Summary
このビデオでは、floxed Rac1の対立遺伝子を運ぶ主要なマウス胚性線維芽細胞を感染させるためにCreリコンビナーゼ遺伝子を有するアデノウイルスを使用してください。
Abstract
遺伝的に様々な細胞のシグナル伝達カスケードの特定のコンポーネントを削除する機能は、近代的なシグナル伝達の解析に不可欠なツールとなっています。この条件の削除を実現する一つの特定のメソッドでは、Cre - loxP組システムの使用を介してです。このメソッドは、Creリコンビナーゼのタンパク質に特異的な認識配列であるloxP部位、で目的の遺伝子に隣接伴います。 Creを介した組換えloxP部位でのイベント、および介在する遺伝子3のその後の切除でこの酵素の結果に、いわゆるfloxed（loxP部位によって挟まれた）DNAの露出。いくつかの異なる方法は、興味のあるサイトにCreリコンビナーゼを管理するために存在します。このビデオでは、我々はfloxed Rac1の対立遺伝子1を含む胚から得られた一次マウス胚性繊維芽細胞（MEF）を感染させるためにCreリコンビナーゼ遺伝子を含むアデノウイルスの使用を示します。私たちの実験のためにRac1のMEFのを選択するための論理的根拠は、その明確な形態学的変化が原因でアクチン細胞骨格の2,5の変化に、Rac1の削除時に見られるようです。ウイルスの形質導入とCreの発現後72時間は、細胞はアクチン染料ファロイジンを用いて染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて画像化した。それは、アデノ- CreをウイルスにさらされていたMEFのは、非感染細胞と比較して以前の報告2,5と一致して契約し、形態に長い現われたことが観察された。 Creリコンビナーゼの配信のアデノウイルスの方法は、アデノのCreのウイルスが容易に利用できるように有利である、と細胞のほぼ100％にCreを経由して遺伝子の欠失は、最適化されたアデノウイルス感染を達成することができます。
Protocol
融解細胞
- 液体窒素から凍結マウス胚性繊維芽細胞（MEF）を（個々の胚初代培養から、以前に生成される）を取得。
- 37バイアルを浸漬し融解のセル内容が完全に融解するまで渦巻く° Cの水。
- 10cmの細胞培養プレートに10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン - ストレプトマイシンを補充されたDMEMの9mLを追加。
- プレートに滴下融解した細胞懸濁液を追加し、37℃、5％CO 2インキュベーターで一晩細胞と場所のプレートを分散させるために軽くプレートを揺らし。プレート（約4時間後メッキ）に付着した細胞は、DMSO（凍結プロセスから）に敏感な場合、初期メディアが、細胞の後に新鮮な培地と交換できることに注意してください。また、凍結した細胞の数は、凍結後の細胞の回収率、および細胞の増殖速度に依存して解凍後の細胞のその合流点に注意してください。
継代細胞
- 細胞がコンフルエントに本質的に100％（例：次の日）に成長しているときに、メディアをオフに吸引し、滅菌PBS 5mlの細胞を洗浄する。
- PBSを削除し、細胞がプレートからデタッチするまで、約5分間インキュベーターに10mMのEDTAと場所のプレートを含むトリプシン液1mLを加える。
- 細胞がはがれるしたら、、塊を分散メディアの9mLを含む新しいプレート上に滴下この懸濁液1mLを追加し、37℃インキュベーターで一晩にこれを置くためにトリプシン処理細胞にメディアの9mLを加え、ピペット2-3回。メディアのFBSの存在が交互にトリプシンを不活性化する、細胞をトリプシンを希釈する最初の洗浄することができます。
カバースリップ上に細胞をカウントし、めっき
- インキュベーターから細胞を除去する、この時間を除いてバックの代わりに9mLのトリプシン処理細胞に5 - 6mLメディアを追加し、以前と同様に洗浄し、トリプシン処理。
- ピペットは、細胞の単一細胞の懸濁液中に完全な解離を確実に、そして別のマイクロチューブにトリパンブルーの15μLと組み合わせること15μL削除する。
- 数回上下にピペッティングして、このセル/トリパンブルーサスペンションを混合し、血球計算盤に15μL加える。
- 顕微鏡下で、死細胞は青色表示されます。血球計算板で4X4のグリッドのいずれかで、明確な/無色（生きた）細胞の数を数えます。他の3つの4X4のグリッド（A、B、CとDと表される）で、このカウントを繰り返して、サスペンションのμLあたりのセル数を求めるには、以下の計算式を使用します。
- プロトコルの最適化を通じ、我々は、実験の終了時に可視化のために適切な細胞密度に30,000細胞の結果をメッキすることを決定した。
- 30,000細胞に必要な細胞懸濁液の体積を計算するには、次の式を使用します。
- 現在6つのウェルディッシュの各ウェルに滅菌ガラスカバースリップを配置し、各ウェルにメディアの2mLのを追加して、細胞懸濁液30,000細胞に必要な量から各ウェルに滴下追加。我々は、後の時点で蛍光顕微鏡を用いて細胞を可視化されるようにガラスのカバースリップがこの実験のために使用されることに注意してくださいではないすべてのアプリケーションは、必ずしも顕微鏡を必要とし、したがって、伝票が必要とされていない可能性がありますカバーします。
ウイルスの形質導入
- 数時間または一晩（細胞はカバースリップに従っていることを保証するために十分な時間）の後、メディアを取り出し、無血清DMEM 1mLの細胞を洗浄する。
- ウイルスの追加のために各ウェルに無血清培地1mLのを追加。この実験では、アデノウイルスのCreはベクトルBiolabs社から商業的に入手した。
- 以前のプロトコルの最適化は、500の感染多重度が（MOI）細胞の生存にほとんど、あるいはまったく効果が主のMEFに非常に効率的な遺伝子導入を提供することが示されている。 MOIは次のように計算することができます。
