Summary
本文将提供一个隔离的方法，培养鹌鹑鸡HH14
Abstract
正确的形成和胚胎心脏瓣膜的功能的发育进程的关键。早期胚胎的心脏是一个U形管的心内膜心肌包围。心肌细胞分泌的心脏果冻，一个透明质酸丰富的胶质基质，到房室交界处和流出道（OFT）流明。在第一阶段开始HH14 valvulogenesis内膜细胞的一个子集时，从心肌收到的信号，经过内膜间质转化（EMT），并侵入心脏果冻。阶段HH25瓣膜垫子mesenchymalized，这是间质细胞，最终形成的心脏瓣膜和室间隔仪器。了解启动和调节EMT和细胞分化过程中的机制是非常重要的，因为严重的先天性心脏缺陷的连接。在这项研究中，我们目前的方法来隔离前EMT的心内膜和后EMT的间质细胞，这是两个不同的细胞表型prevalvular垫。前EMT的心内膜细胞可以培养的心肌有或没有。后EMT的影音垫间质细胞可以培养的胶原凝胶内机械限制或无压力。这些在体外模型的三维模拟关键瓣膜形态发生事件和解构早期和晚期valvulogenesis的机制非常有用。
Protocol
1。制备
- 孵化鹌鹑或肥沃，鸡蛋阶段14 - （约2天）或25（约4.5天），湿度60％和37 ° C
- 准备无菌伯爵的平衡盐溶液（EBSS）
- 18 M 600毫升水加入100 ml 10X EBSS
- 添加碳酸氢钠2.2克
- 调节溶液的pH值至7.2
- 带来的解决方案，1000毫升
- 穿过一个0.2微米的过滤消毒解决方案
- 准备无菌M199培养基。
- M199粉加入1包700毫升18MΩ水。
- 添加碳酸氢钠2.2克
- 调整pH值至7.2的解决方案。
- 添加10毫升（1％）青霉素，链霉素
- 带来的解决方案，1000毫升
- 穿过一个0.2微米的过滤消毒解决方案
- 添加1 mL无菌100X补充胰岛素转硒 - G
- 添加10毫升（1％）无菌鸡血清
- 准备三维胶原凝胶，胶原蛋白的浓度在1.5毫克/毫升。在我们实验室先前的研究表明，胶原蛋白的浓度超过1.5毫克/毫升，提供了一个矩阵，是太生物力学僵硬的细胞移动通过。胶原凝胶浓度低于1.5毫克/毫升的有这么几个胶原纤维细胞丛本地一丝一毫的纤维，产生的细胞岛。
- 15毫升无菌离心管中，以添加以下冰冷的试剂：
- 3X M199：体积=总体积的必要/ 3
- 无菌18MΩ水：体积=必要的总量（M199音量+鸡血清音量+ 0.1 M的氢氧化钠量+胶原容积）
- 无菌鸡血清：体积=总体积* 0.01
- 鼠尾胶原我：卷=（胶原凝胶浓度*总量必要）/胶原股票浓度
- 无菌0.1 M的氢氧化钠：体积=胶原容积* 0.2
注：添加适量的水，0.1 M的氢氧化钠和胶原蛋白的胶原蛋白原液的浓度会有所不同而有所不同。
- 良好的胶原蛋白溶液混合，用无菌吸管。
- 立即转移到1.9平方厘米的增长领域井的胶原溶液0.3毫升。这是足够的胶原蛋白溶液，完全覆盖以及和提供约3毫米厚的凝胶，。一个至少250微米的凝胶厚度是对细胞的侵袭研究是必要的。
- 允许至少1小时的胶原蛋白溶液凝胶在37℃，5％CO 2，湿度为100％。
- 15毫升无菌离心管中，以添加以下冰冷的试剂：
2。前EMT的心内膜细胞分离和培养
- 胚胎隔离
- 将实验室磁带1英寸以上的蛋较大的一端的长片。这是那里的空气是位于细胞。磁带稳定脆弱的鹌鹑蛋壳。
- 轻轻穿刺在空气消毒弯剪刀的尖端细胞蛋录音。
- 剪下一个鸡蛋，大到足以让蛋黄通过录音的部分孔。开始穿刺孔，切一个螺旋形状向外。确保穿过外膜，但应避免刺破蛋黄。
- 当在shell的洞是完整的，可视化的鹌鹑胚胎。胚胎通常位于顶面的蛋黄。
- 开始倒一方面通过在蛋孔切蛋黄。 ＃55镊子保持在另一方面。随着胚胎退出顶面的鸡蛋蛋黄，轻轻滑动下，胚胎＃55镊子，从蛋黄中取出。注：鸡蛋，胚胎隔离涉及打击锋利，表面光洁的鸡蛋和鸡蛋打破，到100毫米的培养皿。蛋黄顶面应位于胚胎。轻轻滑入下，胚胎＃55镊子，从蛋黄中取出。
- 胚胎放入一个100毫米的Petri菜含有冰凉的，无菌的EBSS。
- 根据汉堡包和汉密尔顿1标准，第 一阶段的胚胎。胚胎阶段14 -过去阶段13，但尚未在阶段15，20-21体节和尾芽。一个14阶段的主要特点-胚胎是头部的角度来看，这是略小于90 °身体更大。
- 从鹌鹑胚胎阶段14中删除的心 - ＃55镊子横向切割AV运河和公平交易与胸壁的接触。在一个培养皿的一侧放置的心在一起。
- 收集用无菌移液管离体心脏，放入一个新的100毫米的Petri充满无菌，冰冷的EBSS的菜。
- 横向切OFTs和AV运河，从＃55镊子脑室。
