Summary
यह लेख अलग के लिए एक विधि और संवर्धन बटेर या चिकन HH14 प्रदान करेगा
Abstract
उचित और भ्रूण हृदय वाल्व के गठन समारोह विकासात्मक प्रगति के लिए महत्वपूर्ण है. जल्दी भ्रूण दिल endocardium की एक U-आकार की ट्यूब मायोकार्डियम से घिरा हुआ है. मायोकार्डियम secretes हृदय जेली, एक hyaluronan अमीर atrioventricular जंक्शन (ए वी) और बहिर्वाह पथ लुमेन (ओ एफ टी) में पतला मैट्रिक्स,. HH14 valvulogenesis स्तर पर शुरू होता है जब endocardial कोशिकाओं के एक सबसेट मायोकार्डियम से संकेत प्राप्त करते हैं, mesenchymal परिवर्तन (EMT) के लिए endocardial, गुजरना और हृदय जेली आक्रमण. वाल्वुलर कुशन HH25 स्तर पर पूरी तरह से mesenchymalized कर रहे हैं और यह इस mesenchyme है कि अंततः दिल की वाल्वुलर और septal तंत्र रूपों है. तंत्र है कि शुरू करने और मिलाना EMT और सेल भेदभाव की प्रक्रिया को समझना गंभीर जन्मजात हृदय दोष के लिए अपने कनेक्शन की वजह से महत्वपूर्ण हैं. इस अध्ययन में हम वर्तमान तरीकों पूर्व EMT endocardial और बाद EMT mesenchymal कोशिकाओं है, जो prevalvular तकिया के दो अलग अलग सेल phenotypes कर रहे हैं अलग. प्री - EMT endocardial कोशिकाओं के साथ या मायोकार्डियम बिना सभ्य जा सकता है. डाक EMT ए.वी. तकिया mesenchymal कोशिकाओं के अंदर विवश यंत्रवत् या तनाव मुक्त कोलेजन जैल सुसंस्कृत किया जा सकता है. इन विट्रो मॉडल में इन 3D कुंजी वाल्वुलर morphogenic घटनाओं की नकल और जल्दी और देर चरण valvulogenesis के तंत्र deconstructing के लिए उपयोगी होते हैं.
Protocol
1. तैयार
- 14 चरण के लिए उपजाऊ बटेर या चिकन अंडे सेते हैं - या 25 (2 दिनों के बारे में) (के बारे में 4.5 दिनों) 60% आर्द्रता और 37 डिग्री सेल्सियस पर
- बाँझ अर्ल बैलेंस्ड नमक समाधान तैयार (EBSS)
- 600 एमएल 18 MΩ पानी के लिए 100 एमएल 10X EBSS जोड़ें
- 2.2 ग्राम सोडियम बिकारबोनिट जोड़ें
- 7.2 करने के लिए समाधान के पीएच को समायोजित करें
- 1000 एमएल समाधान लाओ
- एक 0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से गुजर द्वारा समाधान जीवाणुरहित
- बाँझ M199 संस्कृति मध्यम तैयार.
- 700 एमएल 18 MΩ पानी M199 पाउडर के 1 पैकेज जोड़ें.
- 2.2 ग्राम सोडियम बिकारबोनिट जोड़ें
- 7.2 करने के लिए समाधान के पीएच समायोजित करें.
- 10 (1%) एमएल पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ें
- 1000 एमएल समाधान लाओ
- एक 0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से गुजर द्वारा समाधान जीवाणुरहित
- 1 एमएल बाँझ 100X पूरक इंसुलिन transferrin - सेलेनियम जी जोड़ें
- 10 (1%) एमएल बाँझ चिकन सीरम जोड़ें
- 1.5 मिलीग्राम / एमएल के एक कोलेजन एकाग्रता में तीन आयामी कोलेजन जैल तैयार करें. हमारी प्रयोगशाला में पिछले काम दिखाया गया है कि अधिक से अधिक मिलीग्राम / एमएल 1.5 के कोलेजन एकाग्रता एक मैट्रिक्स है कि बहुत biomechanically है कोशिकाओं के लिए कड़ी के माध्यम से स्थानांतरित करने के लिए प्रदान करता है. कोलेजन जेल सांद्रता 1.5 मिलीग्राम / एमएल इतना कुछ कोलेजन फाइबर है कि सेल पेड़ों का झुरमुट फाइबर स्थानीय रूप से टुकड़ा कर सकते हैं, कोशिकाओं के एक द्वीप का निर्माण किया है की तुलना में कम है.