- 感染している各ウェルに直接ウイルスの計算量を追加して、ゆっくりと一晩37℃のインキュベーター中にウイルスや場所の細胞を分散させるためにプレートを揺らし。
- 翌朝は、ウイルスを含む細胞から培地を除去し、1mLの滅菌PBSで細胞を洗浄し、各ウェルに定期的なメディアの2mLの追加。
- この実験において例示Rac1の細胞の場合には、形態学的変化は、約72時間後に伝達における細胞内で発生した。
代表的な結果
視覚化された細胞アクチン染料ファロイジン（イメージングのためだけに）で染色し、ゲルフ大学の高度な分析センターでライカTCS - SP5多光子共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて画像によるd。図1は、ウイルスにさらされていない同じ細胞と比較して、アデノのCreのウイルスにさらされたRac1のFLOX / FLOX細胞の収縮と伸長形態を示しています。
図1と同じソース（右）から非感染細胞と比較してアデノウイルスのCre（左）に感染してRac1のFLOX / FLOXセル間の比較。
Discussion
付属のビデオでは、組換えウイルスはCreリコンビナーゼを用いた in vitro における消費税の特定の遺伝子にどのように使用できるかを例示している。このプロトコルの開発は、しかし、アドレッシング価値があるいくつかの特定の点を明らかにしました。
- アデノウイルスを使用する際、適切な安全手順を常に使用すべきである。ウイルスでの作業中に白衣と手袋を常に着用してください。メディアとプラスチック容器は、少なくとも30分間、10％の漂白剤で治療されるべきである、とプラスチック製の食器は、その後オートクレーブしてください。
- これはウイルスの力価に影響を与えるため、導入効率を減らすことができるように繰り返されたウイルス株の凍結融解は避けてください。ウイルスストックの小さなボリュームは別々のチューブに等分されるべきである。
- 50から500に至るまでMOISは、メソッドの開発中にテストされたと効率的な伝達率は、細胞の生存に悪影響することなく、ほとんどのケースで観察された。
- アデノ- GFPは、迅速形質導入効率をスクリーニングする方法の開発中に使用されていました。このコントロール（または空のベクター）は、細胞の変化が発生しないだけで、ウイルス感染を確保するため、実験中に実施されるべきである。同様に、あなたの細胞への関心のfloxed遺伝子を切り出すことはあらゆる細胞の変化（形態や生存率、すなわち変化）が発生しない場合は、アデノ- GFPと同じ細胞型を感染させると、そのウイルスの伝達を示すために使用することが重要コントロールですです発生。
文化のシグナル伝達カスケードをの調査を超えて、アデノのCreのアプローチはまた、条件付きで実験動物3,4からの遺伝子を除去するため、および生物6内の細胞の特定の集団を標識するためにin vivoで採用されている。アデノウイルスシステムはまた、宿主細胞にCreリコンビナーゼ以外の遺伝子を導入するために適応させることができます。この送達ベクターを使用しての二つの主要な利点はその高い伝達と遺伝子デリバリー効率、及び宿主DNAとの統合の欠如です。しかし、新規な組換えアデノウイルスの発生は、労働集約することができます。プロトコルは、したがって、ここで説明する以前に開発されたアデノのCreのウイルスを利用する、と関心、Rac1の私たちのfloxed対立遺伝子とのことをカップリングさせることによりアデノウイルスシステムのパワーを利用。実験からこの条件ノックを通じ、我々はfloxed Rac1の対立遺伝子を運ぶMEFのアデノのCreのウイルスを使用して、その伝達を確認していることは確かにRac1の切除は、Rac1の欠損細胞の細胞形態の特徴2,5の変化につながる可能性がありません。
Disclosures
動物実験は動物のケアに関するカナダの理事会が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。
Acknowledgments
著者らは、プライマリRac1のFLOX / FLOXマウス胚線維芽細胞の彼の贈り物のためにトロント、オンタリオ州マウントサイナイ病院のDr。Rizaldyスコットに感謝します。この作品は、健康研究（CIHR、MOP 2009から93526）と自然科学とカナダの工学研究審議会（NSERC、RG 327372〜06）のカナダの協会からニュージャージー州まで営業の補助金によって支えられている。 SHとMWは、それぞれ、CIHRとNSERCからCGSMAとCGS - Mの賞でサポートされています。
スティーブハーレイとメラニーのウィルズは、この論文にも同様に貢献した。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ad-CMV-Cre virus | Vector Biolabs | 1045 | |
| DME High glucose media 500mL | Fisher Scientific | SH3002201 | |
| FBS Canadian origin 500mL | VWR international | CAA15-701 | |
| PEN-STREP 1X solution 100mL | Fisher Scientific | SV30010 | |
| Texas Red-X phalloidin | Invitrogen | T7471 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4549 |
References
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