Summary
我们提供了隔离和培养心脏瓣膜内皮细胞（VEC）的纯种群的方法。血管内皮细胞可以分离出了风口浪尖或单张两侧及紧随，底层的间质细胞（VIC）的隔离很简单。
Abstract
心脏瓣膜是全权负责维持心血管系统的单向血液流动。这些薄，纤维组织受到显着的机械应力，因为他们打开和关闭一个寿命超过数十亿倍。这些组织的令人难以置信的耐力是，由于居民瓣膜内皮细胞（VEC）和间质细胞（VIC）的不断响应当地的机械和生物信号的修复和改造。直到最近，我们开始认识到这些细胞的独特的行为，在体外实验中起到了关键作用。尤其是具有挑战性的是血管内皮细胞的分离和文化。必须特别小心使用的那一刻起，该组织是由主机，最后通过电镀删除。在这里，我们目前的直接隔离，边具体隔离，文化，和核查的VEC纯种群的协议。我们使用温柔棉签刮技术打跑只是表面细胞的酶消化。这些细胞，然后收集到管到一个沉淀离心。然后再悬浮颗粒和镀到培养瓶中，与Ⅰ型胶原基质预涂。血管内皮细胞的表型是由接触证实，抑制细菌的生长和PECAM1（CD31），如内皮细胞特异性标志物的表达，血管性血友病因子（vWF），α-平滑肌肌动蛋白（α- SMA）的表达阴性。血管内皮细胞的功能特点与乙酰化低密度脂蛋白水平高。与血管内皮细胞，血管内皮细胞有独特的能力，转化为间质细胞，它通常发生在胚胎阀形成 1 。在显着延长在体外培养后融合，这也可能发生，所以应达到或接近汇合通行。维也纳国际中心纯种群的VEC隔离后，然后可以很容易获得。
Protocol
1。制备
- 在有盖的仪器高压灭菌托盘下列事项：
- 锯齿组织钳 - 对于处理单张组织
- 组织剪（8厘米） - 修剪单张组织和尖
- 棉签 - 从单张或风口浪尖上的内皮细胞层隔离
- 设为无菌胶原酶溶液
- 添加4.0克奶粉的DMEM 250毫升18MΩ的水。
- 添加碳酸氢钠1.11克。
- 新增（600 U / mL）的18万单位的胶原酶。
- 添加1％（3ML）青霉素/链霉素。
- 调整pH值至7.2的解决方案。
- 带来的解决方案，270毫升。
- 穿过一个0.2微米的过滤器消毒的解决方案。
- 添加无菌胎牛血清的10％（30毫升）。
- 设为无菌内皮细胞的培养基
- 添加6.7克奶粉的DMEM 400毫升18MΩ的水。
- 添加碳酸氢钠1.85克。
- 添加（50 U / mL）的25,000单位的肝素。
- 添加1％（5毫升）青霉素/链霉素。
- 调整pH值至7.2的解决方案。
- 带来的解决方案，450毫升。
- 穿过一个0.2微米的过滤器消毒的解决方案。
- 添加无菌胎牛血清的10％（50毫升）。
- 使无菌间质细胞培养基
- 新增13.37克的粉末状的DMEM 800毫升18MΩ的水。
- 添加碳酸氢钠3.7克。
- 添加1％（10毫升）青霉素/链霉素。
- 调整pH值至7.2的解决方案。
- 带来的解决方案，900毫升。
- 穿过一个0.2微米的过滤器消毒的解决方案。
- 添加无菌牛血清的10％（100毫升）。
2。心脏瓣叶的分离
- 海关立即在无菌条件下从后牺牲的心脏主动脉根部。
- 彻底冲洗用冷水无菌DPBS主动脉根部的血液。限制血管内皮细胞死亡和细菌污染，当务之急是尽快删除所有的血液成分。抗生素和antimycotics不建议在这个阶段，因为他们是潜在的有害的血管内皮细胞。
- 直接从根，并在无菌的15 mL锥形管充满了12毫升的冷DPBS隔离瓣叶（阀3％）。摇动数次，以消除碎片，然后重新用新鲜的DPBS。
- 运回实验室在冰上。
- 到达实验室后，将与组织的无菌罩下的容器。
3。内皮细胞层的分离
- 填写每阀冷胶原酶溶液（3传单）3ML无菌的35mm菜。
- 放入充满胶原酶溶液的菜从15 mL试管中的所有三个单张。
- 组织孵育5-10分钟，在37 ° C。
- 旋转到单张表面干燥无菌棉签，轻轻地取出的内皮细胞层。旋转和剪切应用量的方向是对样品的纯度至关重要。棉签旋转应在相反的方向直线运动你的手，创造一个控制剪切。这剪升降机从组织的血管内皮细胞。应用武力的金额应足以感受到组织的阻力，但无法穿透基底膜。
