Summary
이 문서는 분리를위한 방법과 culturing 퀘일 또는 닭고기 HH14를 제공합니다
Abstract
배아 심장 밸브의 올바른 형성과 기능은 개발 진행을 위해 중요합니다. 초기 배아 심장은 myocardium 둘러싸인 endocardium의 U - 모양의 튜브입니다. myocardium secretes 심장 젤리, 방실 (AV) 접합 및 유출 트랙트 (OFT) 루멘으로 hyaluronan 풍부한 젤라틴 매트릭스. 단계에서 HH14 valvulogenesis는 endocardial 세포의 일부가 mesenchymal 변환 (EMT)에 endocardial myocardium의 신호를 받아야 받게하고, 심장 젤리를 침공 때 시작됩니다. HH25 단계에서 밸브 모양의 쿠션을 완전히 mesenchymalized, 그리고 그것은 결국 심장의 밸브 모양의 장치와 septal을 형성하고이 mesenchyme집니다. EMT 및 세포 분화의 과정을 시작하고 조절하는 메커니즘을 이해하는 것은 심각한 선천성 심장 때문에 결함들의 연결 중요합니다. 본 연구에서는 우리는 prevalvular 쿠션의 두 가지 세포 phenotypes 아르 사전 EMT endocardial 및 사후 응급 mesenchymal 세포를 분리하는 방법을 제시한다. 사전 EMT endocardial 세포 또는 myocardium없이 교양 수 있습니다. 포스트 EMT 유명 쿠션 mesenchymal 세포 내부 기계 제약이나 스트레스없는 콜라겐 젤을 배양해 수 있습니다. 체외 모델에서 이러한 3D 주요 밸브 모양의 morphogenic 이벤트를 모방하고 초기 늦게 무대 valvulogenesis의 메커니즘을 deconstructing하는 데 유용합니다.
Protocol
1. 준비
- 비옥한 메추라기 또는 단계 14 닭 알을 품어 - 25 (2 일간) (4.5 일) 60 % 습도와 37 ° C.에
- 무균 얼 밸런스드 소금 솔루션을 준비 (EBSS)
- 600 ML 18 MΩ 물 100 ML 10X EBSS 추가
- 2.2 g의 나트륨 중탄산염 추가
- 7.2 솔루션의 산도를 조절
- 최대 1000 ML에 대한 해결책을 가지고
- 0.2 μm의 필터를 통과하여 솔루션을 소독
- 무균 M199 문화 매체를 준비합니다.
- 700 ML 18 MΩ 물이 M199 분말 1 패키지를 추가합니다.
- 2.2 g의 나트륨 중탄산염 추가
- 7.2 솔루션의 산도를 조정합니다.
- 10 ML (1 %) 페니실린 - 스트렙토 마이신 추가
- 최대 1000 ML에 대한 해결책을 가지고
- 0.2 μm의 필터를 통과하여 솔루션을 소독
- 1 ML 무균 100X 인슐린 트랜스페린 - 셀레늄 - G 보충 추가
- 10 ML (1 %) 무균 닭 혈청 추가
- 1.5 MG / ML의 콜라겐 농도에서 입체 콜라겐 젤을 준비합니다. 우리가 실험실에서 이전 작품보다 1.5 MG / ML의 콜라겐 농도는 세포가 이동할 수 있도록 너무 biomechanically 딱딱하게되는 매트릭스를 제공하는 것으로 나타났습니다. MG / ML은 세포 덩어리가 세포의 섬을 생산, 로컬 섬유는 분쇄기에 넣어 수 있도록 몇 가지 콜라겐 섬유가 1.5보다 콜라겐 겔 농도 낮아집니다.
- 위해서는 멸균 15 ML의 원심 관에 다음 얼음처럼 차가운 시약 추가 :
- 배 M199 : 볼륨 = 총 판매량 필요한 / 3
- 무균 18 MΩ 물 : 볼륨 필요 = 총 부피 (M199 볼륨 + 닭 혈청 볼륨 + 0.1 M NaOH 볼륨 + 콜라겐 볼륨)
- 무균 닭 혈청 : 볼륨 = 총 볼륨 필요 * 0.01
- 쥐 꼬리 콜라겐 I : 볼륨 = (콜라겐 겔 농도가 * 총 판매량 필요) / 콜라겐 재고 농도
- 무균 0.1 M NaOH : 볼륨 = 콜라겐 볼륨 * 0.2
참고 : 물의 양을 0.1 M NaOH, 그리고 콜라겐은 콜라겐 주식 솔루션의 농도에 따라 달라집니다 밝혔다.
