993; 맥과이어 외 2004;.. Osterwalder 외 2001). circadian 검사하고이 방법을 사용하여 수면 / 휴식 매개 변수, 조직의 특정 또는 약물 inducible GAL4 드라이버 (예 : 남성) UAS 응답 (예 : 버진 여자)에 연결된 대상 유전자와 유전자 변형 구조를 들고 파리로 건너 아르와 유전자 변형 구조를 들고 날아하기 주변 십사일 전위의 활동의 시작하기 전에실험. 자손의 eclosion되면 1-5일 중년 남성이 파리를 수집하고 실험에 사용할 수 그들을 따로 설정할 수 있습니다. 십자가에 사용되는 부모 라인은 정기적으로 실험을위한 컨트롤로 사용됩니다. UAS 응답과 동일한 유전 배경 야생 유형 파리와 GAL4 드라이버 라인의 십자가의 자손도 적절한 컨트롤입니다.
- 으로 단계 (2)에 표시된 및 (3), 시간의 길이가 실험 동물의 준비에 필요한 것은 크게 실험의 성격과 디자인에 따라 다릅니다. 유전자 변형 동물이 생성하거나 크로싱 제도가 실행해야 할 경우 시간이 더 분명 필요한 것입니다 필요로하는 경우에. 수송상의 이유로, 그것은 25 14 일 소요 ° Drosophila에 대한 C는 계란에서 성인 야구를 발전시키기 위해.
3. 활동 튜브의 준비
- 활동 튜브는 실험 도중 파리 서식지를 나타냅니다. 한쪽 끝에 음식 물질을 포함하고 다른 끝에 원사 또는 플라스틱 플러그와 연결 5mm 유리 튜브, 그들은 (참고 Trikinetics가 assayed 수 Drosophila의 종류에 따라 다양한 크기를 제공합니다 직경 5mm 정도) 얇은 있습니다. 유리 활동 튜브가 여러 번 재사 용할 수 있기 때문에, 우리는 시작 지점으로 이전 실험에서 사용 / 지저분한 옷 활동 튜브를 사용하여 준비 절차를 설명합니다. 여러분이 새로운 활동 튜브를 사용하는 경우, 단순히 단계 (11)로 건너 뜁니다.
- 그것은 튜브 내부의 음식이 최대 건조하는 경향을 가지고 4 ° C.에 저장된 초과 근무하는 경우에도 곰팡이로 오염된 도착 이후 갓 만들어진 활동 튜브를 사용하는 것이 바람직합니다 그들은 일반적으로 실험의 시작에 앞서 일주일에 며칠을 준비하고 있습니다. 그들을 준비하기 전에 각 실험에 필요한 튜브의 수를 평가하는 것이 중요하다.
- 사용하는 활동을 튜브에서 플러그를 (원사 또는 플라스틱 플러그) 제거 및 대형 유리 비커에 넣어 두었어요. 튜브는 절반 비커까지 작성해야합니다. 잠수함 튜브를해야하고, 수돗물로 비커를 입력합니다.
- 물이 왁스와 한천 음식을 녹기 전체 빠른 끓여야 올때까지 전자렌지 비커 유리 튜브로 가득.
- 물이는 뜨겁다 것을주의 가져가라. 전자 레인지에서 비커를 제거하고 갇힌 왁스는 위로 떠 수 있도록 주걱 또는 플라스틱 10 ML의 피펫으로 튜브를 저어. 다음 단계 (4) 반복합니다.
- 전자 레인지에서 비커를 제거하고 진정으로 기다립니다. (이것은 사용 가능한 경우) 추운 방에있는 비커 퍼팅 그 과정을 빠르게합니다.
- 물이 아래로 냉각로, 왁스는 물의 표면에 수집하고 점차적으로 굳은 것이다. 간단히 손으로 경화 왁스를 제거합니다. 이것은 튜브에서 왁스의 대부분을 제거한다.
- 신선한 수돗물과 단계를 반복합니다 (4) (5)와 함께 새로운 비커로 활동 튜브를 전송합니다.
- 왁스의 대부분 단계 (7)에서 제거되었습니다 때문에, 응고에 밀랍을 기다릴 필요가 없습니다. 단순히 비커 밖으로 물을 부어 다른 새로운 비커에 튜브를 전송합니다. 물이 여전히는 뜨겁다 것을주의 가져가라.