- 偶尔，民建联棉签逐出从尖端纤维细胞内的胶原酶溶液。擦拭完成后，内皮细胞层的质地应该感到稍微比以前更顺畅。
- 收集细胞悬液/胶原酶，并转移到一个新的无菌15ML管。
- 在1000 rpm离心管5分钟颗粒任何分离的细胞，吸出上清液。如果隔离间质细胞，以及执行该协议，而这些细胞正在离心。
- 加入3毫升15毫升管内皮猪中等，离心机，第二次和吸媒体。这第二个离心帮助过滤一些不需要的材料，如尖端纤维。
- 重新暂停离心内皮细胞内皮猪的介质和板细胞在5毫升预涂层的T - 25与胶原瓶（使用1瓶每离心管）。
- 让细胞生长改变内皮介质之前，至少有2-3天。这可以帮助细胞恢复分裂以来的隔离过程是相当苛刻和细胞产量可能低。这是附近汇合的传代细胞的关键，因为接触抑制，可能导致细胞转化。
4。 60毫米培养皿侧具体隔离的制备
- 线60毫米的玻璃培养皿中，用铝箔（2％leafle玻璃菜T）。铝箔有助于消除石蜡，使玻璃培养皿中可用于其他隔离重用。
- 石蜡珠广场内的菜肴，约半满，蒸压盖。
- 一旦完成高压灭菌是石蜡熔化，将菜合奏阴凉平坦的表面。由于石蜡冷却时，它就会变硬，并创建一个层，将支持针头刺破。
- 30分钟后，消毒盘可以作为一个隔离室，固定单张组织。
5。买方指定的内皮细胞层的分离
- 从15ML管和准备方具体隔离60毫米培养皿中删除的传单。
- 操纵的小册子，使ventricularis面朝离开的fibrosa一面暴露的表面上的石蜡。为单张的边缘暴露的内皮细胞层。
- 放置在每一个（向上的）内皮表面冷胶原酶几滴孵育5-10分钟的组织，在37 ° C。
- 一如以往，由旋转到单张的表面干燥无菌棉签轻轻取出的内皮细胞层。旋转和剪切应用量的方向是对样品的纯度至关重要。棉签旋转应在相反的方向直线运动你的手，创造一个控制剪切。这剪升降机从组织的内皮细胞，别无其他。应用武力的金额应足以感受到组织的阻力，但不穿透内组织。
- 偶尔，民建联棉签逐出从尖端纤维细胞内的胶原酶溶液。擦拭完成后，内皮细胞层的质地应该感到稍微比以前更顺畅。
- 收集细胞悬液/胶原酶，并转移到一个新的无菌15ML管。标签上注明方的特殊性（可以汇集来自同一阀单张）。
- 单张转移到一个新的培养皿中，使ventricularis方现在已经公开，并重复步骤（5.3-5.6）。
- 一旦所有的细胞悬液/胶原酶的收集，在1000 rpm离心管5分钟颗粒任何分离的细胞和吸出上清液。如果隔离间质细胞，以及执行该协议，而这些细胞正在离心。
- 加入3毫升猪血管内皮中管，离心机，第二次和抽吸介质。这第二个离心帮助过滤一些不需要的材料，如尖端纤维。
- 重悬离心内皮细胞预涂层的T - 25瓶与拼贴（1％使用离心管瓶）内皮猪的介质和板细胞在5毫升。
- 让细胞生长改变内皮介质之前，至少有2-3天。这可以帮助细胞恢复分裂以来的隔离过程是相当苛刻。如果您发现产量很低，考虑到一个较小的瓶或孔板，因为细胞 - 细胞黏附，促进细胞生长。请记住，通过附近汇合，因为接触抑制，可能导致细胞转化。
6。间质细胞的分离
- 填写胶原酶每个阀解决方案（3传单）10毫升无菌的15 mL离心管中。
- 擦拭内皮细胞的传单后，立即将在适当的15ML管胶原酶溶液。
- 孵育约12至18小时（如果需要的话，鼓动轻轻）。
- 退化的组织与血清学移液器轻轻混合直到细胞悬液/胶原酶变得同质化。这种同质化，有助于打破了组织和间质细胞释放。
- 在1000 rpm离心5分钟的消化组织，吸出上清液。
- 添加5毫升间质性猪液15ML管，离心第二次，吸出上清液。
- 重新暂停5毫升间质性猪的介质和板细胞离心内皮细胞的T - 75瓶（使用1％的离心管瓶）。
- 让细胞生长改变的间质细胞液之前，至少有1-2天。将远远超过组织的内皮细胞，但预计的碎片。细胞也应该更快地成长，以汇合比的内皮细胞，因为细胞的产量和其性质。
7。代表性的图像
图1：在2-3天，后隔离分离出的细胞形态。 （一）血管内皮细胞表现出典型的内皮细胞的形态和形成集群，促进经济增长。 （二）维也纳国际中心的形态是类似的肌纤维母细胞，一般主轴形和均匀传遍烧瓶。