- 节中的其余的AV运河和/或流出道（OFTs）纵向。
- 设置移液器体积20微升。用吸管吸出六个纵向切AV运河和OFTs。
- 驱逐AV运河上的胶原蛋白凝胶OFTs。从凝胶表面吸任何的多余的EBSS。
- 使用＃55镊子东方植，所以它们是平的，使管腔侧面胶原凝胶。尽量不要用镊子穿刺胶原凝胶。
- 经过2个小时，在37 ° C和5％ 的 CO 2，删除＃55镊子植心肌。心内膜细胞胶原凝胶表面上留下。另外，心肌可左外植体。随着心肌删除，不内膜细胞进行EMT的，不加干预。与目前心肌心内膜细胞的一个子集会转化成间质细胞，但转型的程度，可与外部因素调制。注：心肌即使将离开，植体必须允许前至少2小时附加的凝胶介质添加。
- 加入0.4 mL的M199培养基，每孔含有植。
- 培养细胞在37℃，5％CO 2，湿度为100％。
3。后EMT的影音靠垫间质细胞的分离和培养
- 破解尖锐，干净的表面上的鸡蛋和鸡蛋打入100毫米培养皿。蛋黄顶面应位于胚胎。拿起胚胎＃5镊子抓住周围的胚胎膜，然后将胚胎充满了冰冷，无菌EBSS到100毫米的Petri菜。
- 根据汉堡包和汉密尔顿1标准，第 一阶段的胚胎。一个阶段25胚胎的特性，包括独特的肘部和膝关节和轻微的眼部色素沉着。
- 隔离所有HH25胚胎的心，一起放在培养皿一侧的心。
- 收集用无菌移液管离体心脏，放入一个新的100毫米的Petri充满无菌，冰冷的EBSS的菜。
- 一次心灵的AV地区隔离。培养皿一侧放置了AVS。轻轻搅动AV地区消除所有的血液，从而影响细胞活力。
- 用无菌移液管收集隔离AVS和它们放入一个新的100毫米的Petri充满无菌，冰冷的EBSS的菜。
- 顺序从AV隔离的垫子。确保有心肌目前没有在AV垫子。
- 收集隔离垫，并用无菌移液管放入无菌的15 mL离心管。
- 3分钟，在15 XG旋转的离心管底部的垫子。
- 使用无菌1000毫升的提示删除，而不会干扰坐垫尽可能EBSS上清。
- 添加1毫升的0.25％胰蛋白酶EDTA已预热至37 ° C。允许坐垫中的胰蛋白酶孵育，直到他们完全溶解，这是一般约3-5分钟。
- 添加鸡血清100μL的离心管中淬火的胰蛋白酶。
- 5分钟沉淀细胞在160 XG。取出上清液，用无菌，1000μL的提示。
- 在2毫升的M199培养基和混合吹打重悬细胞。取10μL的细胞悬液对血球计数，并确定已分离出的细胞总数
- 确定的胶原凝胶分离的细胞数量的基础上，将。细胞需要在一个2 × 10 5细胞/毫升与250μL凝胶量的密度镀。
- 5分钟沉淀细胞在160 XG。取出上清液，用无菌，1000μL的提示。
- 使用上面列出的协议，在该命令添加3X M199，水，鸡血清，胶原蛋白，和0.1M的氢氧化钠，细胞沉淀。混合轻柔吹打。
- 加入250μL，每1.9厘米2的增长领域以及。
- 允许至少1小时的胶原蛋白溶液凝胶在37℃，5％CO 2，湿度为100％。
- 加入0.4毫升培养基孵育过夜。
- 要继续在无压力的条件下培养凝胶，从双方的文化中解放出来的凝胶，以及使用无菌200μL枪头。机械约束的文化是保持连接双方的文化以及凝胶。
4。代表性的成果
图1：这里显示。范例 （一）HH14鹌鹑胚胎， 胚胎及（B）HH25鸡胚。
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图2：HH14阀心内膜植后2个小时的文化，或（B）（A）与心肌目前与心肌删除 。
图3：HH14阀心内膜植 （A）与心肌目前，许多细胞进行心内膜间质转型和后48小时的文化有一个纺锤形，间质表型。 （二）当心肌细胞中删除所有维持一个鹅卵石形，文化在48小时后的内膜表型。
图4：HH25阀在胶原凝胶中的间质细胞的细胞四舍五入后立即播种。
图5：HH25间质细胞培养 （一）经过48小时的文化，在约束的胶原蛋白凝胶HH25间质细胞开始蔓延。 （二）HH25在播种和解放以后的6天7天之后无压力的胶原蛋白凝胶细胞压缩到原来的面积约50％的凝胶。
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Discussion