- 단계 (4) 반복 (5) 이번이 마지막이다. 비커의 물을 붓고 및 진정 활동 튜브 기다립니다.
- 250 ML 또는 500mL 유리 비커에 수직으로 그들을로드합니다. 그들이 너무 밀접하게 포장하지 마십시오. 마른주기 압력솥을 사용하거나 튜브를 건조하기위한 건조 오븐을 사용하여 그들을 소독.
- 별도의 활동 튜브에 로드할 음식을 준비하기 위해 증류수 또는 수돗물에 5 %의 자당 (시그마)와 2퍼센트 Bacto 한천 (BD)의 솔루션을합니다. 솔루션을 소독하기 위해 압력솥. autoclaved 음식은 오랜 기간 동안 즉시 사용 또는 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 음식 굳은되면, 하나는 전자렌지 필요하고 튜브를 작성하기 위해서는 그것을 녹일 수 있습니다. 음식의 미사용 부분을 저장하고 나중에 사용할 수 있습니다.
- 음식 이상 65 주위해야 ° C 활동 튜브를 작성을 위해 사용할 때. 너무는 뜨겁다면, 너무 많은 응축은 튜브 내부에 축적됩니다. 그 정도로 뜨거운하지 않으면 음식 튜브가 고르게 채워되기 전에 고체화됩니다. 튜브는 분의 때까지 음식과 활동 튜브를 작성하려면, 음식 솔루션가 바닥에서 활동 튜브를 채울 수 있도록 유리 비커의 안쪽 벽을 따라 액체 음식 솔루션을 피펫으로 10 ML의 피펫을 사용하여 채워 솔루션. 특히 모든 튜브, 비커 가운데에있는 것들을 확인 부드럽게 주위에 소용돌이 비커가 고르게 음식 솔루션으로 채워지게된다. 실온 또는 4 ° C.에 하나 완전히 응고에 음식을 기다립니다 유리 튜브 내부에 결로가 분산되면 다음 단계로 진행합니다.
- 비커에서 활동 튜브를 제거하려면 때문에 비커의 바닥으로 튜브를 밀어 동시에 튜브를 비틀어 그 튜브 내부의 경화 음식과 하단비커 별도의 것입니다. 선호 하나의 무리로, 비커 밖으로 튜브를 가져가라.
- 튜브의 바깥 표면에 여분의 음식을 제거하는 종이 타올 한하여 튜브를 청소하십시오. 깨끗한 용기에 별도로 튜브를 설정합니다.
- 튜브 홀더가없는 일반 실험실 블록 히터를 타고 강한 알루미늄 호일의 여러 레이어와 잘 조심스럽게 가열을 커버. 녹기 잘 알루미늄 줄지어 가열로 파라핀 (왁스) 알약을 추가합니다.
- 비 음식 끝에있는 튜브를 잡아와 녹은 왁스에 음식 끝을 찍어. 왁스 응고 속도를 찬물로 가득한 유리 비커에 왁스칠 부분을 찍어. 한 번 반복합니다. 바다에 왁스칠 튜브를 디핑 것은 같이 가겠다는에서 튜브를 방지할 수 있습니다.
- 튜브는 바로 사용하거나, 4 ° C 일주일 이내 사용하기 위해 밀폐된 용기에 저장할 수 있습니다. 장기 저장은 음식의 과도한 건조으로 이어질 것입니다. 튜브은 4 ° C에서 저장하는 경우 사용하기 전에 벤치 위에 그들을 떠나하여 주위 온도를 따뜻하게해야합니다.
4. 로딩은 활동 전위의 튜브 및 활동 모니터링 시스템을 날아
- 이전 활동 튜브로 파리를 로딩하는 활동 모니터를 집에서하는 데 사용됩니다 incubators 켭니다. 보육 컨트롤을 사용하여 온도를 조절하고 원하는 실험 설계에 따라 DAM 시스템 조명 컨트롤러 또는 incubators 자신의 조명 제어 시스템을 사용하여 어두운 / 라이트 정권을 설정합니다. 활동 튜브로 파리를로드하는 데 필요한 시간은 안정화 온도 충분해야합니다.
- 이산화탄소와 함께 파리를 마취.
- 부드럽게 활동 튜브에 하나의 파리를 전송하는 좋은 페인트를 사용하십시오.