- एक बाँझ क्रम में 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब निम्नलिखित बर्फ ठंड अभिकर्मकों जोड़ें:
- 3X M199 = कुल मात्रा के लिए आवश्यक / 3 वॉल्यूम:
- बाँझ 18 MΩ पानी: वॉल्यूम = कुल आवश्यक मात्रा (M199 + मात्रा चिकन सीरम की मात्रा + 0.1 एम NaOH मात्रा + कोलेजन की मात्रा)
- बाँझ चिकन सीरम: वॉल्यूम = कुल मात्रा आवश्यक 0.01 *
- चूहा पूंछ कोलेजन मैं: = वॉल्यूम कोलेजन (कोलेजन जेल एकाग्रता आवश्यक * कुल मात्रा) / शेयर एकाग्रता
- बाँझ: 0.1 एम NaOH वॉल्यूम = कोलेजन की मात्रा 0.2 *
नोट: पानी की मात्रा, 0.1 एम NaOH, कोलेजन और कोलेजन स्टॉक समाधान की एकाग्रता के आधार पर अलग अलग होंगे.
- एक बाँझ विंदुक के साथ कोलेजन समाधान अच्छी तरह मिक्स.
- तुरंत 1.9 सेमी 2 विकास क्षेत्र के कुओं में कोलेजन समाधान के 0.3 एमएल हस्तांतरण . यह पर्याप्त कोलेजन के समाधान के लिए पूरी तरह से अच्छी तरह से कवर और एक जेल है कि लगभग 3 मिमी मोटी है प्रदान है. कम से कम 250 सुक्ष्ममापी की एक जेल मोटाई सेल आक्रमण के अध्ययन के लिए आवश्यक है.
- कोलेजन जेल करने के लिए समाधान की अनुमति दें कम से कम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% 2 सीओ, और 100 % नमी.
- एक बाँझ क्रम में 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब निम्नलिखित बर्फ ठंड अभिकर्मकों जोड़ें:
2. प्री - EMT endocardial सेल अलगाव और संस्कृति
- भ्रूण अलगाव
- अंडे के बड़े अंत पर एक इंच प्रयोगशाला टेप का लंबा टुकड़ा रखें. यह वह जगह है जहाँ हवा सेल स्थित है. टेप नाजुक बटेर अंडे खोल स्थिर है.
- धीरे पंचर निष्फल घुमावदार कैंची की नोक के साथ हवा सेल में अंडे के टेप क्षेत्र.
- अंडे की है कि काफी बड़े जर्दी के माध्यम से पारित करने के लिए अनुमति है के टेप भाग में एक छेद काटें. पंचर में छेद शुरू और जावक एक सर्पिल आकार में कटौती. बाहरी झिल्ली के माध्यम से कटौती, लेकिन जर्दी भेदी से बचने के लिए सुनिश्चित करें.
- जब खोल में छेद पूरा हो गया है, बटेर भ्रूण कल्पना. भ्रूण आम तौर पर की जर्दी के ऊपर की ओर पर स्थित है.
- के अंडे में छेद में कटौती के माध्यम से एक हाथ से जर्दी डालना शुरू करो. दूसरे हाथ में एक # 55 चिमटी से नोचना पकड़ो. के रूप में भ्रूण अंडे की जर्दी के ऊपर की ओर पर बाहर निकलता है, धीरे से भ्रूण के तहत # 55 चिमटी स्लाइड और यह जर्दी से हटाने. नोट: चिकन अंडे के लिए, भ्रूण अलगाव शामिल है एक तेज, साफ सतह पर चिकन अंडे खुर और एक 100 मिमी पेट्री डिश में अंडे को तोड़ने. भ्रूण की जर्दी के ऊपर की ओर पर स्थित होना चाहिए. धीरे भ्रूण के तहत # 55 चिमटी स्लाइड और यह जर्दी से हटायें.
- एक 100 मिमी पेट्री ठंडा, बाँझ EBSS युक्त पकवान में भ्रूण रखें.