阶段HH14隔离内膜细胞的方法 -心中最初是由润和Markwald开发提供了控制，在体外环境研究的因素，启动和调节胚胎EMT的2。 HH14 -培养无心肌内膜植不会发生EMT的无生物力学或生化干预。如果心肌左外植体，它会发出信号内膜细胞的一个子集来进行间质改造，但外部因素可能会规范这一过程。胚胎祖细胞间质隔离HH25影音阀垫使用屠夫等人所描述的方法提供了一个机会，以确定哪些信号驱动走向成熟瓣膜间质细胞分化。在机械压力或无压力的条件下培养细胞，使研究人员探测生物力学刺激，并添加到培养基中的因素， 可以提供生化信号。体外模型，帮助破译EMT的影响，细胞分化的机制和结构重构可以用于更好地了解先天性心脏缺陷的原因，可以帮助确定到干细胞组织工程应用中走向成熟阀细胞表型驱动的方法。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
支持这项研究是由哈特韦尔基金会，美国心脏协会（科学家发展津贴＃0830384N）和基金会Leducq：二尖瓣07CVD04。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | |
| Dumont tweezers #55 | World Precision Instruments, Inc. | 14099 | |
| Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments, Inc. | 14098 | |
| Sterile transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | |
| 4-well culture plates | Nalge Nunc international | 176740 | |
| Sterile disposable filter units, PES, 0.2 μm pore size membrane | Nalge Nunc international | 566-0020 | |
| Sterile 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
| Sterile petri dishes, 100 mm x 15 mm | VWR international | 25384-342 | |
| Laboratory tape | VWR international | 89097-920 | |
| Rat-tail collagen I | BD Biosciences | 354236 | |
| 10X Earl’s Balanced Salt Solution | Quality Biological, Inc. | 119-064-131 | |
| M199 powder | Invitrogen | 31100-035 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-G supplement (100X) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Chicken serum | Invitrogen | 16110-082 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide solution, 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Fertile quail eggs (Coturnix coturnix) | Lake Cumberland Game Bird Farm | ||
| Fertile chicken eggs (Gallus gallus) | Cornell University Poultry Farm |
References
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: A regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Developmental Biology. 95, 108-108 (1983).
- Butcher, J. T., Norris, R. A., Hoffman, S., Mjaatvedt, C. H., Markwald, R. R. Periostin promotes atrioventricular mesenchyme matrix invasion and remodeling mediated by integrin signaling through Rho/PI 3-kinase. Developmental Biology. 302, 256-256 (2007).