- , 괜찮아 포셉와 반 인치 주위이며 개방을 플러그 및 실험 도중 탈출에서 비행을 방지하기 위해 활동 튜브 비 음식 끝에 원사를 삽입 원사의 단일 조각의 중간을 잡고있는 동안 같은에 시간은 튜브에 공기 흐름을 수 있도록합니다. 또는, 작은 구멍 (Trikinetics 주식 회사)와 플라스틱 뚜껑은 열기를 닫습하는 데 사용할 수 있습니다.
- 튜브가 날아가 깨어난다까지 자신의 옆에 누워, 또는 다른 음식에 붙어 점점 비행의 위험이 있는지 확인합니다.
- 활동 모니터에 튜브를 삽입합니다. Trikinetics 모니터의 새로운,보다 컴팩트한 모델 (Trikinetics DAM2 및 DAM2 - 7)와 함께, 그것은 적외선 전송이 중앙 위치에서 튜브를 통과하도록 고무 밴드 대신에 튜브를 개최하는 것이 필요합니다.
- incubators로 활동 모니터를 넣고 전화 와이어를 통해 데이터 수집 시스템으로 연결. 확실히 모든 모니터가 올바르게 연결시켜 줬습니다하고 데이터가 그들의 각각에서 수집되고 만들 DAM 시스템 수집 소프트웨어를 사용하여 확인하십시오. 모니터는 각 유리 활동 튜브의 중심에 걸쳐 적외선 광선을 방출. 파리의 전위의 활동은 "한"이 적외선 광선이 고장 또는 '제로'가 적외선 빔을가 파손되지 않는에 기록된 때마다 기록됩니다 원시 이진 데이터로 기록됩니다.
5. Circadian 주기성 및 진폭의 결정에 대한 데이터를 기록하기 위해 실험 계획법
- 파리는 2-5 전체 일 동안 원하는 빛 / 어둠 (LD)와 온도 정권에게 노출에 의해 동기화하고 개입하고 있습니다. 가장 일반적으로 사용되는 진입 조건은 25 (12시 12분 LD) 조명 / 12 시간 어두운 12 시간의 어두운 / 라이트 사이클 ° C.입니다 이것은 일반적으로 인정된 표준 상태는 기본적으로 Drosophila는 아프리카 적도 지역에서 유래한다는 생각을 기반으로합니다. circadian 리듬을 공부 때 하나 요구에 익숙한 될 몇 가지 어법이 있습니다. 이 프로토콜과 관련된, 조명이 인큐베이터에서 이동 시간이 zeitgeber 시간 0 (ZT0) 및 해당 값 (예, 12시 12분 LD주기에 상대 다른 모든 시간을 말합니다, ZT12는 시간이되었을 때 조명)이 해제됩니다. 표준 12시 12분 LD 조건에서, 야생 입력 Drosophila melanogaster은 일반적으로 활동의 두 관찰을 전시, "아침"정상과 "저녁"피크 (그림 3A) 칭했다 ZT12 주위에 다른 칭했다 ZT0 중심으로 하나. 아침과 저녁 복싱은 내생 시계에 의해 제어하지만 어둠 / 빛으로 전환에 대한 응답으로 활동 과도 버스트는 "놀라게"반응도 있습니다. 진입의 두 일 최소 및 더 많은 시간을 소요하고 지속적인 어둠 속에서 자유 실행 기간 (아래 참조, 2 단계)를 측정하는 방향이 준비되어 있습니다 대형 화면에서 예를 들어, 사용할 수 있습니다. 당신이 매일 빛을 어둠 사이클 동안 활동 패턴을 공부에 관심이있다면 그러나, 그것은 더 많은 데이터를 얻을만큼 LD의 4~5일 위해 파리를 유지하는 것이 바람직합니다. 기본적으로, 마지막 두에서 파리의 숫자 또는 최종 데이터 분석 LD 일의 숫자를 (예, 수영장 데이터 증가LD의 전위의 활동 가치 일)보다 신뢰할 수있는 낮의 활동 프로파일 및 측정 (예, 아침이나 저녁 피크 타이밍)이 생성됩니다. 또한, 활동의 일상 분포 당일 길이 (photoperiod)과 온도의 함수로 다릅니다. 하나는 활동 패턴이 계절 적응을 (. 예 : 첸 외 2007) 받아야하는 방법 매일 공부를 원한다면 표준에서 photoperiod 또는 온도 변화에 대한 주요 이유는 Drosophila도 매일 온도주기 (예 : 글레이저와 Stanewsky 2005 개입하실 수 있습니다.; Sehadova 외. 2009). 단 2-3에 따라 다를 수 온도 사이클 ° C 끌고 가다 활동 리듬에 충분합니다.