- हैम्बर्गर और एक हैमिल्टन के मापदंड के अनुसार भ्रूण स्टेज. 14 चरण में भ्रूण - पिछले 13 चरण हैं, लेकिन अभी तक नहीं, मंच 20-21 somites और एक पूंछ कली के साथ 15 . 14 चरण के एक प्रमुख विशेषता - भ्रूण सिर कोण है, जो 90 ° की तुलना में शरीर को थोड़ा अधिक है .
- 14 चरण में बटेर भ्रूण से दिलों निकालें - # 55 चिमटी के साथ transversely काटने जहां ए.वी. नहर और ओ एफ टी वक्ष दीवार के साथ संपर्क बनाने के द्वारा. दिल पेट्री डिश के एक तरफ एक साथ रखें.
- एक बाँझ हस्तांतरण विंदुक के साथ पृथक दिल ले लीजिए और उन्हें एक नया 100 मिमी पेट्री बाँझ, ठंडा EBSS से भरा पकवान में जगह.
- # 55 चिमटी के साथ निलय से OFTs और ए.वी. नहरों transversely कट.
- धारा ए.वी. शेष नहरों और / या बहिर्वाह (OFTs) longitudinally इलाकों.
- 20 उल का एक मात्रा के लिए एक विंदुक सेट. इस विंदुक प्रयोग से छह aspirate ए.वी. नहरों और OFTs longitudinally कटौती.
- ए.वी. कोलेजन जेल पर नहरों और OFTs निष्कासित. जेल की सतह से किसी भी अतिरिक्त EBSS Aspirate.
- पूरबी explants # 55 चिमटी का प्रयोग करें ताकि वे फ्लैट हैं और इसलिए लुमेन पक्ष कोलेजन जेल चेहरे. चिमटी के साथ कोलेजन जेल पंचर करने के लिए नहीं की कोशिश करो.
- 37 में 2 घंटे के बाद डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2, # 55 चिमटी के साथ explants से मायोकार्डियम हटायें . endocardial कोशिकाओं कोलेजन जेल की सतह पर पीछे छोड़ दिया जाना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, मायोकार्डियम explant पर छोड़ा जा सकता है है. मायोकार्डियम हटा दिया साथ, हस्तक्षेप के बिना नहीं endocardial कोशिकाओं में EMT गुजरना. साथ मायोकार्डियम वर्तमान endocardial कोशिकाओं के एक सबसेट mesenchyme में बदलना है, लेकिन परिवर्तन की डिग्री बाह्य कारकों के साथ modulated किया जा सकता है. नोट: यहां तक कि अगर मायोकार्डियम पर छोड़ दिया जाएगा, explant कम से कम 2 घंटे के लिए जेल करने के लिए संलग्न करने के लिए करने की अनुमति होना चाहिए पहले मध्यम जोड़ा जाता है.
- प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त explants 0.4 एमएल M199 मध्यम जोड़ें.
- संस्कृति 37 पर कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस, 5% 2 सीओ, और 100% नमी.
3. ए वी पोस्ट - EMT तकिया Mesenchymal सेल अलगाव और संस्कृति
- एक तेज, साफ सतह पर चिकन अंडे क्रैक और एक 100 मिमी पेट्री डिश में अंडे को तोड़ने. भ्रूण की जर्दी के ऊपर की ओर पर स्थित होना चाहिए. # 5 चिमटी के साथ भ्रूण और भ्रूण झिल्ली आसपास हथियाने के द्वारा उठाओ तो एक 100 मिमी पेट्री बहुत ठंडा, बाँझ EBSS से भरा पकवान में भ्रूण जगह.
- हैम्बर्गर और एक हैमिल्टन के मापदंड के अनुसार भ्रूण स्टेज. एक चरण 25 भ्रूण के रूप में अलग कोहनी और घुटने के जोड़ों और थोड़ा आंख pigmentation शामिल हैं.
- पृथक सभी HH25 भ्रूण से दिल और दिल पेट्री डिश के एक तरफ एक साथ जगह है.
- एक बाँझ हस्तांतरण विंदुक के साथ पृथक दिल ले लीजिए और उन्हें एक नया 100 मिमी पेट्री बाँझ, ठंडा EBSS से भरा पकवान में जगह.
- एक ही बार में सभी दिल से ए.वी. क्षेत्र पृथक. AVS प्लेस साथ पेट्री डिश के एक तरफ. धीरे ए.वी. क्षेत्र आंदोलन के सभी रक्त है, जो सेल व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकते हैं हटा दें.
