Summary
Vi erbjuder en metod för att isolera och odling rena populationer av endotelceller hjärtklaff celler (VEC). VEC kan isoleras från vardera sidan av randen eller broschyren och omedelbart efter, är underliggande interstitiella celler (VIC) isolering okomplicerat.
Abstract
Hjärtklaffar är ensamt ansvariga för enkelriktad blodflödet genom det kardiovaskulära systemet. Dessa tunna, fibrösa vävnaden utsätts för stora mekaniska påfrestningar som de öppna och stänga flera miljarder gånger under en livstid. Den otroliga uthållighet av dessa vävnader beror på den inhemska valvulär endothelial (VEC) och interstitiella celler (VIC) som ständigt reparerar och renoverar som svar på lokala mekaniska och biologiska signaler. Först nyligen har vi börjat förstå de unika beteenden hos dessa celler, som in vitro experiment har spelat en nyckelroll. Särskilt utmanande är den isolering och odling av VEC. Särskild försiktighet måste användas från det att vävnad tas bort från värddatorn genom sista plätering. Här presenterar vi protokoll för direkt isolering, sida specifika isolering, kultur, och verifiering av rena populationer av VEC. Vi använder enzymatisk spjälkning följt av en mjuk kompress skrapning teknik för att få bort bara ytan celler. Dessa celler är sedan samlas i ett rör och centrifugeras i en pellet. Pelleten är då återsuspenderade och klädd i kultur kolvar före belagda med kollagen I matris. VEC fenotyp bekräftas av kontakt hämmad tillväxt och ett uttryck av endotelceller specifika markörer som PECAM1 (CD31), von Willebrands faktor (vWF), och negativa uttryck av alfa-glatt muskulatur aktin (α-SMA). Den funktionella egenskaper VEC är förknippade med höga nivåer av acetylerade LDL. Till skillnad från vaskulära endotelceller, VEC har den unika förmågan att förvandla sig till mesenkym, vilket normalt inträffar under fosterutvecklingen ventil bildandet 1. Detta kan också ske under betydligt längre inlägg konfluenta in vitro-kultur, så försiktighet bör göras för passage vid eller nära sammanflödet. Efter VEC isolering kan rena populationer av VIC sedan lätt förvärvas.
Protocol
1. Förberedelser
- Autoklav i en täckt instrument fack följande poster:
- Räfflade vävnad pincett - för att hantera information vävnaden
- Tissue sax (8 cm) - För trimning bipacksedel vävnad och kuspar
- Bomullspinnar - För att isolera endotelceller lagret från broschyren eller kusp
- Gör steril kollagenas lösning
- Tillsätt 4,0 gram pulveriserad DMEM till 250 ml 18 Mohm vatten.
- Tillsätt 1,11 gram natriumbikarbonat.
- Lägg (600 U / ml) 180 tusen enheter av kollagenas.
- Tillsätt 1% (3 ml) Penicillin / streptomycin.
- Justera lösningens pH till 7,2.
- Koka upp lösningen upp till 270 ml.
- Sterilisera lösningen genom att passera genom en 0,2 ìm filter.
- Lägg till 10% (30 ml) sterilt fetala bovint serum.
- Gör sterila endotelceller medelstora
- Tillsätt 6,7 gram pulveriserad DMEM till 400 ml 18 Mohm vatten.
- Tillsätt 1,85 gram natriumbikarbonat.
- Tillsätt (50 U / ml) 25 tusen enheter heparin.
- Tillsätt 1% (5 ml) Penicillin / streptomycin.
- Justera lösningens pH till 7,2.
- Koka upp lösningen upp till 450 ml.
- Sterilisera lösningen genom att passera genom en 0,2 ìm filter.
- Lägg till 10% (50mL) steril fetala bovint serum.
- Gör sterila interstitiella celler medelstora
- Lägg till 13,37 gram pulver DMEM till 800 ml 18 Mohm vatten.
- Tillsätt 3,7 gram natriumbikarbonat.
- Tillsätt 1% (10 mL) Penicillin / streptomycin.
- Justera lösningens pH till 7,2.
- Koka upp lösningen upp till 900 ml.
- Sterilisera lösningen genom att passera genom en 0,2 ìm filter.
- Lägg till 10% (100 ml) i sterilt bovint serum.
2. Isolering av flygblad hjärtklaff
- Punktskatter på aortaroten omedelbart och aseptiskt från hjärtat efter offer.