- entraining 기간 (위 참조, 1 단계) 완료 후 자유 실행 전위의 활동 리듬은 일정한 어둡고 온도 조건 하에서 측정됩니다. 빛을주기위한 설정은 실험 이후 하루 DD의 첫날을 나타내는 것과 같은 LD의 마지막 날에 어두운 단계에서 언제든지 변경할 수 있습니다. DD 데이터 수집 7 일은 circadian 시대와 파리의 진폭을 (리듬 예를 들어, 전원 또는 강도) 계산하기 충분합니다. 일반적으로, 적어도 16 파리의 샘플 크기는 특정 유전자형을위한 신뢰할 수있는 무료 운영 기간을 얻을 필요가 있습니다. 하나만을 낮의 활동을 측정에 관심이있다하더라도, 그것은 내생 시대의 변화가 LD에서 활동의 일상적인 분포를 변경할 수 DD에서 날아 '자유 실행 기간을 측정하는 것이 좋습니다 아직도있다. 예를 들어, 오랜 기간 함께 날아 내생 일반적으로 (예를 들어, 그림 4 참조) LD의 지연 저녁 봉우리를 나타냅니다.
- 실험의 결론에서, 원시 이진 데이터는 DAM 시스템 소프트웨어가 휴대용 데이터 저장 장치, 예를 들어 USB 키에 다운로드 사용 회수.
- 원시 이진 데이터는 DAM Filescan102X을 (Trikinetics 주식 회사)를 사용하여 처리과 수면 / 휴식 매개 변수를 분석하면 circadian 매개 변수이나 1로 5 분 용기를 분석하면 15 삼십분 방식으로 표현됩니다. 현재 비활성 다섯 연속 분 Drosophila의 수면 / 휴식의 표준 정의입니다 (헨드릭스 외 2000;. 아호와 Sehgal 2005).
- DAM 시스템에서 수집한 데이터를 분석하는 것을 원칙으로하지만 우리는 일상적으로 우리가 실험실에서 사용되는 방법을 제공합니다 여러 가지가 있습니다. Microsoft Excel에서 서로 다른 샘플 그룹에 유전자형을 할당하는 데 사용됩니다. FaasX 소프트웨어 (M. Boudinot와 F. Rouyer, 센터 내셔널 드 라 레쳐치 Scientifique, GIF - 쓔흐 - 이베뜨 Cedex, 프랑스)이나 불면증은 (Matlab 기반 프로그램, 레슬리 애쉬 모어, 피츠버그 대학, PA) circadian 검사하는 데 사용됩니다 ( 예를 들어, 기간 및 전원) 또는 수면 / 휴식 (예 : 백분율 수면, 길이 자고 휴식을 의미) 매개 변수 각각.
6. 대표 결과
이 프로토콜의 완료되면, 하나는 제어 동물 관련 실험 동물의 circadian과 수면을 모두 매개 변수를 검사하도록 설정 같은 데이터를 사용할 수 있습니다.
