Summary
Dit artikel geeft een methode voor het isoleren en kweken van kwartels of kippen HH14
Abstract
Een goede vorming en functie van de embryonale hartkleppen is van cruciaal belang voor de ontwikkeling progressie. De vroege embryonale hart is een U-vormige buis van endocard, omringd door myocard. Het myocard scheidt cardiale gelei, een hyaluronan-rijke gelatineuze matrix, in de atrioventriculaire (AV) knooppunt-en uitstroom-darmkanaal (OFT) lumen. In fase HH14 valvulogenesis begint als een subset van de endocardiale cellen signalen van de hartspier ontvangen, ondergaan endocardiale naar mesenchymale transformatie (EMT), en binnen te vallen de cardiale gelei. In fase HH25 de hartkleppen kussens zijn volledig mesenchymalized, en het is deze mesenchym dat uiteindelijk vormt de klep en het septum apparaat van het hart. Inzicht in de mechanismen die initiëren en moduleren het proces van EMT en de celdifferentiatie zijn belangrijk vanwege hun verbinding met ernstige aangeboren hartafwijkingen. In deze studie presenteren we methoden om de pre-EMT endocardiale en post-EMT mesenchymale cellen, die de twee verschillende cel fenotypes van de prevalvular kussen te isoleren. Pre-EMT endocardiale cellen kunnen worden gekweekt, met of zonder het myocard. Post-EMT AV kussen mesenchymale cellen kunnen worden gekweekt in mechanisch beperkt of stress-vrij collageen gels. Deze 3D in vitro modellen bootsen de belangrijkste valvulaire morfogenisch gebeurtenissen en zijn nuttig voor deconstructie van de mechanismen van de vroege en late stadium valvulogenesis.
Protocol
1. Voorbereiding
- Incubeer vruchtbare kwartels of kippen eieren naar de derde fase 14 - (ongeveer 2 dagen) of 25 (ongeveer 4,5 dag) bij 60% luchtvochtigheid en 37 ° C.
- Bereid steriele Earl's Balanced Salt Solution (EBSS)
- Voeg 100 ml 10x EBSS tot 600 ml water 18 MΩ
- Voeg 2,2 g natriumbicarbonaat
- Breng de pH van de oplossing tot 7,2
- Breng de oplossing tot 1000 ml
- Steriliseer de oplossing door het passeren door een 0,2 um filter
- Bereid steriel M199 kweekmedium.
- Voeg een pakket van M199 poeder tot 700 ml 18 MΩ water.
- Voeg 2,2 g natriumbicarbonaat
- Breng de pH van de oplossing tot 7,2.
- Voeg 10 ml (1%) penicilline-streptomycine
- Breng de oplossing tot 1000 ml
- Steriliseer de oplossing door het passeren door een 0,2 um filter
- Voeg 1 mL steriel 100X insuline-transferrine-Seleen-G aan te vullen
- Voeg 10 ml (1%) steriele kip serum
- Bereid drie dimensionale collageen gels op een collageen concentratie van 1,5 mg / ml. Eerdere werkzaamheden in ons lab heeft uitgewezen dat een collageen concentratie van meer dan 1,5 mg / ml een matrix die is te biomechanisch stijf voor de cellen om door biedt. Collageen gel concentraties van minder dan 1,5 mg / ml hebben zo weinig collageen vezels, die de cel pol kunnen de vezels ter plaatse versnipperen, het produceren van een eiland van cellen.
- Voeg de volgende ijskoude reagentia tot een steriele 15 ml centrifugebuis in volgorde:
- 3X M199: Volume = totale volume noodzakelijk / 3
- Steriel 18 MΩ water: Volume = totaal volume dat nodig is (M199 volume + kip serum volume + 0,1 M NaOH volume + collageen volume)
- Steriele kip serum: Volume = totaal volume nodig * 0,01
- Rattenstaart collageen I: Volume = (collageen gel-concentratie * totale volume nodig) / collageen voorraad concentratie
- Steriele 0,1 M NaOH: Volume = volume collageen * 0,2
Opmerking: De hoeveelheid water, 0,1 M NaOH, en collageen toegevoegd zal variëren afhankelijk van de concentratie van de collageen stamoplossing.
- Meng de collageen-oplossing met een steriele pipet.