- Skölj aortaroten av blod med kallt sterilt DPBS. Det är absolut nödvändigt att ta bort alla blodkomponenter så snart som möjligt för att begränsa VEC död och bakteriell kontamination. Antibiotika och antimykotika inte rekommenderas i detta skede eftersom de är potentiellt skadliga för VEC.
- Isolera ventilen broschyrer (3 per ventil) direkt från roten och placera i en steril 15 ml koniska rör fyllt med 12 ml kallt DPBS. Skaka flera gånger för att avlägsna skräp och fyll med färsk DPBS.
- Transport tillbaka till labbet på is.
- Vid ankomst till laboratoriet, placera behållaren med vävnaden under sterila huven.
3. Isolering av endotelceller lager
- Fyll en steril 35mm fat med 3 ml av kallt kollagenas lösning per ventil (3 broschyrer).
- Lägg alla tre broschyrer från 15 ml tub i skålen fylld med kollagenas lösningen.
- Inkubera vävnaden i 5-10 minuter vid 37 ° C.
- Ta försiktigt bort endothelial lagret genom att rotera en torr steril kompress på ytan av bipacksedeln. Rotationsriktningen och mängden skjuvning tillämpas är avgörande för renheten av ditt prov. Rotationen av pinnen ska vara i en motsatt riktning mot linjär rörelse av din hand skapa en kontrollerad skjuvning. Denna klippa är vad lyfter endotelceller från vävnaden. Mängden kraft som bör räcka för att känna motståndet i vävnaden, men inte tränga igenom basalmembranet.
- Ibland, sandskädda pinnen inom kollagenas lösningen att lossa cellerna från spetsen fibrer. Efter badda är klar, bör strukturen på endotelceller lagret kännas lite mjukare än tidigare.
- Samla cellsuspensionen / kollagenas och överför till en ny steril 15ml tub.
- Centrifugera rören vid 1000 rpm i 5 minuter till pellets några isolerade celler och aspirera supernatanten. Om isolera interstitiella celler och utför det protokollet medan dessa celler att centrifugeras.
- Tillsätt 3 ml av endotelceller svin papper till 15 mL rör, centrifugera en andra gång, och media aspirera. Denna andra centrifugering hjälper filtret några av de oönskade material som spets fibrer.
- Återuppslamma centrifugerade endotelcellerna i 5 ml endotelceller svin medium och platta celler i en pre-belagd T-25 kolv med kollagen (använd en kolv per centrifugrör).
- Låt cellerna växa minst 2-3 dagar innan du byter endothelial medium. Detta hjälper cellerna att återhämta sig och dela sedan isoleringen processen är ganska hårda och cellen avkastning kan vara låg. Det är viktigt att passagen celler nära sammanflödet sedan kontakt hämning kan leda till cell transformation.
4. Beredning av 60 mm Kultur skålen för Side Särskilda Isolering
- Line 60 mm glas petriskålar med aluminiumfolie (2 glas rätter per leaflet). Den aluminiumfolie hjälper till att avlägsna paraffin, så att glaset petriskål kan återanvändas för andra isoleringar.
- Placera paraffin pärlor inom mat, ungefär halvfull, och täcker för autoklavering.
- När autoklavering är klar och paraffin är smält, flytta skålen ensemblen till en cool plan yta. Som paraffin svalnar kommer den att hårdna och skapa ett lager som kommer att stödja nålstick.
- Efter 30 minuter kan steriliseras skålen sedan användas som en isolerad kammare för att immobilisera bipacksedel vävnad.
5. Isolering av Side Särskilda endothelial lager
- Ta ut flygblad från 15ml tuber och placera på beredd 60mm kultur maträtt för sida specifika isolering.
- Manipulera information så att ventricularis är vänd nedåt på paraffin ytan lämnar fibrosa sidan exponeras. Nåla fast kanterna på bipacksedeln att exponera endothelial lagret.
- Placera några droppar kallt kollagenas på varje (uppåt-vända) endotelceller yta och inkubera vävnaden i 5-10 minuter vid 37 ° C.
- Liksom tidigare försiktigt bort endothelial lagret genom att rotera en torr steril kompress på ytan av bipacksedeln. Rotationsriktningen och mängden skjuvning tillämpas är avgörande för renheten av ditt prov. Rotationen av pinnen ska vara i en motsatt riktning mot linjär rörelse av din hand skapa en kontrollerad skjuvning. Denna klippa är vad lyfter endotelceller från vävnaden och inget annat. Mängden kraft som bör räcka för att känna motståndet i vävnaden, men inte tränga in i vävnaden.