circadian 매개 변수의 분석 : LD 또는 DD 조건에 며칠 동안 매일 운전하는 활동이나 파리의 평균 활동을 설명하는 교육 그래프는 FaasX을 (그림 3)를 사용하여 생성할 수 있습니다 Drosophila melanogaster은 일반적으로 활동의 두 관찰을 전시, 하나는 ZT0 (또는 중부 표준시를 중심으로. ) "아침"정상과 ZT12 (중부 표준시 12) 칭했다 "저녁"피크 주변의 다른 칭했다. 활동의이 두 관찰은 내생 시계에 의해 제어되며, 심지어는 무료로 실행 DD 조건 (그림 3B)에서 볼 수 있습니다. 이러한 활동 봉우리의 타이밍의 변경은 쉽게 교육 그래프에서 관찰 될 수 있으며, 내생 시계의 속성에 변화를 나타낼 수 있습니다. 적절한 클럭 기능을 나타내는 또 다른 속성은 실제 어두운 대 조명 또는 조명 - 투 - 어둠 전환 (그림 3A, 화살표) 이전에 발생 LD주기에서 관찰 전위의 활동 증가 예상됩니다. 이 문제는 명확하게 야생 유형 빠르다 (그림 3A)에서 관찰하지만, 그러한 0 (그림 3C) (Konopka 및 Benzer, PNAS, 1971) 당 같은 arrhythmic 돌연변이에 결석입니다. 당 0 돌연변이의 경우, 관찰 "아침"와 LD의 "저녁"봉우리 (예 : 'clockless'파리는 환경 변화를 예측하지 빛 / 어둠 조건에 갑작스러운 변화로 인해 순수하게 놀라게 답변지만 단지 그들에게 반응 ). 행동 rhythmicity 상실 DD 훨씬 더 발음이며, 일반적으로 당 공 파리 (그림 3D)에서 볼 수 전위의 활동의 아침이나 저녁 봉우리의 총 손실 (활동과 비활성 즉, 임의의 관찰)로 승객 명단. 교육 그래프 외에, 전위의 활동 데이터는 데이터의 이일은 각 라인에 순차적으로 꾸몄다 아르 이중 플롯 actogram (FaasX)로 표시하지만, 마지막 그날의 프로필이 활동의 가치가 이틀을 다음 줄에 (그림을 시작 수 있습니다 4). 예를 들어, LD1, 2는 t의 첫 번째 줄에 꾸몄다 아르그는 actogram. 다음 라인은 LD2의 반복과 함께 시작하고 LD3 등 뒤에있다. 이 형식에 따라, 전체 실험까지의 전위의 활동에 데이터가 actogram의 그림입니다. Actograms는 각 비행에 대한 역모를, 또는 각 플라이 유전자형하실 수 있습니다. 교육 그래프를 통해 actograms 중 하나 장점은 일상적인 활동의 리듬 기간의 길이에 변화 (그림 4) 쉽게 관찰할 수있다는 것입니다. 교육 그래프와 actograms 생성 외에도 DD 상태에서 운전하는 활동 데이터는 사이클 - P를 포함하여 다양한 프로그램의 번호를 사용하여 기간 길이를 계산하기 위해 FaasX에 제출하실 수 있습니다.
슬립 / 나머지 매개 변수의 분석 : Drosophila의 수면 / 휴식 (. 헨드릭스 외 2000), 비활성 다섯 연속 분 거리에, 하나가 운전하는 활동 assays에서 기록된 데이터를 분석하고 불면증을 사용하여 여러 수면 매개 변수를 검사할 수의 현재 정의를 사용함으로써 (L. 애쉬 모어), Matlab 기반 프로그램입니다. 자고 지출 파리 시간의 %가 다른 시간 간격으로 계산 수 있습니다, 예를 들어 %는 매 시간마다 (그림 5A), 또는 12 시간 (그림 5B)를 수면. 포함 검사를 할 수있는 다른 일반적인 수면 매개 변수의 길이는 자고 휴식 (그림 5C)와 웨이크 활동 카운트 (그림 5D)을 의미합니다. 길이 시합 슬립 / 나머지는 수면이 얼마나 통합을 측정하기위한 한 방법입니다 평균과 수면의 품질을 설명하실 수 있습니다. 웨이크 활동은 그 이름에서 알 수 있듯이, 파리의 깨어있는 활동 률을 측정하기위한 한 방법입니다. 이 매개 변수는 진정 중 아프거나 hyperactive하는 그 대 슬립 / 나머지 행동에 영향을 날아 구별하는 데 도움이됩니다. 예를 들어, 단순히 아픈 거죠 파리들은 같은 모바일되지 않기 때문에 더 잠 것처럼 보일 수 있습니다. 이런 파리에 대한 그들의 웨이크 활동은 동물을 통제와 관련하여 낮은 것입니다.
그림 1 : 플로 차트가 Drosophila에서 전위의 활동 리듬을 시금의 주요 단계를 구상 절차는 왼쪽에 표시되는 유용한 의견이 오른쪽에 제공하는 동안.. 특정 실험에 적합한 유전자형과 파리를 얻을 필요가 교차하고 유전자 조작을 수행하는 데 필요한 시간의 양은 실험의 성격과 디자인에 따라 변수이다. 별표 (*)로 표시된 두 단계는 파리 성충은 씨앗 / 실험에 해당하는 연령 (나이 1-5일)의 progenies를 생성하기 위해 성관계를해야 때 시간 프레임을 제공합니다.