- Direct in 0,3 ml van de collageen-oplossing in 1,9 cm 2 groeigebied putten. Dit is genoeg collageen oplossing om volledig te bedekken de put en tot een gel die ongeveer 3 mm dik is. Een gel dikte van ten minste 250 micrometer is nodig voor cel invasie studies.
- Laat het collageen oplossing gel gedurende ten minste 1 uur bij 37 ° C, 5% CO 2, en 100% vochtigheid.
- Voeg de volgende ijskoude reagentia tot een steriele 15 ml centrifugebuis in volgorde:
2. Pre-EMT endocardiale Cell Isolatie en Cultuur
- Embryo isolatie
- Plaats een centimeter lang stuk van het laboratorium tape over het grotere uiteinde van het ei. Dit is waar de luchtkamer zich bevindt. De tape stabiliseert de fragiele kwartel eierschaal.
- Voorzichtig doorboren de tape van het ei in de lucht cel met de punt van gesteriliseerde gebogen schaar.
- Maak een gat in de opgenomen deel van het ei, dat is groot genoeg om de dooier te passeren. Start het gat aan de punctie en snijd naar buiten in een spiraalvorm. Zorg ervoor dat u dwars door het buitenste membraan, maar doordringende de dooier te voorkomen.
- Wanneer het gat in de shell is voltooid, visualiseren de kwartel embryo. Het embryo is normaal gesproken zich aan de bovenkant van de dooier.
- Begin met de dooier giet door het gat in het ei met een hand. Houd een # 55 pincet in de andere hand. Als het embryo verlaat het ei op de bovenkant van de dooier, schuif de # 55 pincet onder de embryo en verwijder deze uit de dooier. Opmerking: Voor kippeneieren, het embryo isolatie houdt in het kraken van de kip ei op een scherpe, schone ondergrond en het breken van het ei in een 100 mm petrischaal. Het embryo moet zich aan de bovenkant van de dooier. Schuif # 55 pincet onder de embryo en verwijder deze uit de dooier.
- Plaats het embryo in een 100 mm petrischaal met ijs-koud, steriel EBSS.
- Stadium de embryo's volgens de criteria van Hamburger en Hamilton een. Embryo's in fase 14 - zijn laatste etappe 13, maar nog niet in fase 15, met 20-21 somieten en een staart knop. Een belangrijk kenmerk van fase 14 - embryo's is het hoofd hoek, dat is iets meer dan 90 ° ten opzichte van het lichaam.
- Haal de harten van de kwartel embryo's in fase 14 - met # 55 pincet door te snijden dwars waar het AV-kanaal en OFT contact te maken met de thoraxwand. Leg de harten aan de ene kant van de petrischaal.
- Verzamel de geïsoleerde harten met een steriele pipet overdracht en leg ze in een nieuwe 100 mm petrischaal gevuld met een steriele, ijskoude EBSS.
- Dwars Snijd de OFTs-en AV-kanalen van de hartkamers met # 55 pincet.
- Gedeelte van de resterende AV grachten en / of uitstroom traktaten (OFTs) in de lengterichting.
- Stel een pipet tot een volume van 20 ul. Gebruik deze pipet tot zes zuigen overlangs gesneden AV-kanalen en OFTs.
- Verdrijf de AV-kanalen en OFTs op de collageen-gel. Aspireren overtollige EBSS van het oppervlak van de gel.
- Gebruik # 55 pincet te oriënteren van de explantaten, zodat ze zijn plat en zo het lumen zijvlakken van de collageen-gel. Probeer niet te doorboren het collageen gel met de pincet.
- Na 2 uur bij 37 ° C en 5% CO 2, verwijder de myocardium uit de explantaten met # 55 pincet. De endocardiale cellen moet achtergelaten worden op het oppervlak van het collageen gel. Als alternatief kan de hartspier worden overgelaten aan de explantatie. Met het myocard verwijderd, de endocardiale cellen met niet ondergaan EMT zonder interventie. Met het myocard vormen een subset van de endocardiale cellen veranderen in mesenchym, maar de mate van transformatie kan gemoduleerd worden met externe factoren. Let op: Zelfs als de hartspier wordt overgelaten aan de explantatie moet kunnen minimaal 2 uur te hechten aan de gel voor medium wordt toegevoegd.