图2：在汇合分离的细胞形态。 （一）血管内皮细胞表现出典型的内皮形态，这是一般的鹅卵石和生长接触抑制。 （二）维也纳国际中心的形态是类似一般主轴形和不生长接触抑制肌纤维母细胞。
图3。分离的细胞的功能特点6。 （一）血管内皮细胞与乙酰化低密度脂蛋白摄取的高级别（红色）。 （二）电话与乙酰化低密度脂蛋白的摄取水平低。
图4 6分离的细胞的细胞标记。 （一）血管内皮细胞表型血管性血友病因子（绿色），蓝色（细胞核）染色阳性。 （二）电话表型血管性血友病因子的负染色。
图5分离的细胞的细胞标记。 （一）血管内皮细胞的表型是阿尔法SMA（绿色），蓝色（核）负染。 （二）电话表型为αSMA的阳性染色。
| 解离剂 | 解离技术 | 细胞采集 | 细胞数量 | 细胞 纯度 | 污染 |
| EDTA（3毫米），不含氯化钙 2 | 5，20，60分钟。 氯化钙加前 | 20，60，120分钟。收藏前 | - | + / - | + + |
| EDTA（6mm）的无氯化钙 | 5，20，60分钟。 氯化钙加前 | 20，60，120分钟。收藏前 | + / - | + | + + |
| 胰蛋白酶EDTA（0.5 g / L的） | 5，10，15分钟。 前停用 | 中等收集立即 | + | + | + |
| 胶原酶II（300 U / mL的） | 5，10，15分钟。 前停用 | 中等收集立即 | - + + + | - + + + | + |
| 胶原酶Ⅱ（600单位/毫升） | 5，10，15分钟。 前停用 | 中等收集立即 | + + + + + | + + + + - | - |
表1初步瓣膜内皮细胞的分离协议的结果。
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Discussion
技术隔离的困难和心脏瓣膜内皮细胞的培养纯人口已经受损的瓣膜生物学的理解。典型的隔离技术涉及的底层基础矩阵内皮胶粘剂债券2,3或化学分解酶消化。初步分离实验进行了定性评估，不同的解离剂和潜伏期。这些实验结果表明，EDTA（或胰蛋白酶- EDTA）的潜伏期长达60分钟撞出细胞不成功。然而，检索纯瓣膜内皮细胞（表1）的可用数量为5-10分钟collagense消化证明是有效的。其他酶解决方案已经提出，如补充dispase，能够专门针对IV型胶原和纤维连接蛋白是主要组成部分的基础矩阵 4的一个金属蛋白酶。解放区的细胞可以净化通过克隆扩增或磁性选择方法，如额外的处理。
最近的证据表明，主动脉瓣包含一个类型的细胞，这可能会导致困难评估细胞表型时，的分布非常庞杂。相反，在血管内皮细胞，血管内皮细胞也赞同应垂直于流体的流动方向 6 。后侧面的特异性和机械环境依赖的血管内皮细胞的表达谱。被确定为主动脉与左心室侧血管内皮细胞在体内有不同的内皮细胞表型。该基因的表达谱表明，内皮细胞上的主动脉侧阀门容易发生钙化方，通过抗氧化机制 7保护，但对炎症启动。内皮细胞在剪切流的存在，下调如BMP - 4和POSTN钙化的基因，保留其静态的表型。剪切流动，似乎作为一个从软骨/成骨细胞分化，这是一个可能的解释心室内皮保护内皮细胞类型的保护措施。
克隆人肺主动脉瓣的隔离也提出了存在α- SMA，CD144和CD31表达不同数量的内皮前体细胞的频谱。有些人表现过渡到一个间充质的表型，类似于EMT的，特别是在不同程度的反应9至TGFB2。克隆隔离被证明是一个净化细胞群的有效途径，但特定的亚群，可能有表型的独特性，不普及的选择。这是非常重要的内皮细胞表面，因为许多其他类型的细胞在非零数量目前的。这些措施包括循环内皮细胞，骨髓细胞和单核细胞，所有这些都可以表达一个或多个内皮样的特点10，11 。此外，克隆株经过多次的细胞分裂，达到合适的实验，在这点，将有senesced许多非祖细胞的表型或去分化的细胞数量。因此，如这里所描述的主要细胞的分离提供了最好的本土阀门内皮人口的代表性。将面临的挑战，以确定是否出现的子表型是内在的，或出现对外界刺激的不同反应。通过这种方法，应该能够确定具体的治疗及其后果的患病率相对。