- Ibland, sandskädda pinnen inom kollagenas lösningen att lossa cellerna från spetsen fibrer. Efter badda är klar, bör strukturen på endotelceller lagret kännas lite mjukare än tidigare.
- Samla cellsuspensionen / kollagenas och överför till en ny steril 15ml tub. Ange sida specificitet på etiketten (broschyrer från samma ventil kan samlas tillsammans).
- Överför broschyrer till en ny kultur maträtt så att ventricularis sidan är nu utsatta och upprepa steg (5,3-5,6).
- När alla cellsuspension / kollagenas samlas, centrifugera rören vid 1000 rpm för 5minutes till pellets några isolerade celler och aspirera supernatanten. Om isolera interstitiella celler och utför det protokollet medan dessa celler att centrifugeras.
- Tillsätt 3 ml av endotelceller svin medium till rören, centrifugera en andra gång, och aspirera media. Denna andra centrifugering hjälper filtret några av de oönskade material som spets fibrer.
- Återuppslamma centrifugerade endotelcellerna i 5 ml endotelceller svin medium och platta celler i en pre-belagd T-25 kolv med collage (använd en kolv per centrifugrör).
- Låt cellerna växa minst 2-3 dagar innan du byter endothelial medium. Detta hjälper cellerna att återhämta sig och dela sedan isoleringen processen är ganska hård. Om du märker att avkastningen är mycket låg, överväga att flytta till en mindre kolv eller brunnar sedan cell-cell adhesion främjar celltillväxt. Kom ihåg att passagen nära sammanflödet sedan kontakt hämning kan leda till cell transformation.
6. Isolering av interstitiella celler
- Fyll en steril 15 ml rör Centrifug med 10 ml kollagenas lösning per ventil (3 broschyrer).
- Efter badda flygblad i endotelceller, omedelbart placera dem i lämplig 15ml röret med kollagenas lösningen.
- Inkubera i cirka 12 till 18 timmar (agitera försiktigt om så önskas).
- Blanda ned vävnaden försiktigt med en serologisk pipett tills cellsuspension / kollagenas blir homogeniserad. Denna homogenisering hjälper till att bryta upp vävnaden och släpp interstitiella celler.
- Centrifugera det rötade vävnaden i 5 minuter vid 1000 rpm och aspirera supernatanten.
- Tillsätt 5 ml interstitiell svin papper till 15ml rör, centrifugera en andra gång, och aspirera supernate.
- Återuppslamma centrifugerade endotelcellerna i 5 ml interstitiell svin medium och platta celler i en T-75 kolv (använd en kolv per centrifugrör).
- Låt cellerna växa minst 1-2 dagar innan du byter interstitiella celler medium. Det kommer att vara mycket mer vävnad skräp än med endotelceller, men som förväntas. Cellerna måste också växa till sammanflödet snabbare än endotelceller på grund av cellen avkastning och deras natur.
7. Representant bilder
Figur 1. Morfologi av isolerade celler vid 2-3 dagar efter isolering. (A) VEC uppvisar en typisk endotelceller morfologi och bilda kluster för att främja tillväxt. (B) VIC morfologi liknar myofibroblaster som i allmänhet är spindeln formas och jämnt fördelade över hela kolven.
Figur 2. Morfologi av isolerade celler vid confluency. (A) VEC uppvisar en typisk endotelceller morfologi som i allmänhet är kullersten och tillväxt kontakt hämmas. (B) VIC morfologi liknar myofibroblaster som i allmänhet är spindeln formade och inte tillväxt kontakt hämmas.
Figur 3. Funktionen egenskaper isolerade celler 6. (A) VEC är förknippade med höga nivåer av acetylerade LDL-upptag (röd). (B) VIC är förknippade med låga nivåer av acetylerade LDL-upptag.
Figur 4. Cellular markörer av isolerade celler 6. (A) VEC fenotyp bidragit till en positiv färgning för von Willebrand-faktor (grön), blå (kärnor). (B) VIC fenotyp bidrog till negativ färgning för von Willebrands faktor.
