Summary
الأنوفيلة البعوض stephensi نواقل الملاريا في الهند والتي تسكن في جميع أنحاء آسيا. هذا الفيديو يوضح هذه التقنية لأداء microinjections من هذا النوع مع الجينات المحورة التي من شأنها أن تضفي على الملاريا المقاومة للبعوض. الكثير من منهجية تظاهروا في هذا الفيديو هو تطبيق لتقنيات microinjection أنواع أخرى من البعوض.
Abstract
إدخال جينات دخيلة في الجينوم من البعوض microinjection يتطلب تقنيات مصممة خصيصا لأنواع محددة من الفائدة. هذا البروتوكول الفيديو يوضح الطريقة المستخدمة من قبل المختبر جيمس microinject يبني الحمض النووي في الأجنة stephensi الأنوفيلة لجيل من البعوض المتحول. وتتجلى أساليب إعداد microinjection الإبر ، وجمع واعداد وتنفيذ الأجنة microinjection.
Protocol
إعداد مقدما من microinjection :
- البعوض الدم : للحقن من الاثنين إلى الأربعاء الإناث إطعام في يوم الجمعة السابق. لحقن الخميس والجمعة ، تتغذى على الإناث يوم الاثنين من الأسبوع نفسه.
- تعد الإبر كوارتز باستخدام برنامج (2) والعازلة متساوي التوتر (انظر المواد).
- "مد أنبوب" للأجنة ذبابة الفاكهة هي ثقافة العادية القارورة. الرطب القطن والصوف في الجزء السفلي ، مع قرص من الورق الرطب تصفية تغطية هذه الأزمة.
- إعداد زلة تغطية البلاستيك عن طريق الالتزام المزدوج الجانب الشريط إلى نهاية واحدة. الشريط تقليم لتغطية زلة بحيث تنتهي عند حافة الانزلاق الغطاء.
- يعد النفط للجفاف.
- إعداد طبق بيتري مع متساوي التوتر عازلة لنقل الأجنة لالفقس.
إعداد زرع القسري :
- جمع 60-10 الإناث تغذية الدم مع استخدام لالشافطة ونقلها إلى القارورة الثقافة ذبابة الفاكهة مع القطن ورقة الترشيح الرطب مع العازلة متساوي التوتر.
- ثم يتم وضع مرة أخرى في ظروف البعوض insectery في الظلام ، وسمح لوضع البيض لمدة 1 ساعة و15 دقيقة.
- اسمحوا البالغين تطير في القفص ، وإزالة القرص رقة الترشيح مع الأجنة.
- ليصطف والبيض ، وذلك ضمن نطاق تشريح. جمع باقات من البيض مع الفرشاة الجميلة (سابل ، لا 0000) ونقل إلى مربع أعد ورقة Whatman 3MM غارقة مع العازلة متساوي التوتر. ابقاء ورقة مبللة كل مرة. لا تدع الحصول على البيض المجفف. إزالة مشيماء أديمية ظاهرة مع الفرشاة ، فإنه يساعد على عصا أفضل البيض إلى الشريط.
- باستخدام غرامة forcep رقم 5 أو الفرشاة الجميلة ، والتقاط الأجنة الرمادية الداكنة وترتيبها في خط على مربع من Whatman 3MM الرطب مع العازلة متساوي التوتر. يصطف 20-30 الأجنة. يجب أن تكون جميع الأجنة في نفس اتجاه الحقن يجب أن يكون في القطب الخلفي. نهاية الأمامي من الأجنة هو أوسع قليلا من الخلفية. ثم ، باستخدام شرائط من الورق Whatman 3MM جافة والتصفية حيث تصطف البيض بنسبة يضغط بشدة على كل من جانبي خط البيض ، وعدم لمس البيض.
- لنقل البيض ، وعكس الشريحة التي تحتوي على شريط مزدوج الوجهين (الطب) ، واضغط بلطف ضد البيض. نهاية الخلفي من البيض يجب أن تكون قريبة جدا من حافة الشريط جانب ومزدوجة. والبلل ورقة هو أمر حاسم لهذا ، إذا كانت رطبة جدا انهم لن عصا. أفعل جفاف الأجنة من المركز الثاني 50-10 ، ولكن الوقت من الجفاف يعتمد على الرطوبة ودرجة الحرارة في الغرفة microinjection.
- أمر حاسم لتجفيف البيض : قليلا الكثير من الأجنة وسوف لا يفقس. الحمض النووي من دون تجفيف ليس الخوض في الجنين.
- تغطي الأجنة المجفف مع النفط لمنع جفاف الهالوكربون أخرى.
Microinjection الأجنة :
وأهم جانب من جوانب جيدة الحقن هي نوعية الإبرة (انظر الملاحظة).