- एक बाँझ हस्तांतरण विंदुक के साथ पृथक AVS लीजिए और उन्हें एक नया 100 मिमी पेट्री बाँझ, ठंडा EBSS से भरा पकवान में जगह.
- Sequentially ए.वी. से कुशन अलग. यकीन है कि वहाँ ए वी तकिये पर कोई मायोकार्डियम मौजूद है.
- एक बाँझ हस्तांतरण विंदुक के साथ पृथक कुशन लीजिए और उन्हें एक बाँझ 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में जगह.
- अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे करने के लिए 3 मिनट के लिए 15 XG पर कुशन स्पिन.
- कुशन परेशान बिना के रूप में संभव के रूप में EBSS सतह पर तैरनेवाला के में ज्यादा दूर एक बाँझ 1000 एमएल टिप का उपयोग.
- 0.25% trypsin - EDTA के 1 एमएल ° किया गया है कि 37 के लिए पूर्व गरम सी. जोड़ें कुशन trypsin में सेते हैं जब तक वे पूरी तरह भंग कर रहे हैं की अनुमति दें, जो 3-5 मिनट के बारे में सामान्य है.
- अपकेंद्रित्र ट्यूब चिकन सीरम के 100 μL जोड़ें trypsin बुझाने.
- गोली 5 मिनट के लिए 160 XG कोशिकाओं. एक बाँझ, 1000 μL टिप के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें.
- M199 मध्यम और pipetting द्वारा मिश्रण की 2 एमएल में कोशिकाओं Resuspend. सेल निलंबन के 10 μL लो hemocytometer पर गिनती और पृथक किया गया है कि कोशिकाओं की कुल संख्या का निर्धारण
- निर्धारित कितने कोलेजन जैल अलग कक्षों की संख्या के आधार पर बनाया जा. कक्ष के लिए 2 एक्स 10 एक 250 μL जेल की मात्रा के साथ 5 / कोशिकाओं एमएल के घनत्व पर चढ़ाया जा जरूरत है .
- गोली 5 मिनट के लिए 160 XG कोशिकाओं. एक बाँझ, 1000 μL टिप के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें.
- ऊपर सूचीबद्ध प्रोटोकॉल का प्रयोग, उस क्रम में सेल गोली 3X M199, पानी, चिकन सीरम, मज्जा, और 0.1 एम NaOH, जोड़ने. कोमल pipetting द्वारा मिक्स.
- प्रत्येक 1.9 सेमी 2 विकास अच्छी तरह से क्षेत्र के 250 μL जोड़ें .
- कोलेजन जेल करने के लिए समाधान की अनुमति दें कम से कम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% 2 सीओ, और 100 % नमी.
- संस्कृति मीडिया के 0.4 एमएल जोड़ें और रातोंरात सेते हैं.
- तनाव मुक्त परिस्थितियों में जैल संवर्धन जारी रखने के लिए, जैल संस्कृति के तरफ से अच्छी तरह से एक बाँझ 200 μL विंदुक टिप का उपयोग कर मुक्त कराया. यंत्रवत् विवश संस्कृतियों जैल कि संस्कृति के पक्ष में अच्छी तरह से संलग्न रहते हैं.
4. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1: भ्रूण की (ए) भ्रूण HH14 - बटेर, उदाहरण है, और (बी) HH25 चिकन भ्रूण यहाँ दिखाए जाते हैं.
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चित्रा 2: संस्कृति के 2 घंटे बाद HH14 वाल्व endocardial explants (ए) मायोकार्डियम वर्तमान के साथ, या (बी) के साथ मायोकार्डियम हटा दिया. .
चित्रा 3: HH14 वाल्व endocardial explants (ए) मायोकार्डियम वर्तमान के साथ कोशिकाओं के कई mesenchymal परिवर्तन करने के लिए endocardial गुजरना और संस्कृति के 48 घंटे के के बाद एक धुरी के आकार, mesenchymal phenotype है. (बी) जब मायोकार्डियम सभी कोशिकाओं की निकाल दिया जाता है एक cobblestone के आकार का, संस्कृति में 48 घंटे के बाद endocardial phenotype बनाए रखने.