Figur 5. Cellular markörer av isolerade celler. (A) VEC fenotyp bidrog till negativ färgning för Alpha SMA (grön), blå (kärnor). (B) VIC fenotyp bidragit till en positiv färgning för Alpha SMA.
| Dissociation Agent | Dissociation Teknik | Cell Collection | Cell Kvantitet | Cell Renhet | Föroreningar |
| EDTA (3mm) utan CaCl 2 | 5, 20, 60 min. innan CaCl 2 utöver | 20, 60, 120 min. före insamlingen | - | + / - | + + + |
| EDTA (6mm) utan CaCl 2 | 5, 20, 60 min. innan CaCl 2 utöver | 20, 60, 120 min. före insamlingen | + / - | + | + + + |
| Trypsin-EDTA (0,5 g / L) | 5, 10, 15 min. innan avaktivering | Medium uppbäras omedelbart | + | + | + + |
| Kollagenas II (300 U / ml) | 5, 10, 15 min. innan avaktivering | Medium uppbäras omedelbart | -, +, + + | -, + +, + | + |
| Kollagenas II (600 U / ml) | 5, 10, 15 min. innan avaktivering | Medium uppbäras omedelbart | +, + +, + + + | + +, + +, - | - |
Tabell 1. Resultat av preliminära valvulär endotelceller protokoll cell isolering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En förståelse av valvulär biologi har minskat till följd av tekniska svårigheter att isolera och odling rena populationer av valvulär endotelceller. Typiska isolering tekniker innebär enzymatisk nedbrytning av den underliggande basala matris eller kemisk dissociation av endotelceller självhäftande obligationer 2,3. Preliminära isolering experiment var bedömda kvalitativt genom att variera dissociation agenter och perioder inkubation. Resultaten av dessa experiment visade att EDTA (eller Trypsin-EDTA) inkubering i upp till 60 minuter misslyckades vid lossnar celler. Emellertid visade sig en collagense matsmältningen i 5-10 minuter effektiv för att hämta en användbar antal rena valvulär endotelceller (tabell 1). Andra enzym lösningar har föreslagits, t.ex. komplettera med dispase, en metalloprotease kapabla att särskilt inrikta IV kollagen typ och fibronektin som är huvudkomponenter i den underliggande matris 4. Frigjorda celler kan renas genom ytterligare bearbetning såsom klonal expansion eller magnetisk urvalsmetoder 5.
Nya rön har föreslagit att aortaklaffen innehåller en mycket ojämn fördelning av celltyper som kan leda till svårigheter vid bedömningen av cellulära fenotyper. I motsats till vaskulära endotelet bör VEC anpassa även vinkelrätt mot riktningen av vätskeflöde 6. Transkriptionell profiler VEC är beroende av båda sidorna specificitet och mekanisk miljö. Aorta-kontra ventrikulära sidan endotel har identifierats som med avgränsade endotelceller fenotyper in vivo. Den genuttryck profiler tyder på att endotelet på aorta sidan ventilen är benägen att förkalkning sidan men skyddas mot inflammatoriska inleder antioxidativa mekanismer 7. I närvaro av skjuvning flöde, endotelcellerna regleras ner calcific gener som BMP-4 och POSTN behålla sin vilande fenotyp. Shear flödet verkar fungera som en skyddsåtgärd för endotelceller typer från chondro / osteogenic differentiering, vilket är en möjlig förklaring till den ventrikulära endoteliala skydd 8.
Klonat isoleringar från mänskliga pulmonell aorta ventilerna har föreslagit ett spektrum av endotelceller stamceller existerar uttrycka olika mängder av α-SMA, CD144, och CD31. En del visade sig övergång till ett mesenkymala fenotyp, analogt med EMT, som svar till TGFB2 på varierande grad 9. Klonat isolering visa sig vara ett effektivt sätt att rena cellpopulationer, men väljer för särskilda befolkningsgrupper som kan ha fenotypisk unikhet som inte är generaliserbara. Detta är mycket viktigt för utanpåliggande endotel, som många andra celltyper finns i noll mängder. Dessa inkluderar cirkulerande endotelceller, benmärg härledda celler och monocyter, som alla kan uttrycka en eller flera endotel-liknande egenskaper 10, 11. Dessutom klonal isolerar genomgå många celldelningar att nå lämplig cell nummer för experiment, då många icke-stamceller fenotyper har senesced eller dedifferentiated. Därför ger primärcell isolering som beskrivs här den bästa representationen av den infödda ventilen endothelial befolkningen. Utmaningen blir att avgöra om sub-fenotyper som framkommer är inneboende eller ur differential reaktioner på yttre stimuli. Med detta synsätt bör man kunna bedöma den relativa förekomsten av varje och deras konsekvenser som svar på specifika behandlingar.