- 멸균 피펫 잘 콜라겐 솔루션을 섞는다.
- 즉시 1.9 cm이 성장 지역 우물에 콜라겐 솔루션의 0.3 ML를 전송합니다. 이것은 완전히 우물을 충당하기 위해 약 3mm 두께 젤을 제공하기 위해 충분한 콜라겐 솔루션입니다. 적어도 250 μm의의 겔 두께 세포 침략 연구 필요합니다.
- 37 최소한 1 시간 동안 젤로 콜라겐 솔루션을 허용 ° C 5 % CO 2, 100 % 습도.
- 위해서는 멸균 15 ML의 원심 관에 다음 얼음처럼 차가운 시약 추가 :
2. 사전 EMT Endocardial 전지 격리와 문화
- 배아 절연
- 계란의 큰 끝을 통해 실험실 테이프 중 하나 인치 긴 조각을 놓으십시오. 공기 전지가있는 곳입니다. 테이프는 깨지기 쉬운 퀘일 알 껍질을 안정화.
- 부드럽게 찔린 멸균 곡선 가위 끝에있는 공기 세포에있는 계란의 녹화 영역입니다.
- 노른자가 통과할 수 있도록 충분히 큰 계란의 녹화 부분에 구멍을 잘라 버릴거야. 찔린에 구멍을 시작하고 나선 모양으로 바깥쪽으로 했네요. 외부 세포막을 통해 상처지만, 노른자를 관통하지 않도록해야합니다.
- 쉘에있는 구멍이 완료되면, 메추라기 배아를 시각화. 태아는 일반적으로 노른자의 상단 측면에 위치해 있습니다.
- 한손으로 계란에있는 구멍을 삭감을 통해 노른자를 부어 시작합니다. 반면에 # 55 트위터 잡아. 난황의 상단 측면에있는 배 (胚)가 종료 계란으로 부드럽게 배아에서 # 55 핀셋을 슬라이드와 노른자에서 제거합니다. 참고 : 닭고기 계란은 배아 격리가 선명하고 깨끗한 표면에 닭 계란을 균열 및 100mm 페트리 접시에 계란을 깨는 포함됩니다. 배아는 노른자의 상단 측면에 위치해야합니다. 부드럽게 배아에 따라 # 55 핀셋을 슬라이드와 노른자에서 제거합니다.
- 얼음처럼 차가운, 살균 EBSS를 포함 100mm 페트리 접시에 배아를 놓습니다.
- 햄버거와 해밀턴 1 기준에 따라 배아를 무대. 단계 14에서 태아가 - 과거 무대 13아르지만, 아직 20-21 somites와 꼬리 버드와 함께 단계 15에서. 단계 14 주요 특징 - 태아의 몸에 90 °보다 약간 큰 머리 각도입니다.
- 단계 14에서 메추라기 배아의 마음을 제거 - # 55 핀셋으로 유명 운하와 OFT는 흉부 벽과의 접촉을 어디 transversely 절단하여. 페트리 접시 한쪽에 함께 마음을 놓으십시오.
- 멸균 전송 피펫으로 격리 마음을 수집하고 살균, 얼음처럼 차가운 EBSS 가득한 새로운 100mm 페트리 접시에 그들을 놓으십시오.
- # 55 핀셋으로 심실에서 transversely OFTs와 AV 운하 컷.
- 섹션은 나머지 AV 운하 및 / 또는 길이 방향 유출 트렉츠 (OFTs).
- 20 UL의 볼륨에 피펫을 설정합니다. AV 운하와 OFTs을 길이 방향 - 컷 여섯 대기음이 피펫을 사용합니다.
- 콜라겐 젤로 유명 운하와 OFTs을 추방. 젤의 표면에서 초과 EBSS을 대기음.
- 그들이 평평하므로 방향 explants에 # 55 핀셋을 사용하고 있으므로 루멘 사이드가 콜라겐 젤을 얼굴. 핀셋과 펑크 콜라겐 젤을하지보십시오.
