Summary
Bu makale, izole etmek için bir yöntem ve kültür bıldırcın veya tavuk HH14 sağlayacak
Abstract
Uygun oluşumu ve işlevi embriyonik kalp kapakçıkları, gelişim ilerlemesi için kritik öneme sahiptir. Erken embriyonik kalp miyokard tarafından çevrili endokard U-şeklinde bir tüp. Miyokardın salgılar kardiyak jöle, atriyoventriküler (AV) kavşak ve çıkış yolu (OFT) lümen içine hyaluronan zengin jelatinimsi matriks. Aşamada HH14 valvulogenesis endokardiyal hücrelerinin bir alt kümesi, mezenkimal dönüşüm (EMT) endokardiyal miyokard gelen sinyalleri geçiren alırsınız ve kalp jöle işgal başlar. Sahne HH25, kapak yastıkları tam mesenchymalized ve sonunda kalp kapak ve septal aparat formları bu mezenşimin. EMT ve hücre farklılaşma süreci başlatmak ve modüle mekanizmaların anlaşılması, ciddi konjenital kalp kusurları bağlantısı nedeniyle önemlidir. Bu çalışmada, prevalvular yastık iki farklı hücre fenotipleri-EMT endokardiyal öncesi ve post-EMT mezenkimal hücreler izole yöntemleri sunuyoruz. Ön-EMT endokardiyal hücreleri ile veya miyokard olmadan kültür olabilir. Post-EMT AV yastık mezenkimal hücreler içinde mekanik kısıtlı ya da stressiz kollajen jeller yetiştirilebilir. Bu 3D in vitro modellerinde anahtar kapak morfojenik olayları taklit ve erken ve geç dönem valvulogenesis mekanizmaları yapısızlaştırdıklarını için yararlıdır.
Protocol
1. Hazırlık
- Bereketli bıldırcın veya aşamasında 14 tavuk yumurtası inkübe - veya 25 (2 gün) (4,5 gün) yaklaşık% 60 nem ve 37 ° C.
- Steril Earl Dengeli Tuz Çözeltisi hazırlayın (EBSS)
- 100 ml, 600 ml 18 M su 10X EBSS
- 2.2 g sodyum bikarbonat
- Çözeltinin pH 7.2 'ye ayarlayın.
- 1000 ml kadar çözüm getirmek
- 0.2 mikron filtre geçerek çözüm sterilize
- Steril M199 kültür ortamı hazırlayın.
- M199 tozu 1 paket 700 ml 18 M su ekleyin.
- 2.2 g sodyum bikarbonat
- PH 7.2 'ye çözüm ayarlayın.
- 10 ml (% 1) Penisilin-Streptomisin
- 1000 ml kadar çözüm getirmek
- 0.2 mikron filtre geçerek çözüm sterilize
- 1 ml steril 100X İnsülin Transferrin-Selenyum-G ek Ekle
- 10 ml steril tavuk serumu (% 1)
- 1.5 mg / ml kollajen konsantrasyonu üç boyutlu kolajen jeller hazırlayın. 1.5 mg / ml 'den fazla bir kollajen konsantrasyonunu hücreler arasında hareket etmek için çok biyomekanik sert bir matris sağladığı laboratuarımızda Önceki çalışma göstermiştir. Mg / ml hücre tutam hücre üreten bir ada, yerel lifler parçalamak için bu kadar az kolajen liflerinin 1.5 kollajen jel konsantrasyonları daha düşüktür.
- Aşağıdaki buz reaktifler amacıyla 15 mL steril bir santrifüj tüpüne ekleyin:
- 3X M199: = toplam hacmi gerekli / 3 Cilt
- Steril 18 M su: Cilt gerekli = Toplam hacmi (M199 hacmi + tavuk serum hacmi + 0.1 M NaOH hacmi + kolajen hacmi)
- Steril tavuk serumu: Hacim = toplam hacmi gerekli * 0,01
- Sıçan kuyruk kollajen I: Hacim = (* toplam hacmi gerekli kollajen jel konsantrasyonu) / kollajen stok konsantrasyonu
- Steril 0,1 M NaOH: Hacim = kollajen hacmi * 0.2
Not: su miktarı, 0.1 M NaOH ve kollajen, kollajen stok solüsyonun konsantrasyonuna bağlı olarak değişir ekledi.
- Kollajen solüsyon, steril bir pipet ile karıştırın.