그림 2 : 배선 다이어그램 DAM 시스템을 사용 Drosophila의 전위의 활동 데이터 수집에 대한 다른 컴포넌트 사이의 연결을 설명하는 전용 컴퓨터가 Drosophila의 전위의 활동 카운트를 기록하는 데 사용됩니다.. 활동 모니터는 온도와 조명 (ON / OFF) 제어를 갖춘 incubators 안에 보관되어있다. 컴퓨터도 조명 시스템의 전원이 전원 공급 장치 (옵션)에 매여 수있는 경우 incubators에 / 오프 조명의 타이밍을 제어하는 데 사용할 수 있습니다. 컴퓨터와 활동 모니터 / incubators 사이의 통신은 전원 공급 장치 인터페이스 단위로 관리됩니다. 컴퓨터, 전원 공급 장치와 incubators는 (조명 제어 컴퓨터의 독립적인 경우) 빛의 단계에서 활동의 중단 모니터링 및 지속적인 조명을 위해 UPC를 통해 AC 전원 콘센트에 연결되어 있습니다. 이것은 사용 가능한 경우, 시설의 긴급 백업 회로 모든 전기기구를 연결하는 것이 좋습니다.
그림 3 :. 교육 FaasX가 리듬 야생 유형 파리 (0 당 w가 당 + transgene를 들고 파리) (A와 B) 대 arrhythmic w 당 0 돌연변이 (C와 D)의 매일 운전하는 활동 리듬을 보여주는 사용 생성된 그래프 남성 파리가 유지되었습니다 25 ° C와 12시 12분 LD 4 일 동안 개입 (조명 : 어두운) 사이클 DD (상수 어둠)은 7 일 다음에. 각 플라이 라인의 경우, 개별 파리 (N> 32)의 전위의 활동 수준은 15 분 단위로 측정 방식 그리고 그 라인에 대한 그룹 프로파일 담당자를 얻기 위해 평균했다. A와 C는 B와 D는 (DD 2-3 지속적인 어둠의 두 번째 및 세 번째 일 평균에서 생성된 활동 데이터를 표시하면서 어두운 / 라이트 사이클에서 두 번째 및 세 번째 일 (LD 2-3) 평균에서 생성된 활동 데이터를 표시 ). 수직 막대는 빛의 시대 (밝은 회색) 또는 어두운 시대 (어두운 회색) 동안 15 분 방식에 기록된 활동 (임의 단위) 나타냅니다. LD 교육 그래프의 하단에있는 수평 바, 흰색, 불을, 검정색, 조명에서. ZT0 및 ZT12는 각각 photoperiod의 시작과 끝을 나타냅니다. CT0 및 CT12 repr, DD 교육 그래프에 대한회색 막대로 표시됨 지속적인 어두운 상태에서 주관적인 하루의 시작과 끝을 ESENT. 패널 A, M에서 = 아침 피크, E = 저녁 피크. 패널의 화살표는 0 arrhythmic 날아 당 w에 결석 아르 야생 유형 파리에서 관찰 아침과 저녁 봉우리의 예상 행동을 나타냅니다.
그림 4 :. 와일드 타입, 짧은 또는 긴 기간 파리의 전위의 활동에 데이터를 설명하는 FaasX 소프트웨어를 사용하여 생성된 이중 플롯 actogram 남자 파리 8 다음 25 ° C에서 보관 및 12시 12분 LD주기 4 일 동안 개입했다 FaasX의주기 - P를 사용하여 무료로 실행 기간 (T)의 계산을위한 상수 어둠 (DD)의 일. 야생 타입 기간 세 플라이 라인 [0 당 w, 당 +; 회 0 돌연변 + transgene마다 수행], 오랜 기간 [0 당 w, 당 (S47A); 0 회 돌연변이 (S47A) transgene마다 들고], 그리고 짧은 기간 [w 0 회, 당 (S47D); (S47D) transgene마다 수행 돌연변 0 회]는 (. 쭈조 외 2008) 여기에 표시됩니다. X - 축 각각 LD 또는 DD에서 ZT 또는 중부 표준시 시간을 나타내고 Y 축은 15 분 방식으로 표현하는 활동 카운트 (임의 단위)을 나타냅니다. 빨간 점선은 실험 매일 저녁 봉우리를 연결합니다. LD 동안 저녁 피크는 DD에 무료로 실행 기간이 24 시간에서 이탈 수있는 반면, 24 시간 LD주기와 synchrony을 유지하기 위해 '강제로'입니다. 오른쪽으로 이동 오래 함께 날아 대한 관찰이지만 예를 들어, 짧은 기간 함께 날아위한 저녁 활동의 타이밍은 DD의 각 연속 일 (여기서 같이, 24 시간의 시간 척도 역모를 꾸몄다 경우)에 이전 발생합니다 기간.