- 37 2 시간 후에 ° C와 5% CO 2, # 55 핀셋으로 explants에서 myocardium를 제거합니다. endocardial 세포는 콜라겐 젤의 표면에 남아 있어야합니다. 또는, myocardium가 explant에 남아있을 수 있습니다. myocardium 제거와 함께가 아닌 함께 endocardial 세포가 개입없이 EMT을 받고있다. myocardium 존재로 endocardial 세포의 일부가 mesenchyme로 변환되지만, 변화의 정도는 외부 요인과 변조된 수 있습니다. 참고 : 중간이 추가되기 전에 myocardium가에 남아있을 것입니다하더라도 explant 적어도 2 시간 겔에 첨부할 수 있어야합니다.
- 각 잘 포함 explants 0.4 ML M199 매체를 추가합니다.
- 문화 37 세포 ° C 5 % CO 2, 100 % 습도.
3. 포스트 EMT AV 쿠션 Mesenchymal 세포 분리 및 문화
- 날카로운, 깨끗한 표면에 닭 계란을 깨서 100mm 페트리 접시에 계란을 깰. 배아는 노른자의 상단 측면에 위치해야합니다. 배아를 둘러싼 세포막을 잡아서 # 5 핀셋으로 배아를 선택하고 얼음처럼 차가운, 살균 EBSS 가득한 100mm 페트리 접시에 배아를 놓습니다.
- 햄버거와 해밀턴 1 기준에 따라 배아를 무대. 무대 25 배 (胚)의 특징은 독특한 팔꿈치와 무릎 관절과 약간의 눈 착색되어 있습니다.
- 모든 HH25 배아의 마음을 분리하여 배양 접시 한쪽에 함께 마음을 놓으십시오.
- 멸균 전송 피펫으로 격리 마음을 수집하고 살균, 얼음처럼 차가운 EBSS 가득한 새로운 100mm 페트리 접시에 그들을 놓으십시오.
- 한번에 모든 마음에서 유명 지역을 격리. 페트리 접시 한쪽에 함께 AVS를 놓습니다. 부드럽게 세포 생존에 영향을 미칠 수있는 모든 혈액을 제거하는 AV 지역을 선동하다.
- 멸균 전송 피펫으로 격리 AVS를 수집하고 살균, 얼음처럼 차가운 EBSS 가득한 새로운 100mm 페트리 접시에 그들을 놓으십시오.
- 순차적으로 AV에서 방석을 분리. AV 쿠션에는 myocardium 선물이 없습니다 있는지 확인합니다.
- 멸균 전송 피펫으로 격리 방석을 수집하고 살균 15 ML의 원심 관에 넣어.
- 3 분 15 XG에서 원심 분리기 튜브의 바닥에 방석을 스핀.
- 쿠션을 방해하지 않고 가능한 한 EBSS 뜨는의 많은를 제거하는 살균 1,000 ML 팁을 사용합니다.
- 37 미리 예열되어 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ML ° C. 추가 그들이 완전히 해소되기 전까지는 쿠션이 트립신에 부화 허용하는 3-5 분 정도 정상적으로됩니다.
- 트립신을 담금질하기 위해 원심 관에 닭 혈청 100 μL를 추가합니다.
- 5 분 160 XG에 펠렛은 세포. 멸균, 1000 μL 팁으로 뜨는을 제거합니다.
- M199 매체와 pipetting으로 혼합 2 ML에있는 세포를 Resuspend. hemocytometer 의지하고 고립되었습니다 세포의 총 수를 결정하기 위해 세포 현탁액 10 μL을 가지고
- 콜라겐 젤은 절연 세포의 수를 기반으로 이루어집니다 얼마나 많은 결정합니다. 세포 250 μL 젤 볼륨 2 × 10 5 세포 / ML의 밀도에 도금해야합니다.
- 5 분 160 XG에 펠렛은 세포. 멸균, 1000 μL 팁으로 뜨는을 제거합니다.
- 위에 나열된 프로토콜을 사용하여, 세포 펠렛으로, 그 순서에 배 M199, 물, 닭 혈청 주사, 콜라겐, 그리고 0.1 M NaOH를 추가합니다. 부드러운 pipetting하여 섞는다.
- 물론 각각 1.9 cm이 성장 지역에 250 μL를 추가합니다.
- 37 최소한 1 시간 동안 젤로 콜라겐 솔루션을 허용 ° C 5 % CO 2, 100 % 습도.
- 문화 미디어 0.4 ML를 추가하고 밤새 품어.
- 스트레스없는 조건에서 culturing 젤을 계속하려면, 잘 살균 200 μL 피펫 팁을 사용하여 문화의 측면에서 젤을 해방. 기계 제한된 문화가 잘 문화의 측면에 연결된 상태 젤 있습니다.