चित्रा 4: HH25 कोलेजन जेल में वाल्व mesenchymal कोशिकाओं कक्ष बोने के तुरंत बाद गोल कर रहे हैं.
चित्रा 5: संस्कृति में HH25 mesenchymal कोशिकाओं (ए) संस्कृति का एक विवश कोलेजन जेल में 48 घंटे के बाद HH25 mesenchymal कोशिकाओं में फैल करने के लिए शुरुआत कर रहे हैं. (बी) एक तनाव मुक्त 7 दिनों बोने और मुक्ति के बाद 6 दिनों के बाद कोलेजन जेल में HH25 कोशिकाओं मूल क्षेत्र के लगभग 50% करने के लिए जेल जमा है.
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Discussion
HH14 मंच से endocardial कोशिकाओं को अलग करने के लिए विधि - मूल Runyan और Markwald द्वारा विकसित दिल एक नियंत्रित, इन विट्रो के लिए कारक है कि शुरू करने और भ्रूण EMT 2 मिलाना का अध्ययन वातावरण में प्रदान करता है. HH14 - endocardial मायोकार्डियम के बिना सभ्य explants EMT biomechanical या जैव रासायनिक हस्तक्षेप के बिना नहीं गुजरना होगा . यदि मायोकार्डियम explant पर छोड़ दिया है यह endocardial कोशिकाओं के एक सबसेट का संकेत mesenchymal परिवर्तन से गुजरना होगा, लेकिन बाह्य कारकों इस प्रक्रिया को विनियमित कर सकते हैं. अलग HH25 ए.वी. वाल्व से भ्रूण पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं mesenchymal बुचर एट अल. द्वारा वर्णित विधि का उपयोग कुशन निर्धारित करने के लिए क्या परिपक्व वाल्वुलर बीचवाला 3 कोशिकाओं की ओर ड्राइव भेदभाव संकेतों के लिए एक अवसर प्रदान करता है. संवर्धन कोशिकाओं शोधकर्ता यंत्रवत् बल दिया है या तनाव मुक्त परिस्थितियों में biomechanical उत्तेजनाओं की जांच करने के लिए अनुमति देता है, और संस्कृति के माध्यम से जोड़ा कारकों जैव रासायनिक संकेतों को प्रदान कर सकते हैं. इन विट्रो मॉडल है कि समझने तंत्र को प्रभावित EMT, सेल भेदभाव करने में मदद , और संरचनात्मक remodeling किया जा सकता है बेहतर जन्मजात हृदय दोष के कारणों को समझने के लिए और मदद से स्टेम कोशिकाओं ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए परिपक्व वाल्व सेल phenotypes की ओर ड्राइव करने के तरीके का निर्धारण कर सकता इस्तेमाल किया.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
Mitral 07CVD04: इस शोध Hartwell फाउंडेशन, अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (वैज्ञानिक विकास अनुदान 0830384N #) और फाउंडेशन Leducq द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | |
| Dumont tweezers #55 | World Precision Instruments, Inc. | 14099 | |
| Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments, Inc. | 14098 | |
| Sterile transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | |
| 4-well culture plates | Nalge Nunc international | 176740 | |
| Sterile disposable filter units, PES, 0.2 μm pore size membrane | Nalge Nunc international | 566-0020 | |
| Sterile 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
| Sterile petri dishes, 100 mm x 15 mm | VWR international | 25384-342 | |
| Laboratory tape | VWR international | 89097-920 | |
| Rat-tail collagen I | BD Biosciences | 354236 | |
| 10X Earl’s Balanced Salt Solution | Quality Biological, Inc. | 119-064-131 | |
| M199 powder | Invitrogen | 31100-035 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-G supplement (100X) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Chicken serum | Invitrogen | 16110-082 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide solution, 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Fertile quail eggs (Coturnix coturnix) | Lake Cumberland Game Bird Farm | ||
| Fertile chicken eggs (Gallus gallus) | Cornell University Poultry Farm |
References
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: A regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Developmental Biology. 95, 108-108 (1983).
- Butcher, J. T., Norris, R. A., Hoffman, S., Mjaatvedt, C. H., Markwald, R. R. Periostin promotes atrioventricular mesenchyme matrix invasion and remodeling mediated by integrin signaling through Rho/PI 3-kinase. Developmental Biology. 302, 256-256 (2007).