- 0.3 mL kollajen çözüm hemen 1.9 cm 2 büyüme alanı kuyu içine aktarın. Bu, tamamen iyi kapsayacak ve yaklaşık 3 mm kalınlığında bir jel sağlamak için yeterli kollajen bir çözümdür. Jel en az 250 mm kalınlığı cep işgali çalışmaları için gerekli.
- 37 en az 1 saat jel kollajen çözüm İzin ° C,% 5 CO 2 ve% 100 nem.
- Aşağıdaki buz reaktifler amacıyla 15 mL steril bir santrifüj tüpüne ekleyin:
2. Ön-EMT Endokardial Hücre İzolasyonu ve Kültür
- Embriyo izolasyon
- Yumurta büyük ucunu üzerinde laboratuvar bant inç uzunluğunda bir parça yerleştirin. Bu hava hücresinin nerede. Kaset, kırılgan bıldırcın yumurta kabuğu dengeler.
- Yavaşça ponksiyon sterilize kavisli makas ucu ile hava hücre yumurta bantlanmış alan.
- Bantlanmış kısmı yumurta sarısı geçmesine izin vermek için yeterince büyük bir delik kesin. Ponksiyon delik başlayın ve dışa doğru bir spiral şeklinde kesmek. Dış zarından kesmek, ama sarısı piercing önlemek için emin olun.
- Kabuğunda delik tamamlandığında, bıldırcın embriyo görselleştirmek. Embriyonun normal yumurta sarısı üst kısmında yer almaktadır.
- Tek elle, yumurta delik aracılığıyla sarısı dökmek için başlayın. Öte yandan # 55 cımbız tutun. Yumurta sarısı üst kısmında embriyo yumurta çıkar gibi, yavaşça embriyo altında # 55 cımbız slayt ve yumurta sarısı çıkarın. Not: tavuk yumurtası için, embriyo izolasyonu, keskin, temiz bir yüzey üzerine tavuk yumurta çatlama ve 100 mm Petri kabı içine yumurta kırarak içerir. Embriyo, yumurta sarısı üst tarafında yer almalıdır. # 55 cımbız embriyo altında yavaşça kaydırın ve yumurta sarısı çıkarın.
- Embriyo buz gibi soğuk, steril EBSS içeren bir 100 mm Petri kabı içine yerleştirin.
- Hamburger ve Hamilton 1 kriterlerine göre, embriyolar Sahne . Embriyolar aşamada 14 - Geçmiş aşamada 13, ancak henüz 20-21 Somitlerin ve bir kuyruk tomurcuk aşamasında 15,. 14 aşamada kilit özelliği - embriyolar vücut için 90 ° 'den biraz daha fazla kafa açısı.
- Aşamada 14 bıldırcın embriyoları kalpleri Kaldır - AV kanalı ve OFT göğüs duvarı ile temas kurmaya enine keserek # 55 cımbız. Petri kabı bir tarafta kalpleri bir araya koyun.
- , Steril bir transfer pipet yardımıyla izole kalpleri toplayın ve steril, buz EBSS ile dolu yeni bir 100 mm Petri kabı içine yerleştirin.
- # 55 cımbız ile ventriküller OFTs ve AV kanallar enine kesin.
- Bölüm kalan AV kanallar ve / veya boyuna çıkış yolları (OFTs).
- 20 uL hacmi bir pipet ayarlayın. AV kanallar ve OFTs uzunlamasına kesilmiş altı aspire bu pipet kullanın.
- AV kanallar ve kollajen jel üzerine OFTs boşaltınız. Jel yüzeyinden herhangi bir fazla EBSS aspire.
- Düz şekilde yönlendirmek eksplantlar # 55 cımbız kullanın ve böylece lümen tarafında kollajen jel ile karşı karşıyadır. Cımbız ile ponksiyon kollajen jel deneyin.
- 37 az 2 saat sonra ° C ve% 5 CO 2, # 55 cımbız ile eksplantlar miyokardın kaldırmak. Endokardiyal hücreler, kollajen jel yüzey geride bırakılmalıdır. Alternatif olarak, miyokardın eksplant üzerinde bırakılabilir. Miyokardın çıkarıldığında müdahalesi olmadan, değil ile endokardiyal hücreler EMT tabi. Miyokard varken endokardiyal hücrelerinin bir alt kümesi mezenşimin haline dönüştürmek, ancak dönüşüm derecesi dış faktörler ile modüle edilebilir. Not: orta eklenmeden önce miyokard kalacak olsa bile, eksplant jel eklemek için en az 2 saat olmalıdır.
