Summary
この記事では、単離するための方法および培養ウズラやニワトリHH14を提供します
Abstract
胚の心臓弁の適切な形成と機能は、発達の進行に重要です。初期胚の心臓は心筋に囲まれた心内膜のU字型チューブです。心筋分泌心臓ゼリー、ヒアルロン酸が豊富なゼラチン状のマトリックス、房室（AV）ジャンクションと流出路（OFT）腔へ。段階でHH14 valvulogenesisは心内膜細胞のサブセットは、間葉転換（EMT）への心内膜心筋からの信号を受ける受信、および心臓のゼリーに侵入するところから始まります。段階HH25で弁膜クッションは完全にmesenchymalized、そしてそれは最終的に心臓の弁膜症と中隔装置を形成するこの間充織であるされています。 EMTと細胞分化のプロセスを開始し、調節するメカニズムを理解するために重篤な先天性心疾患への接続が重要です。本研究では、prevalvularクッションの2つの異なる細胞表現型であるプレEMT心内膜とポストEMT間葉系細胞を単離する方法を提示する。プレEMT心内膜細胞が心筋の有無に関係なく培養することができる。ポストEMT AVクッション間葉系細胞は内部に機械的制約やストレスのないコラーゲンゲルを培養することができる。 in vitroモデルこれらの3Dは、主要な弁の形態形成のイベントを模倣し、初期および後期のvalvulogenesisのメカニズムを解体するのに便利です。
Protocol
1。準備
- 湿度60％で（約2日間）または25（約4.5日）と37℃ -肥沃なウズラやニワトリの卵ステージ14までをインキュベート
- 無菌アールの平衡塩溶液を準備します（EBSS）
- 600mLの18MΩ水を100 mLの10X EBSSを追加
- 2.2グラムの重炭酸ナトリウムを追加
- 7.2溶液のpHを調整する
- 1000mLとするソリューションを育てる
- 0.2μmのフィルターを通過してソリューションを滅菌
- 無菌M199培地を準備します。
- 700mlの18MΩ水にM199粉の1パッケージを追加します。
- 2.2グラムの重炭酸ナトリウムを追加
- 7.2〜溶液のpHを調整します。
- 10mLの（1％）ペニシリン - ストレプトマイシンを追加
- 1000mLとするソリューションを育てる
- 0.2μmのフィルターを通過してソリューションを滅菌
- 1 mLの滅菌100Xインスリン - トランスフェリン - セレン- Gのサプリメントを追加
- 10mLの（1％）無菌ニワトリ血清を追加
- は1.5 mg / mLのコラーゲン濃度での三次元コラーゲンゲルを準備します。私たちの研究室の前の仕事は、以上1.5 mg / mLのコラーゲン濃度は、細胞が内を移動するためにはあまりにも生体力学的に硬いですマトリックスを提供することが示されている。コラーゲンゲルの濃度が低いよりも1.5 mg / mLのは、細胞集塊が細胞の島を生産する、局所的に繊維を細断処理できるようにいくつかのコラーゲン繊維を持っている。
- 順番に滅菌15 ml遠心チューブに以下の氷冷試薬を追加します。
- 3X M199：=合計容積必要/ 3巻
- 滅菌18MΩ水：ボリュームに必要=総容積（M199音量+ニワトリ血清ボリューム+ 0.1MのNaOHの体積+コラーゲンの量）
- 無菌ニワトリ血清：* 0.01必要な量=総体積
- ラット尾コラーゲンI：ボリューム=（コラーゲンゲルの濃度*合計容積必要）/コラーゲン原液濃度
- 滅菌0.1MのNaOH：ボリューム=コラーゲンの量* 0.2
注：水の量は、0.1 M NaOHおよびコラーゲンは、コラーゲン原液の濃度によって異なりますが追加。
- 滅菌ピペットでよくコラーゲン溶液を混ぜる。
- すぐに1.9センチメートル2成長領域のウェルにコラーゲン溶液0.3 mLを転送する。これは完全に井戸をカバーし、約3mmの厚さのゲルを提供するために十分なコラーゲン溶液です。少なくとも250μmのゲルの厚さは細胞浸潤の研究に必要です。
- 37℃で少なくとも1時間ゲルのコラーゲン溶液を許可° C、5％CO 2、および100％の湿度。
- 順番に滅菌15 ml遠心チューブに以下の氷冷試薬を追加します。
2。プレEMT心内膜の細胞分離と文化
- 胚の分離
- 卵の大きい方の端を上の実験室でのテープの1インチ長いピースを置きます。空気のセルが配置されているところです。テープは壊れやすいウズラの卵の殻を安定させます。
- ゆっくりと穿刺滅菌湾曲したハサミの先端で空気のセル内の卵のテープ面積。
- 卵黄の通過を許可するのに十分な大きさの卵のテープ部分に穴を開けます。パンクの穴を起動し、らせん状に外側にカット。外側の膜をカットしますが、卵黄にピアスを避けるようにしてください。
- シェルの穴が完了すると、ウズラ胚を可視化する。胚は、通常、卵黄の上面に位置しています。
- 片手で卵の穴の傷口から卵黄を注ぎ始める。一方で第55ピンセットを保持する。卵黄の上面上に胚が出ると卵のように、そっと胚で第55ピンセットをスライドさせて卵黄から取り外します。注：鶏の卵は、胚の分離は、シャープ、きれいな表面に鶏の卵をクラッキングおよび100mmペトリ皿に卵を壊す伴います。胚は卵黄の上面側に配置する必要があります。ゆっくりと胚の下第55ピンセットをスライドさせて卵黄から取り外します。
- 氷冷、滅菌EBSSを含む100mMシャーレに胚を置きます。
- ハンバーガーとハミルトン1の基準に従って胚をステージングします。ステージ14での胚-過去のステージ13ですが、まだステージ15で、20から21体節と尾芽を持つ。ステージ14の主要な特徴-胚は、体に90 °よりも若干大きいヘッドの角度、です。
