Summary
In questo video possiamo utilizzare un adenovirus che trasportano il gene Cre ricombinasi per infettare i fibroblasti di topo primario embrionale porta un allele floxed Rac1.
Abstract
La possibilità di rimuovere geneticamente componenti specifici delle varie cascate segnalazione cellulare è stato uno strumento integrato per l'analisi moderna di trasduzione del segnale. Un particolare metodo per raggiungere questo obiettivo la cancellazione condizionale è attraverso l'uso del Cre-loxP sistema. Questo metodo comporta che fiancheggiano il gene di interesse con i siti loxP, che sono sequenze di riconoscimento specifico per la proteina ricombinasi Cre. Esposizione del cosiddetto floxed (affiancato da sito loxP) DNA a questo risultato in un enzima Cre-mediata evento di ricombinazione nei siti loxP, e conseguente asportazione del gene intervenire 3. Esistono diversi metodi per amministrare Cre ricombinasi al sito di interesse. In questo video, che illustrano l'utilizzo di un adenovirus contenente il gene Cre ricombinasi per infettare i fibroblasti embrionali del mouse primario (MEF) ottenute da embrioni contenenti un floxed Rac1 allele 1. La nostra logica per la selezione Rac1 MEF per i nostri esperimenti è chiaro che i cambiamenti morfologici possono essere visti su cancellazione di Rac1, a causa di alterazioni del citoscheletro di actina 2,5. 72 ore dopo la trasduzione virale ed espressione Cre, le cellule sono state colorate con il colorante falloidina actina e ripreso utilizzando la microscopia confocale a scansione laser. È stato osservato che MEF che erano stati esposti al virus adeno-Cre apparsa contratta e allungata nella morfologia rispetto alle cellule non infette, in coerenza con le relazioni precedenti 2,5. Il metodo di consegna adenovirus Cre ricombinasi è vantaggioso come il Cre adeno-virus è facilmente disponibile, e l'eliminazione del gene via Cre in quasi il 100% delle cellule può essere realizzato con ottimizzati infezione adenovirale.
Protocol
Celle di scongelamento
- Ottenere fibroblasti di topo embrioni congelati (MEF) (generato in precedenza da colture di singolo embrione primaria) da azoto liquido.
- Scongelare le cellule immergendo flaconcino in acqua a 37 ° C, rimestando fino a quando i contenuti sono completamente scongelati.
- Aggiungere 9 ml di DMEM che è stato integrato con il 10% di siero fetale bovino e 1% di penicillina-streptomicina ad una piastra di coltura cellulare 10 centimetri.
- Aggiungere la sospensione cellulare scongelati goccia a goccia alla piastra, il rock delicatamente la piastra per disperdere le cellule e conservare in un CO 37 ° C, 5% 2 incubatore notte. Si noti che se le cellule sono sensibili a DMSO (dal processo di congelamento), i media iniziale può essere sostituita con mezzi freschi dopo che le cellule hanno aderito alla piastra (circa quattro ore dopo la placcatura). Si noti inoltre che la confluenza delle cellule dopo lo scongelamento dipende dal numero di cellule congelate, il tasso di recupero delle cellule dopo il congelamento, e il tasso di crescita delle cellule.
Cellule Passaging
- Quando le cellule sono cresciuti essenzialmente al 100% di confluenza (cioè il giorno successivo), aspirare al largo della media e lavare le cellule con 5 ml di PBS sterile.
- Rimuovere PBS e aggiungere 1 ml di tripsina contenente 10mM EDTA e conservare in incubatrice per circa 5 minuti per consentire alle cellule di staccarsi dalla piastra.
- Quando le cellule sono staccati, aggiungere 9 ml di supporto alle cellule trypsinized, pipetta 2-3 volte per disperdere i grumi, aggiungere 1 ml di questa sospensione goccia a goccia su un piatto nuovo che contiene 9ml di media, e questo luogo nel 37 ° C durante la notte incubatore . La presenza di FBS nei media si inattivare la tripsina, in alternativa, le cellule possono essere lavati prima di diluire la tripsina.