磁性排序方法也提供了一个净化的细胞群的方式，但，是高度依赖后，抗体标记的条件和派生的细胞群。随着日益增加的了解阀门的细胞群，如CD31的内皮标记，CD144，和消极的α- SMA的可能没有足够的排序为纯瓣膜人口。克隆隔离证明，内皮细胞包含广泛的标记与排序可能不准确的表达。当排序的内皮细胞CD31的排序，样品纯度提高到近96％。然而，间质细胞开始重新出现在有一天成长，汇合后4文化。虽然磁性排序是一种选择，应考虑额外的标记和表达水平，如CAD - 11和积极periostin 6负的排序。
我们提供了隔离和培养心脏瓣膜内皮细胞（VEC）的纯种群的方法。使用这种方法，额外的处理，如克隆分离和磁性的选择方法，可以消除方具体的内皮细胞，实现了代表的人口。评估人口时，细胞的形态，功能特征，多个标记，并表达水平都应该考虑。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项研究是由美国国家科学基金会职业奖，哈特韦尔基金会，和美国心脏协会（＃0830384N）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Mediatech, Inc. | 50-103-PB | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 26140 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25200 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H4784-1G | |
| Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 21300-058 | |
| Rat Tail Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Critical Swabs | VWR international | 89031-270 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 55761 | |
| T25 Flasks | BD Biosciences | 353018 | |
| T75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | |
| 24 Well Plate | Falcon BD | 353047 | |
| 60x15 mm Dishes | VWR international | 25384-092 | |
| 60x15 Glass Dishes | VWR international | 89000-310 | |
| Paraffin Embedding Wax | Electron Microscopy Sciences | 19304-01 | |
| Precision Glide Needles | BD Biosciences | 305165 | |
| 500 mL Nalgene Filters | VWR international | 73520-985 | |
| 1L Nalgene Filters | VWR international | 73520-986 | |
| Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11023-15 | |
| FSC Tweezers #5 | Fine Science Tools | 11295-00 |
References
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