4. 대표 결과
그림 1 :. 배아의 예 (A) HH14 - 퀘일 배아, 그리고 (B) HH25 닭 배아가 여기에 표시됩니다.
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그림 2 : 문화의 2 시간 후에 HH14 밸브 endocardial explants (A) myocardium 선물로, 또는 (B) myocardium 제거와 함께..
그림 3 :. HH14 밸브 endocardial explants가 (A) myocardium 선물로 세포의 많은 mesenchymal 변화에 endocardial 받아야과 문화 48 시간 후 스핀들 모양, mesenchymal 표현형 있습니다. (B) myocardium가 세포의 제거되면 문화의 48 시간 후 조약돌 모양, endocardial 표현형를 유지합니다.
그림 4 :. 콜라겐 젤의 HH25 밸브 mesenchymal 세포 세포 즉시 시딩 후 반올림됩니다.
그림 5 :. 문화 HH25 mesenchymal 세포 (A) 제약 콜라겐 젤 문화 48 시간 후 HH25 mesenchymal 세포가 확산 시작됩니다. (B) 칠일 해방 후 시딩 및 6 일 후에 스트레스없는 콜라겐 젤의 HH25 세포는 원래 면적의 약 50 % 젤 압축된있다.
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Discussion
무대 HH14에서 endocardial 세포 분리를위한 방법 - 원래 런얀 및 Markwald 개발한 마음은 시작과 배아 EMT 2 조절 요인을 연구하기 위해 체외 환경에서 제어를 제공합니다. HH14 - myocardium하지 않고 교양 endocardial explants가 biomechanical 또는 생화 학적 개입없이 EMT를 받아야하지 않습니다. myocardium가 explant에 남아있다면 그것은 mesenchymal 변화를 받아야하는 endocardial 세포의 하위 집합을 신호되지만, 외부 요인이 과정을 조절 수도 있습니다. HH25 AV 밸브에서 배아 시조 mesenchymal 세포를 분리하는 것은 부쳐 외.에 의해 설명된 방법을 사용 쿠션 밸브 모양의 중간 성숙 세포를 세 방면으로 드라이브 차별 신호를 결정하는 기회를 제공합니다. 기계적 스트레스 또는 스트레스가없는 조건에서 Culturing 세포는 연구자가 biomechanical 자극 프로브 수있게하고, 문화 매체에 추가 요소 생화 학적 신호를 제공할 수 있습니다. EMT, 세포 분화에 영향을 미치는 해독 메커니즘에 도움, 및 구조 개조 될 수있는 체외 모델에서 더 나은 선천성 심장 결함의 원인을 이해하고 조직 엔지니어링 어플 리케이션을위한 성숙 밸브 세포 phenotypes 향해 줄기 세포를 운전하는 방법을 결정하는 데 도움이 수도 사용됩니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
승모판 07CVD04 :이 연구는 하트웰 재단, 미국 심장 협회 (과학자 개발 권한 부여 # 0830384N) 및 재단 Leducq에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | |
| Dumont tweezers #55 | World Precision Instruments, Inc. | 14099 | |
| Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments, Inc. | 14098 | |
| Sterile transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | |
| 4-well culture plates | Nalge Nunc international | 176740 | |
| Sterile disposable filter units, PES, 0.2 μm pore size membrane | Nalge Nunc international | 566-0020 | |
| Sterile 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
| Sterile petri dishes, 100 mm x 15 mm | VWR international | 25384-342 | |
| Laboratory tape | VWR international | 89097-920 | |
| Rat-tail collagen I | BD Biosciences | 354236 | |
| 10X Earl’s Balanced Salt Solution | Quality Biological, Inc. | 119-064-131 | |
| M199 powder | Invitrogen | 31100-035 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-G supplement (100X) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Chicken serum | Invitrogen | 16110-082 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide solution, 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Fertile quail eggs (Coturnix coturnix) | Lake Cumberland Game Bird Farm | ||
| Fertile chicken eggs (Gallus gallus) | Cornell University Poultry Farm |
References
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: A regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Developmental Biology. 95, 108-108 (1983).
- Butcher, J. T., Norris, R. A., Hoffman, S., Mjaatvedt, C. H., Markwald, R. R. Periostin promotes atrioventricular mesenchyme matrix invasion and remodeling mediated by integrin signaling through Rho/PI 3-kinase. Developmental Biology. 302, 256-256 (2007).