Conteggio e placcatura cellule su vetrini coprioggetto
- Rimuovere le cellule da incubatore, lavare e trypsinize come prima, ma questa volta aggiungere 5-6 ml mezzi di comunicazione di nuovo alle cellule trypsinized invece di 9 ml.
- Cellule pipetta a fondo per garantire la completa dissociazione in una sospensione singola cella, e rimuovere 15μL da abbinare a 15μL di tripano blu in una provetta per microcentrifuga separata.
- Mescolare questa cella / trypan sospensione blu pipettando su e giù parecchie volte, e aggiungere 15μL al emocitometro.
- Al microscopio, le cellule morte apparirà blu. Contare il numero di cellule chiare / incolore (vivente) in una delle griglie 4x4 sul emocitometro. Ripetere questa contare su tre griglie altri 4X4 (indicati A, B, C e D) e utilizzare la seguente equazione per calcolare il numero di cellule per ml di sospensione:
- Attraverso l'ottimizzazione del protocollo, abbiamo stabilito che placcatura 30.000 risultati cellule della densità cella appropriata per la visualizzazione a conclusione dell'esperimento.
- Per calcolare il volume di sospensione cellulare necessaria per 30.000 celle, utilizzare la seguente equazione:
- Ora, mettere un coperchio di vetro sterile scivolare in ciascun pozzetto di un piatto ben sei e aggiungere 2 ml di media per ogni bene, e quindi aggiungere goccia a goccia dalla sospensione cellulare il volume necessario per 30.000 cellule in ciascun pozzetto. Si noti che scivola copertura in vetro vengono utilizzati per questo esperimento come saremo visualizzare le cellule al microscopio a fluorescenza in un punto secondo momento, non tutte le applicazioni saranno necessariamente microscopia, e quindi coprire scivola potrebbe non essere necessario.
Trasduzione del virus
- Dopo diverse ore o durante la notte (tempo utile per assicurare che le cellule aderiscono al scivola copertina), rimuovere i supporti e lavare le cellule con 1 ml di DMEM senza siero.
- Aggiungere 1 ml di siero-media liberi in ciascun pozzetto per l'aggiunta del virus. Per questo esperimento, Cre adeno-virus è stato ottenuto commercialmente da Biolabs Vector.
- Ottimizzazione del protocollo precedente ha dimostrato che una molteplicità di infezione (MOI) di 500 offre trasduzione del gene altamente efficiente in primari MEF con poco o nessun effetto sulla vitalità cellulare. MOI può essere calcolato come segue:
- Aggiungere il volume calcolato di virus direttamente a ogni bene che deve essere infetto, agitare delicatamente la piastra per disperdere le cellule virus e posto in incubatore a 37 ° C durante la notte.
- La mattina successiva, rimuovere il virus contenente i media dalle cellule e lavare le cellule in 1 ml di PBS sterile e poi aggiungere 2 ml di mezzi regolari per ciascun pozzetto.
- Nel caso delle cellule Rac1 esemplificato in questo esperimento, cambiamenti morfologici avvenuti nelle cellule in circa 72 ore di trasduzione del messaggio.
Rappresentante Risultati
Le cellule sono state visualizzated dalla colorazione con il colorante actina falloidina (per scopi di imaging solo) e ripreso con il TCS-SP5 Leica multiphoton microscopio confocale a scansione laser presso il Centro di analisi avanzata presso l'Università di Guelph. La figura 1 mostra la morfologia contratta e allungata del Rac1 flox / flox cellule che sono state esposte a virus adeno-Cre rispetto alle stesse cellule non esposte al virus.
Figura 1. Confronto tra Rac1 flox / flox cellule infettate con virus adeno-Cre (a sinistra) rispetto a cellule non infettate dalla stessa fonte (a destra).
Discussion
Il video che accompagna un esempio di come un virus ricombinante può essere usato per accise uno specifico gene in vitro utilizzando Cre ricombinasi. Lo sviluppo di questo protocollo tuttavia ha rivelato alcuni particolari punti vale la pena affrontare.