- ステージ14でのウズラ胚から心を取り除く-第55ピンセットでAV運河とOFTが胸壁に接触する場所横方向にカットして。ペトリ皿の片側に一緒に心を置きます。
- 無菌トランスファーピペットで分離された心臓を収集し、滅菌、氷冷EBSSで満たされた新しい100ミリメートルペトリ皿に入れます。
- ＃55ピンセットで心室から横方向にOFTsとAV運河をカット。
- セクションでは、残りのAV運河及び/または縦方向に流出地帯（OFTs）。
- 20μlの体積にピペットを設定します。 AV運河とOFTsを縦方向にカット6つの吸引には、このピペットを使用してください。
- コラーゲンゲル上にAV運河とOFTsを追放する。ゲルの表面から余分なEBSSを吸引除去する。
- 彼らはフラットになるように向きを外植片に第55ピンセットを使用し、その内腔の側には、コラーゲンゲルに直面している。ピンセットで穿刺コラーゲンゲルをしないようにしてください。
- ℃、5％CO 2 37 2時間後、第55ピンセットで植から心筋を削除します。心内膜細胞は、コラーゲンゲルの表面に置き去りにされるべきである。また、心筋は、外植片にしておくことができます。心筋が削除されたため、と心内膜細胞が介入しなくてもEMTを受けない。心筋が存在すると心内膜細胞のサブセットは、間充織に変換しますが、変形の度合いは、外部要因で変調することができます。注：培地が追加される前に、心筋の上に残される場合でも、外植片は、少なくとも2時間は、ゲルへの接続を許可する必要があります。
- 各ウェルを含む植片を0.4 mLのM199培地を追加。
- 文化37細胞° C、5％CO 2、および100％の湿度。
3。ポストEMT AVクッション間葉細胞の単離と文化
- シャープ、清浄表面上に鶏の卵を割るおよび100mmペトリ皿に卵を破る。胚は卵黄の上面側に配置する必要があります。胚を包む膜をつかんで＃5ピンセットで胚をピックアップし、氷冷、滅菌EBSSで満たされた100ミリメートルシャーレに胚を置く。
- ハンバーガーとハミルトン1の基準に従って胚をステージングします。ステージ25胚の特徴は、別個の肘と膝関節とわずかな眼の色素が含まれています。
- すべてのHH25胚から心臓を隔離し、ペトリ皿の片側に一緒に心を置く。
- 無菌トランスファーピペットで分離された心臓を収集し、滅菌、氷冷EBSSで満たされた新しい100ミリメートルペトリ皿に入れます。
- 一度にすべての心からAVの領域を分離する。ペトリ皿の片側に一緒にAVを置きます。ゆっくりと細胞の生存に影響を与えることができるすべての血液を、削除するためにAVの領域に撹拌。
- 無菌トランスファーピペットで分離された視聴覚資料を収集し、滅菌、氷冷EBSSで満たされた新しい100ミリメートルペトリ皿に入れます。
- 順次AVからクッションを分離する。 AVクッションには心筋の存在がないことを確認してください。
- 無菌トランスファーピペットで分離されたクッションを収集し、滅菌15 ml遠心チューブに入れます。
- 3分15 × gで遠心分離管の底にクッションを回転させる。
- クッションを乱すことなくできるだけEBSS上清をできるだけ多く除去する滅菌1000mLのチップを使用してください。
- 37事前に暖められている0.25％トリプシン- EDTAを1 mL℃を追加それらが完全に溶解するまでクッションがトリプシンで培養することを許可する、これは3-5分程度、通常です。
- トリプシンをクエンチするために遠心分離管に鶏の血清100μLを加える。
- 5分間で160 × gでペレットは細胞。滅菌、1000μLチップで上清を取り除きます。
- M199培地とピペッティングにより混和する2mLに細胞を再懸濁します。血球計でカウントし、単離されているセルの合計数を決定するために細胞懸濁液の10μLを取る
- コラーゲンゲルを単離した細胞の数に基づいて行われる数を決定します。細胞は250μLゲル体積の2 × 10 5細胞/ mLの密度で播種する必要があります。
- 5分間で160 × gでペレットは細胞。滅菌、1000μLチップで上清を取り除きます。
- 上記のプロトコルを使用して、細胞ペレットに、そのためには3X M199、水、鶏血清、コラーゲン、および0.1MのNaOHを、追加してください。穏やかなピペッティングにより混和する。
- よく各1.9センチメートル2成長領域に250μLを追加。
- 37℃で少なくとも1時間ゲルのコラーゲン溶液を許可° C、5％CO 2、および100％の湿度。
- 培地0.4 mLを加え、一晩インキュベートする。
- ストレスのない条件下で培養ゲルを続行するには、よく滅菌、200μLピペットチップを使用して文化の側面からゲルを解放する。機械的に制約の文化はよく文化の側面に取り付けられたままにゲルである。
4。代表的な結果
図1：胚の例 （A）HH14 -ウズラの胚、及び（B）HH25ニワトリ胚がここに示されている。
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図2：HH14 -弁心内膜心筋の存在と文化の2時間後に植 （）、または（B）心筋では削除されます。
図3：HH14 -弁心内膜片 （）現在の心筋では、細胞の多くは、間葉転換に心内膜受けると文化の48時間後の紡錘状の、間葉系の表現型を持っている。 （B）心筋細胞のすべてを削除すると文化の中で48時間後の石畳の形をした、心内膜表現型を維持する。
図4：。HH25バルブ間葉系細胞をコラーゲンゲル内に細胞を播種直後に丸められます。