. 그림 5 : Drosophila에서 잘 매개 변수를 Quantifying 파리 (캔턴 - S, CS)는 25 ° C.에 표준 12시 12분 LD 사이클에 노출되었다 불면증 (L. 애쉬 모어)는 데이터 및 Microsoft Excel을 여기에 표시된 차트를 생성하는 데 사용된을 처리하는 데 사용되었다. 적어도 70 파리가 표시 그룹의 평균과 오차 막대 (평균의 표준 오차)를 얻기 위해 풀링했다. (A) 매 시간마다 계산베이스 라인 수면, 그림은 대표적인 매일 사이클이다. (B) 대표 일상주기의베이스 라인 수면 매 12 시간을 계산. 12 시간 단위로 계산 자고 각 나머지 (C) 평균 길이. (D) 깨어있는 활동의 속도는 매 12 시간을 계산.
Discussion
이 프로토콜에서는, 우리는 Drosophila의 전위의 활동 리듬, 시계 기능의 표준 판독으로 사용됩니다 날아 circadian 시계의 신뢰할 수있는 행동 출력을 측정하기위한 절차를 설명했다. 이 분석은 소설 클럭 돌연변이 (. 예 Konopka 및 Benzer 1971; Dubruille 외 2009)에 대한 대규모 화면에서 사용되고 있으며, 지속적으로 생체내의 시계 기능을 해부하다 이해하는 데 사용됩니다. 최근 보고서는 비디오 디지털 분석 전위의 활동 리듬을 사용하는 것보다 잠을 quantifying 훨씬 더 신뢰할 수 있다고 제안하더라도 이것은 또한 파리의 수면 각성주기를 연구하는 데 사용되었습니다 (짐머만 외 있습니다. 2008). 수면을 분석 전위의 활동 리듬을 사용하는 경우, 낮에는 잠을 비율이 너무 과대 평가하는 경향이 있습니다.
과일의 행동 phenotypes 이러한 circadian rhythmicity과 수면 / 휴식 활동으로 날아 본 프로토콜의 성공과 재현성을 보장하기 위해서는, 나이, 유전 배경에 비슷한 분석 파리에 중요하고, 동일한 조건 하에서 reared하는 것은 매우 민감합니다 이러한 모든 요인. 한 실험에 대해 여러 incubators를 사용하는 경우, 그것은 일부 circadian 매개 변수가 온도의 함수로 변경할 수 있기 때문에 모든 incubators가 예상 온도되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 주의의 한 단어로 날아 작업에 대한 incubators 구입 고려, 모두 평등하지 만들어집니다. 우리는 많은 옵션이 특정 장치를하는 것이 좋습니다 주저하는 동안. Drosophila 작업에 대한 incubators을 판매하는 회사를 찾기위한 좋은 리소스가 <www.flybase.org>에서 제공됩니다. 일부 기업은 심지어는 추가 기능이 같은 이미 Trikinetics 시스템과 온도 올렸 (예 : Tritech)에 유선으로 사용할 수 있습니다 궁극적으로 "Drosophila circadian"incubators을 판매하고 있습니다. 중요 기능은 낮의 빛을 제어 및 Drosophila의 생리적 범위에서 좋은 온도 제어 기능을 포함 (~ 15-30 ° C). 가격과 incubators의 크기는 많은 차이가 있지만 Trikinetics에서 새로운 활동 모니터, 심지어 작은 incubators 이러한 장치의 꽤 번호를 수용할 수 있습니다. 당신은 습도 (50~70%는 괜찮습니다)를 제공하기 위해 물을 작은 냄비를 장소로 또한, 습도 제어 incubators 사용할 수 있지만,이 추가 기능은 한 필요하지 않습니다. 우리가 일상적으로이 프로토콜의 데이터 분석을위한 FaasX과 불면증을 사용하지만 마지막으로, 가능한 대안 프로그램 및 소프트웨어 없습니다 (로사토 및 Kyriacou 2006) 예 ClockLab (ActiMetrics), 브렌다 이스 리듬 패키지 (D. 휠러, 의학, 휴스턴의 베일러 대학 )과 MAZ (Zordan 외가. 2007).