- Voeg 0,4 mL M199 medium aan elk putje met explantaten.
- Cultuur de cellen bij 37 ° C, 5% CO 2, en 100% vochtigheid.
3. Post-EMT AV Cushion Mesenchymale Cell Isolatie en Cultuur
- Crack de kip ei op een scherpe, schone ondergrond en breek het ei in een 100 mm petrischaal. Het embryo moet zich aan de bovenkant van de dooier. Pak de embryo met # 5 pincet pakken door de vliezen rondom het embryo en vervolgens het embryo te plaatsen in een 100 mm petrischaal gevuld met ijs-koude, steriele EBSS.
- Stadium de embryo's volgens de criteria van Hamburger en Hamilton een. Kenmerken van een podium 25 embryo zijn verschillende elleboog-en kniegewrichten en lichte ogen pigmentatie.
- Isoleer de harten van alle HH25 embryo's en bij elkaar plaatsen van de harten aan de ene kant van de petrischaal.
- Verzamel de geïsoleerde harten met een steriele pipet overdracht en leg ze in een nieuwe 100 mm petrischaal gevuld met een steriele, ijskoude EBSS.
- Isoleer de AV-regio van alle harten in een keer. Leg de AVS aan de ene kant van de petrischaal. Schud voorzichtig de AV-regio om alle bloed, wat levensvatbaarheid van de cellen kunnen beïnvloeden te verwijderen.
- Verzamel de geïsoleerde AVs met een steriel transferpipet en leg ze in een nieuwe 100 mm petrischaal gevuld met een steriele, ijskoude EBSS.
- Opeenvolgend isoleren de kussens van de AV. Zorg ervoor dat er geen myocardium aanwezig op de AV-kussens.
- Verzamel de geïsoleerde kussens met een steriele pipet overdracht en leg ze in een steriele 15 ml centrifugebuis.
- Spin de kussens op de bodem van de centrifugebuis op 15 xg gedurende 3 minuten.
- Gebruik een steriele 1000 mL tip om zoveel mogelijk van de EBSS supernatant als mogelijk te verwijderen zonder de kussens.
- Voeg 1 mL van 0,25% trypsine-EDTA dat is voorverwarmd tot 37 ° C. Laat de kussens te incuberen in trypsine tot ze volledig opgelost is, dat is normaal ongeveer 3-5 minuten.
- Voeg 100 ul van kip serum aan de centrifugebuis om de trypsine te lessen.
- Pellet de cellen op 160 xg gedurende 5 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof met een steriele, 1000 pi tip.
- Resuspendeer de cellen in 2 mL M199 medium en meng door pipetteren. Neem 10 pi van de celsuspensie rekenen op hemocytometer en het totaal aantal cellen die zijn geïsoleerd te bepalen
- Bepaal hoeveel collageen gels zullen worden gemaakt op basis van het aantal geïsoleerde cellen. Cellen moeten worden uitgeplaat bij een dichtheid van 2 x 10 5 cellen / ml met een 250 pi gel volume.
- Pellet de cellen op 160 xg gedurende 5 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof met een steriele, 1000 pi tip.
- Met behulp van de hierboven genoemde protocol, voeg 3X M199, water, kip serum, collageen, en 0,1 M NaOH, in die volgorde, naar de cel pellet. Meng door zachtjes te pipetteren.
- Voeg 250 ui aan elke 1,9 cm 2 groeigebied goed.
- Laat het collageen oplossing gel gedurende ten minste 1 uur bij 37 ° C, 5% CO 2, en 100% vochtigheid.
- Voeg 0,4 ml van de cultuur media en incubeer overnacht.
- Om verder te gaan kweken van de gels in stress-vrije omstandigheden, bevrijden de gels van de zijkanten van de cultuur en met behulp van een steriele 200 pi pipetpunt. Mechanisch gedwongen culturen zijn gels die gehecht blijven goed aan de zijkanten van de cultuur.
4. Representatieve resultaten
Figuur 1:. Voorbeelden van embryo's (A) HH14-kwartel embryo, en (B) HH25 kippenembryo worden hier weergegeven.
fig2.jpg "alt =" Afbeelding 2 "/>
Figuur 2: HH14-kleppen endocardiale explantaten na 2 uur van de cultuur (A) met het myocard aanwezig is, of (B) met het myocard verwijderd..