図5：。文化のHH25間葉系細胞は （A）制約コラーゲンゲル内培養の48時間後HH25間葉系細胞が普及し始めている。 （B）7日の解放後に播種し、6日後のストレスのないコラーゲンゲルでのHH25細胞は、元の面積の約50％にゲルを圧縮している。
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Discussion
ステージHH14から心内膜細胞を単離する方法-もともとラニアンとMarkwaldによって開発された心臓は、胚性EMT 2を開始し、変調の要因を研究するためのin vitro環境で 、制御を提供します。 HH14 -心筋なしで培養した心内膜片は、生体力学的または生化学的な介入なしにEMTを起こさない。心筋が植片上に残っている場合、それは間葉転換を受けるために心内膜細胞のサブセットを通知しますが、外部要因がこの過程を調節することがあります。 HH25 AVバルブからの胚性前駆間葉系細胞を分離すると、ブッチャーらの方法を使用してクッション3成熟した弁膜症の間質細胞に向かってドライブの分化を通知するかを決定する機会を提供する。機械的ストレスや、ストレスのない条件下で培養する細胞は、研究者が生体力学的刺激をプローブすることができます、そして培養培地に添加因子は生化学的シグナルを提供することができます。EMTに影響を与える解読のメカニズム、細胞分化、および構造的な改造に役立つvitroモデルにすることができますより先天性心臓欠陥の原因を理解し、組織工学のアプリケーションのための成熟したバルブの細胞の表現型に向かって幹細胞を駆動する方法を決定助けることができる使用。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
僧帽弁07CVD04：本研究では、ハートウェル財団、米国心臓協会（サイエンティスト開発グラント＃0830384N）と財団Leducqによってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | |
| Dumont tweezers #55 | World Precision Instruments, Inc. | 14099 | |
| Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments, Inc. | 14098 | |
| Sterile transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | |
| 4-well culture plates | Nalge Nunc international | 176740 | |
| Sterile disposable filter units, PES, 0.2 μm pore size membrane | Nalge Nunc international | 566-0020 | |
| Sterile 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
| Sterile petri dishes, 100 mm x 15 mm | VWR international | 25384-342 | |
| Laboratory tape | VWR international | 89097-920 | |
| Rat-tail collagen I | BD Biosciences | 354236 | |
| 10X Earl’s Balanced Salt Solution | Quality Biological, Inc. | 119-064-131 | |
| M199 powder | Invitrogen | 31100-035 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-G supplement (100X) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Chicken serum | Invitrogen | 16110-082 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide solution, 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Fertile quail eggs (Coturnix coturnix) | Lake Cumberland Game Bird Farm | ||
| Fertile chicken eggs (Gallus gallus) | Cornell University Poultry Farm |
References
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: A regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Developmental Biology. 95, 108-108 (1983).
- Butcher, J. T., Norris, R. A., Hoffman, S., Mjaatvedt, C. H., Markwald, R. R. Periostin promotes atrioventricular mesenchyme matrix invasion and remodeling mediated by integrin signaling through Rho/PI 3-kinase. Developmental Biology. 302, 256-256 (2007).