Magnetisk sortering metoder har också ett sätt att rena cellpopulationer, men är starkt beroende av villkor antikroppar märkning och härledda cellpopulation. Med den ständigt ökande cellen förståelse ventil populationer, endotelceller markörer som CD31, CD144, och negativa α-SMA kan inte vara tillräckligt för att sortera för en ren valvulär befolkning. Klonat isoleringar har visat att endotelceller innehåller ett brett spektrum av markör uttryck leder till eventuella felaktigheter med sorteringen. När endotelceller sorteras celler sorterades för CD31, utökade stickprovet renhet till nästan 96%. Emellertid började interstitiella celler att dyka upp i kulturer vuxit en dag efter sammanflödet 4. Även magnetisk sortering är ett alternativ, bör man överväga att sortera för ytterligare markörer och nivåer uttryck som positiv för CAD-11 och negativa för periostin 6.
Vi erbjuder en metod för att isolera och odling rena populationer av endotelceller hjärtklaff celler (VEC). Med denna metod, ytterligare bearbetning såsom klonal isolering och magnetiska urvalsmetoder kan elimineras för att uppnå en representativ population av sidan specifika endotelceller. Cellmorfologin, funktionella egenskaper, multipla markörer och nivåer uttryck alla bör beaktas vid bedömningen av befolkningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna forskning stöds av NSF KARRIÄR priset, Hartwell Foundation och American Heart Association (# 0830384N).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Mediatech, Inc. | 50-103-PB | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 26140 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25200 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H4784-1G | |
| Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 21300-058 | |
| Rat Tail Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Critical Swabs | VWR international | 89031-270 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 55761 | |
| T25 Flasks | BD Biosciences | 353018 | |
| T75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | |
| 24 Well Plate | Falcon BD | 353047 | |
| 60x15 mm Dishes | VWR international | 25384-092 | |
| 60x15 Glass Dishes | VWR international | 89000-310 | |
| Paraffin Embedding Wax | Electron Microscopy Sciences | 19304-01 | |
| Precision Glide Needles | BD Biosciences | 305165 | |
| 500 mL Nalgene Filters | VWR international | 73520-985 | |
| 1L Nalgene Filters | VWR international | 73520-986 | |
| Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11023-15 | |
| FSC Tweezers #5 | Fine Science Tools | 11295-00 |
References
- Thompson, R. P., Fitzharris, T. P. Morphogenesis of the truncus arteriosus of the chick embryo heart: the formation and migration of mesenchymal tissue. Am J Anat. 154, 545-556 (1979).
- Johnson, C. M., Fass, D. N. Porcine cardiac valvular endothelial cells in culture: A relative deficiency of fibronectin synthesis in vitro. Lab Invest. 49 (5), 589-598 (1983).
- Manduteanu, I., Popov, D., Radu, A., Simionescu, M. Calf cardiac valvular endothelial cells in culture: production of glycosaminoglycans, prostacyclin and fibronectin. J Mol Cell Cardiol. 20 (2), 103-118 (1988).
- Cheunyg, W. Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells. JHVD. 17 (6), 674-681 (2008).
- Paranya, G., Vineberg, S., Dvorin, E., Kaushal, S., Roth, S. J., Rabkin, E., Schoen, F. J., Bischoff, J. Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro. Am J Pathol. 159 (4), 1335-1343 (2001).
- Butcher, J. T., Penrod, A., Garcia, A. J. M., Nerem, R. M. Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments. Arterioscler Thromb Vasc Bio. 24 (1), 1429-1434 (2004).
- Simmons, C. A., Grant, G. R., Manduchi, E., Davies, P. F. Spatial heterogeneity of endothelial phenotypes correlates with side-specific vulnerability to calcification in normal porcine aortic valves. Circ Res. 96, 792-799 (2005).
- Butcher, J. T., Tressel, S., Johnson, T., Turner, D., Sorescu, G., Jo, H., Nerem, R. M. Transcriptional Profiles of Valvular and Vascular Endothelial Cells Reveal Phenotypic Differences: Influence of Shear Stress. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 69-69 (2006).
- Parachuri, S., Yang, J. H., Aikawa, E., Melero-Martin, J. M., Khan, Z. A., Loukogeorgakis, S., Schoen, F. J., Bischoff, J. Human Pulmonary Valve Progenitor Cells Exhibit Endothelial/Mesenchymal Plasticity in Response to Vascular Endothelial Growth Factor-A and Transforming Growth Factor-β2. Circ Res. 99 (8), 861-869 (2006).
- Shi, Q. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92, 362-367 (1998).
- Rehman, J., Li, J., Orschell, C. M., March, K. L. Peripheral blood endothelial progenitor cells are derived from monocyte/macrophages and secrete angiogenic growth factors. Circulation. 107, 1164-1169 (2003).