Figuur 3:. HH14-klep endocardiale explantaten (A) Met het myocard aanwezig is, veel van de cellen ondergaan endocardiale naar mesenchymale transformatie en hebben een spindel-vormige, mesenchymale fenotype na 48 uur van de cultuur. (B) Wanneer het myocard alles is verwijderd van de cellen te behouden een kasseien-vormige, endocardiale fenotype na 48 uur in de cultuur.
Figuur 4:. HH25 klep mesenchymale cellen in een collageen gel cellen zijn afgerond direct na zaaien.
Figuur 5:. HH25 mesenchymale cellen in cultuur (A) Na 48 uur van de cultuur in een beperkt collageen gel de HH25 mesenchymale cellen beginnen te verspreiden. (B) HH25 cellen in een stress-vrij collageen-gel 7 dagen na zaaien en 6 dagen na de bevrijding hebben verdicht de gel tot ongeveer 50% van de oorspronkelijke gebied.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De methode voor het isoleren van endocardiale cellen uit stadium HH14 - harten oorspronkelijk ontwikkeld door Runyan en Markwald zorgt voor een gecontroleerde, in vitro omgeving om de factoren die initiëren en moduleren embryonale EMT 2-studie. HH14 - endocardiale explantaten gekweekt zonder myocard zal niet ondergaan EMT zonder biomechanische of biochemische interventie. Als het myocard is links op de explantatie zal het signaal een subset van de endocardiale cellen om mesenchymale transformatie te ondergaan, maar externe factoren kunnen dit proces te reguleren. Het isoleren van embryonale progenitor mesenchymale stamcellen uit HH25 AV klep kussens met behulp van de methode beschreven door Butcher et al.. Biedt de mogelijkheid om te bepalen welke signalen rijden differentiatie in de richting van volwassen valvulaire interstitiële cellen 3. Het kweken van de cellen in mechanisch belaste of stress-vrije omstandigheden kan de onderzoeker sonde biomechanische stimuli, en factoren toegevoegd aan het kweekmedium kan bieden biochemische signalen. In vitro modellen die helpen bij het ontcijferen mechanismen van invloed zijn EMT, celdifferentiatie, en structurele remodellering kan worden gebruikt om beter inzicht in de oorzaken van aangeboren hartafwijkingen en kunnen helpen bij het bepalen manieren om stamcellen te rijden in de richting van volwassen klep cel fenotypes voor tissue engineering toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit onderzoek wordt ondersteund door de Hartwell Foundation, de American Heart Association (Scientist Development Grant # 0830384N) en de Stichting Leducq: Mitrale 07CVD04.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | |
Dumont tweezers #55 | World Precision Instruments, Inc. | 14099 | |
Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments, Inc. | 14098 | |
Sterile transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | |
4-well culture plates | Nalge Nunc international | 176740 | |
Sterile disposable filter units, PES, 0.2 μm pore size membrane | Nalge Nunc international | 566-0020 | |
Sterile 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
Sterile petri dishes, 100 mm x 15 mm | VWR international | 25384-342 | |
Laboratory tape | VWR international | 89097-920 | |
Rat-tail collagen I | BD Biosciences | 354236 | |
10X Earl’s Balanced Salt Solution | Quality Biological, Inc. | 119-064-131 | |
M199 powder | Invitrogen | 31100-035 | |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
Insulin-Transferrin-Selenium-G supplement (100X) | Invitrogen | 41400-045 | |
Chicken serum | Invitrogen | 16110-082 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Sodium hydroxide solution, 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
Fertile quail eggs (Coturnix coturnix) | Lake Cumberland Game Bird Farm | ||
Fertile chicken eggs (Gallus gallus) | Cornell University Poultry Farm |
References
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: A regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Developmental Biology. 95, 108-108 (1983).
- Butcher, J. T., Norris, R. A., Hoffman, S., Mjaatvedt, C. H., Markwald, R. R. Periostin promotes atrioventricular mesenchyme matrix invasion and remodeling mediated by integrin signaling through Rho/PI 3-kinase. Developmental Biology. 302, 256-256 (2007).