- Procedure di sicurezza devono sempre essere impiegato quando si lavora con gli adenovirus. Un camice da laboratorio e guanti devono essere indossati in ogni momento mentre si lavora con il virus. Media e articoli in plastica devono essere trattati con il 10% di candeggina per almeno 30 minuti, e articoli in plastica devono essere sterilizzati in autoclave successivamente.
- Evitare ripetuti di congelamento-scongelamento dello stock del virus come questo può influenzare il titolo del virus e quindi ridurre l'efficienza di trasduzione. Piccoli volumi di magazzino virus dovrebbe inizialmente essere aliquotati in tubi separati.
- MOIS che vanno dal 5-50 sono state testate durante lo sviluppo del metodo e dei tassi di trasduzione efficiente sono stati osservati nella maggior parte dei casi, senza effetti negativi sulla vitalità cellulare.
- Adeno-GFP è stata utilizzata anche durante lo sviluppo del metodo per lo screening rapido l'efficienza di trasduzione. Questo controllo (o un vettore vuoto) deve essere effettuato durante l'esperimento per garantire che l'infezione virale da solo non porta a cambiamenti cellulari. Allo stesso modo, se floxed ablazione del gene di interesse nelle vostre cellule non comportare alcun cambiamento cellulare (ad esempio i cambiamenti nella morfologia e vitalità), quindi infettare lo stesso tipo di cella con adeno-GFP è un controllo importante da utilizzare per dimostrare che la trasduzione del virus è che si verificano.
Al di là l'esame della segnalazione cascate nella cultura, l'adeno-Cre approccio è stato utilizzato in vivo per rimuovere condizionalmente geni di animali da esperimento 3,4, e di etichettare specifiche popolazioni di cellule all'interno di un organismo 6. Il sistema di adenovirus può essere adattato anche per introdurre geni diversi da Cre ricombinasi nelle cellule ospiti. Due principali vantaggi dell'utilizzo di questo vettore di consegna sono di trasduzione del suo alto rendimento e la consegna del gene, e la mancanza di integrazione con il DNA ospite. Tuttavia, la generazione di nuovi adenovirus ricombinante può essere laborioso. Il protocollo qui descritto sfrutta quindi la potenza del sistema adenovirale sfruttando l'precedentemente sviluppato Cre adeno-virus, e giunto che con il nostro allele floxed di interesse, Rac1. Attraverso questo bussare condizionale fuori esperimento, abbiamo confermato che trasduzione con il virus adeno-Cre di MEF portando un allele floxed Rac1 effettivamente causa asportazione di Rac1 portare ai cambiamenti nella caratteristica morfologia cellulare di Rac1-deficienti cellule 2,5.
Disclosures
Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dal Consiglio canadese di prodotti per animali.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Scott Rizaldy al Mount Sinai Hospital di Toronto per il dono del primario Rac1 flox / flox topo fibroblasti embrionali. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni di funzionamento a New Jersey dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR, MOP 2009-93526) e Scienze Naturali e Ingegneria Research Council del Canada (NSERC, RG 327372-06). SH e MW sono supportati da CGSMA e CGS-M premi da CIHR e NSERC, rispettivamente.
Steve Wills Hawley e Melanie contribuito in maniera uguale a questo articolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ad-CMV-Cre virus | Vector Biolabs | 1045 | |
| DME High glucose media 500mL | Fisher Scientific | SH3002201 | |
| FBS Canadian origin 500mL | VWR international | CAA15-701 | |
| PEN-STREP 1X solution 100mL | Fisher Scientific | SV30010 | |
| Texas Red-X phalloidin | Invitrogen | T7471 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4549 |
References
- Guo, F., Debidda, M., Yang, L., Williams, D. A., Zheng, Y. Genetic Deletion of Rac1 GTPase Reveals Its Critical Role in Actin Stress Fiber Formation and Focal Adhesion Complex Assembly. J. Biol. Chem. 281, 18652-18659 (2006).
- Glogauer, M., Marchal, C. C., Zhu, F., Worku, A., Clausen, B. E., Foerster, I., Marks, P., GP, D. owney, Dinauer, M., Kwiatkowski, D. J. Rac1 deletion in mouse neutrophils has selective effects on neutrophil functions. J. Immunol. 170, 5652-5657 (2003).
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