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 JC에 I. E와 NS061952에 NIH의 부여 NIH34958 지원했습니다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila activity monitor (DAM) | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | DAM2 or DAM5 | DAM2 monitors are more compact, and more can fit into a single incubator |
| Power supply interface unit (for DAM system) | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | PSIU9 | Includes PS9-1 AC Power Supply |
| Light controller | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | LC6 | |
| Pyrex glass tubes | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | PGT5, PGT7, and PGT10 | |
| Plastic activity tube caps | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | CAP5 | Yarn can be used instead of plastic caps. |
| DAM System data collection software | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | Versions available for both Mac and PC | |
| FaasX software | Centre National de la Recherche Scientifique | Only for Mac | |
| Insomniac 2.0 software | University of Pittsburgh School of Medicine | Runs on Matlab. Can be used on both PC and Macintosh. | |
| Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. Percival incubator | Percival Scientific, Inc. | I-30BLL | Interior space dimension:Width: 65cm;Height: 86cm;Depth: 55cm |
| Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. DigiTherm Heating/Cooling Incubator with Circadian Timed Lighting and Timed Temperature | Tritech Research, Inc. | 05DT2CIRC001 | Interior space dimension:Width: 36m;Height: 56m;Depth: 28cm |
| APC Smart-UPS 2200VA 120V (Emergency power backup unit) | APC | SU2200NET | Output Power Capacity of 1600 Watts |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| TissuePrep Paraffin pellets | Fisher Scientific | T565 | Melting point 56°C-57°C |
| Block heater | VWR international | 12621-014 |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Chen, W. F., Low, K. H., Lim, C., Edery, I. Thermosensitive splicing of a clock gene and seasonal adaptation. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 72, 599-606 (2007).
- Chiu, J. C., Vanselow, J. T., Kramer, A., Edery, I. The phospho-occupancy of an atypical SLIMB-binding site on PERIOD that is phosphorylated by DOUBLETIME controls the pace of the clock. Genes Dev. 22, 1758-1772 (2008).
- Dubruille, R., Murad, A., Rosbash, M., Emery, P. A constant light-genetic screen identifies KISMET as a regulator of circadian photoresponses. PLoS Genet. 12, e1000787-e1000787 (2009).
- Glaser, F. T., Stanewsky, R. Temperature synchronization of the Drosophila circadian clock. Curr Biol. 15, 1352-1363 (2005).
- Helfrich-Förster, C. Differential control of morning and evening components in the activity rhythm of Drosophila melanogaster- sex-specific differences suggest a different quality of activity. J Biol Rhythms. 15, 135-154 (2000).
- Hendricks, J. C., Finn, S. M., Pancleri, K. A., Chavkin, J., Williams, J., Sehgal, A., Pack, A. I. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25, 129-138 (2000).
- Ho, K. S., Sehgal, A. Drosophila melanogaster: an insect model for fundamental studies of sleep. Methods Enzymol. 393, 772-793 (2005).
- Koh, K., Evans, J. M., Hendricks, J. C., Sehgal, A. A Drosophila model for age-associated changes in sleep: wake cycles. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 13843-13847 (2006).
- Konopka, R. J., Benzer, S. Clock mutants of Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci USA. 68, 2112-2116 (1971).
- McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends Genet. 20, 384-391 (2004).
- Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. A conditional tissue-specific transgene expression system using inducible GAL4. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12596-12601 (2001).
- Rosato, E., Kyriacou, C. P. Analysis of locomotor activity rhythms in Drosophila. Nature Protocols. 1, 559-568 (2006).
- Sehadova, H., Glaser, F. T., Gentile, C., Simoni, A., Giesecke, A., Albert, J. T., Stanewsky, R. Temperature entrainment of Drosophila's circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain. Neuron. 64, 251-266 (2009).
- Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. A video method to study Drosophila sleep. Sleep. 31, 1587-1598 (2008).
- Zordan, M. A., Benna, C., Mazzotta, G. Monitoring and analyzing Drosophila circadian locomotor activity. In Circadian Rhythms Methods and Protocols. Rosato, E. , Methods in Molecular Biology series. Humana. Totowa, New Jersey. (2007).