- شغل الإبرة مع الحل القائم على الحمض النووي ليتم حقنها باستخدام microloader (956،003 إيبندورف # 5242). وهناك حاجة soliution جدا حقن قليلا ، من 1 إلى 2 مل.
- الاتصال الإبرة إلى Transjector إيبندورف ، التي تسيطر على الحقن وضغط الوقت ، وكذلك في الضغط الخلفي. يتم تنفيذ Microinjection باستخدام المجهر مع مرحلة الانتقال (لايكا) في التكبير 10 x و micromanipulator (لايكا). إذا لزم الأمر ، قد تكون على استعداد مرحلة مجهر التي أثارها التراص الشرائح المجهر 4-5. ضع الغطاء زلة تحمل أجنة على المرحلة التي أثيرت. يتم حقن الاجنة بزاوية · 150 ؛ اختراق ينبغي أن يكون في القطب الخلفي. عن طريق الحقن ، وأظل الإبرة ثابتة وتحريك مرحلة من مراحل المجهر. عندما الإبرة هو جديد ، هو غيض مختومة وفواصل عادة في الحقن الأولى. أنا أعمل دائما من الضغط اللازم لطرد قطرات صغيرة من الحمض النووي في النفط في الفترات الفاصلة بين كل حقنة.
- أنا وضعت وقت الحقن ل0،2-0،9 ثانية وهكتوبسكال 1000 عندما إبرة جديدة. أنا يختلف الضغط والوقت حتى يتم النظر قطرات صغيرة تخرج من الإبرة إلى النفط. من الضغط الخلفي يحتاج إلى تعيين نحو 100. كما يحصل البالية طرف الإبرة ، وضغط الحقن لابد من تخفيض للحفاظ على انخفاض حجم الحقن (حوالي 300 هكتوبسكال). بعد هذا ، غيض إبرة كبيرة جدا وتتسبب في مقتل أكثر من الأجنة ل.
- بعد الحقن ، وإزالة النفط مع المناديل الورقية وتغطية الشريحة مع الأجنة وضعها في طبق بتري متساوي التوتر مع العازلة. ضع الأطباق في insectory وتركهم هناك حتى الأجنة يفقس. أنها بداية ليفقس بعد 2-6 أيام. نقل اليرقات في الماء المقطر مع قليل من الغذاء السمكي الأرض.
تلاحظ
تم عزل الحمض النووي البلازميد حل للحقن باستخدام طقم البلازميد EndoFree : الحمض النووي للحقن.عجلت بناء البلازميد ومزيج مساعد البلازميد معا في تركيز الحق ، مع الأيزوبروبانول. وكان بيليه تغسل مع الايثانول 70 ٪ قبل إعادة التعليق في المخزن الحقن. قبل الحقن ، باستخدام الحمض النووي نظيفة Millex GV - العمود.
Izotonic العازلة :
| كلوريد الصوديوم 1.68 M -- 88.3 مل كلوريد الصوديوم 1.68 م -- 2.9 م 1 مل M Hepes -10.7 1.12 M CaCl 2-2،2 مل DH 2 O -- 896 مل | OR | 5 M كلوريد الصوديوم -- 29.67 مل 1 م بوكل -- 4.87 مل 1 Hepes M -- 10.7 مل 1.12 M CaCl 2-2،2 مل DH 2 O -- 952.56 مل |
التكيف مع درجة الحموضة 7.2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Injection Quartz needles | Sutter Instrument Co. | O.D.- 1.0 mm, I.D.-0.70, 10 cm length, are prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 mm micropipette puller. | ||
| Quartz puller | Tool | Sutter Instrument Co. | P-2000 | Set-up: Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141 |
| EndoFree plasmid kit | Qiagen | |||
| Isopropanol | ||||
| Millex-GV column | SLGV RO4 NL | for DNA cleaning | ||
| Construct DNA | 0.5 mg/ml | |||
| Helper plasmid | 0.3 mg/ml | |||
| Injection solution | Buffer | 1x solution: 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8 | ||
| Isotonic buffer | see recipe in the protocol section | |||
| Dessication oil | Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1). Mix well. Prepare in advance of microinjection. | |||
| Blood | to feed mosquitos | |||
| Anopheles stephensi | Animal | Mosquitos, male and female. | ||
| Drosophila culture vial | for egg laying | |||
| Petri dishes | with isotonic buffer, for embryo hatching | |||
| Fine paintbrush | Sable # 0000 | |||
| 3MM Whatman paper | ||||
| Forceps #5 | ||||
| double sided tape | ||||
| Microloader | Eppendorf | 5242 956.003 | ||
| Transjector | Eppendorf | |||
| Microscope | Leica Microsystems | with moving stage and micromanipulator, set at 10x magnification |