- De içeren her eksplantlar 0.4 mL M199 orta ekleyin.
- Kültür 37 hücreleri ° C,% 5 CO 2 ve% 100 nem.
3. Post-EMT AV Yastık Mezenkimal Hücre İzolasyonu ve Kültür
- Crack keskin, temiz bir yüzey üzerinde tavuk yumurtası ve 100 mm Petri kabı içine yumurta kırmak. Embriyo, yumurta sarısı üst tarafında yer almalıdır. # 5 cımbız ile embriyo embriyo çevreleyen zarların kapma Pick up ve embriyo sonra buz gibi soğuk, steril EBSS ile dolu bir 100 mm Petri kabı içine yerleştirin.
- Hamburger ve Hamilton 1 kriterlerine göre, embriyolar Sahne . Bir sahne 25 embriyo özellikleri farklı dirsek ve diz eklemleri ve hafif göz pigmentasyon içerir.
- HH25 embriyolar kalpleri izole etmek ve kalpleri birbirine Petri kabı bir tarafta.
- , Steril bir transfer pipet yardımıyla izole kalpleri toplayın ve steril, buz EBSS ile dolu yeni bir 100 mm Petri kabı içine yerleştirin.
- Bir kerede tüm kalpleri AV bölgede izole edin. Petri kabı bir tarafta birlikte AVS yerleştirin. AV bölgedeki tüm kan, hücre canlılığını etkileyebilir hafifçe kaldırmak için ajitasyon.
- Izole AVS, steril bir transfer pipet yardımıyla toplayın ve steril, buz EBSS ile dolu yeni bir 100 mm Petri kabı içine yerleştirin.
- Sırayla AV yastıklar izole eder. AV minderler üzerinde hiçbir miyokardın mevcut olduğundan emin olun.
- Izole yastıklar, steril bir transfer pipet yardımıyla toplayın ve 15 ml steril bir santrifüj tüpü içine koyun.
- 3 dakika 15 xg'de santrifüj tüpüne altındaki minderler dönerler.
- Yastıklar rahatsız etmeden, mümkün olduğu EBSS süpernatant kadar çok kaldırmak için 1000 ml steril bir ucu kullanın.
- 37 önceden ısıtılmış olan 1 ml% 0.25 'lik tripsin-EDTA ° C İzin yastıkları tripsin içinde tamamen eriyene kadar inkübe, normalde 3-5 dakika.
- Tripsin gidermek için santrifüj tüpüne tavuk serum 100 mcL ekleyin.
- Pelet 5 dakika boyunca 160 xg'de hücreleri. Steril, 1000 mcL ucu ile süpernatantı.
- M199 orta ve pipetleme karışım 2 mL hücrelerin yeniden süspanse edin. Hemasitometre sayısı ve izole edilmiştir hücrelerinin toplam sayısını belirlemek için hücre süspansiyonu 10 mcL
- Kollajen jeller izole hücrelerinin sayısına göre yapılacaktır kaç belirleyin. Hücreler 250 mcL jel hacmi ile 2 x 10 5 hücre / mL yoğunluğu kaplı olması gerekir.
- Pelet 5 dakika boyunca 160 xg'de hücreleri. Steril, 1000 mcL ucu ile süpernatantı.
- Yukarıda listelenen protokolünü kullanarak, hücre pelet, bu sırayla 3X M199, su, tavuk serumu, kollajen, ve 0.1 M NaOH, eklemek. Nazik pipetleme ile karıştırın.
- Her 1.9 cm 2 büyüme alanı 250 mcL ekleyin.
- 37 en az 1 saat jel kollajen çözüm İzin ° C,% 5 CO 2 ve% 100 nem.
- 0.4 ml kültür ortamı ekleyin ve gece inkübe edin.
- Stressiz koşullarda kültür jeller devam etmek için, 200 mcL steril bir pipet kullanarak kültür taraftan jeller kurtardı. Mekanik kısıtlı kültürleri kültür taraf için de bağlı kalır jeller.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1: embriyo örnek olarak, (A) HH14-bıldırcın embriyo ve (B) HH25 tavuk embriyo burada gösterilmektedir.
fig2.jpg "alt =" Şekil 2 "/>
Şekil 2: 2 saat sonra kültür HH14-valf endokardiyal eksplantlar miyokardın varken (A) veya (B) miyokard kaldırıldı.
Şekil 3: HH14-valf endokardiyal eksplantlar (A) miyokardın mevcut hücrelerin çoğu mezenkimal dönüşüm endokardiyal geçmesi ve 48 saat sonra kültür iğ şeklinde, mezenkimal fenotip var. (B) miyokard tüm hücreleri kaldırıldığı zaman, 48 saat sonra kültür bir arnavut kaldırımı şeklinde, endokardiyal fenotip korumak.
Şekil 4: kollajen jel HH25 valf mezenkimal hücreler Hücreler hemen tohumlama sonra yuvarlanır.
Şekil 5: kültür HH25 mezenkimal hücreler (A), kısıtlı bir kollajen jel 48 saat sonra kültür HH25 mezenkimal hücreler yayılmaya başlıyor . (B), özgürlüğüne kavuştuktan sonra tohumlama ve 6 gün sonra 7 gün stressiz bir kollajen jel HH25 hücreleri orijinal alanının yaklaşık% 50 jel sıkıştırılmış.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sahne HH14 endokardiyal hücreler izole yöntemi - Runyan ve Markwald tarafından geliştirilen kalpleri başlatmak ve embriyonik EMT 2 modüle faktörleri incelemek için in vitro ortamda, kontrollü bir sağlar. HH14 - miyokardın olmadan kültür endokardiyal eksplantlar biyomekanik veya biyokimyasal müdahalesi olmadan EMT uğramaz. Miyokardın eksplant bırakılırsa endokardiyal hücrelerinin bir alt kümesi mezenkimal dönüşüme işaret edecektir, ancak dış faktörlerin bu süreci düzenleyen olabilir. HH25 AV kapak embriyonik progenitör mezenkimal hücreler Yalıtımlı Butcher ve ark. Anlatılan yöntemi kullanarak yastıklar olgun kapak interstisyel hücreler 3 doğru sürücü farklılaşma sinyalleri belirlemek için bir fırsat sağlar. Deşifre mekanizmaları etkileyen EMT, hücre farklılaşması ve yapısal yeniden şekillenme olabilir vitro modellerde mekanik stresli ve stressiz koşullarda kültür hücreleri araştırmacı biyomekanik uyaranlara prob sağlar ve kültür ortamına eklenen faktörler biyokimyasal sinyaller sağlayabilir. konjenital kalp kusurları nedenlerini daha iyi anlamak ve kök hücre, doku mühendisliği uygulamaları için olgun vana hücre fenotipleri doğru sürücü yollarını belirlemek yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Mitral 07CVD04: Bu araştırma, Amerikan Kalp Derneği (Scientist Kalkınma Hibe # 0830384N) ve Vakıf Leducq Hartwell Vakfı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | |
| Dumont tweezers #55 | World Precision Instruments, Inc. | 14099 | |
| Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments, Inc. | 14098 | |
| Sterile transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | |
| 4-well culture plates | Nalge Nunc international | 176740 | |
| Sterile disposable filter units, PES, 0.2 μm pore size membrane | Nalge Nunc international | 566-0020 | |
| Sterile 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
| Sterile petri dishes, 100 mm x 15 mm | VWR international | 25384-342 | |
| Laboratory tape | VWR international | 89097-920 | |
| Rat-tail collagen I | BD Biosciences | 354236 | |
| 10X Earl’s Balanced Salt Solution | Quality Biological, Inc. | 119-064-131 | |
| M199 powder | Invitrogen | 31100-035 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-G supplement (100X) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Chicken serum | Invitrogen | 16110-082 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide solution, 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Fertile quail eggs (Coturnix coturnix) | Lake Cumberland Game Bird Farm | ||
| Fertile chicken eggs (Gallus gallus) | Cornell University Poultry Farm |
References
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: A regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Developmental Biology. 95, 108-108 (1983).
- Butcher, J. T., Norris, R. A., Hoffman, S., Mjaatvedt, C. H., Markwald, R. R. Periostin promotes atrioventricular mesenchyme matrix invasion and remodeling mediated by integrin signaling through Rho/PI 3-kinase. Developmental Biology. 302, 256-256 (2007).
