Summary
In deze video gebruiken we een adenovirus het dragen van de Cre-recombinase-gen tot de primaire muis embryonale fibroblasten het dragen van een floxed Rac1 allel infecteren.
Abstract
De mogelijkheid om genetisch te verwijderen specifieke onderdelen van de verschillende cell signaling cascades is een integraal instrument in de moderne signaaltransductie analyse. Een bijzondere methode om deze voorwaardelijke verwijdering te bereiken is via het gebruik van het Cre-loxP systeem. Deze methode houdt in flankerend het gen van belang met loxP sites, die specifiek zijn herkenningssequenties voor het Cre recombinase eiwit. Blootstelling van de zogenaamde floxed (geflankeerd door loxP site) DNA aan dit enzym resulteert in een Cre-gemedieerde recombinatie evenement op de loxP plaatsen, en de daaropvolgende excisie van de tussenliggende gen 3. Verschillende methoden bestaan om Cre recombinase toe te dienen aan de plaats van belang. In deze video, tonen we het gebruik van een adenovirus met het Cre recombinase-gen tot de primaire muis embryonale fibroblasten (MEF) verkregen uit embryo's met een floxed Rac1 allel een infecteren. Onze reden voor de keuze van Rac1 MEFs voor onze experimenten is dat duidelijk morfologische veranderingen te zien bij de verwijdering van Rac1, als gevolg van veranderingen in het actine cytoskelet 2,5. 72 uur na virale transductie en Cre expressie, werden de cellen gekleurd met behulp van de actine kleurstof phalloidin en beeld gebracht met behulp van confocale laser scanning microscopie. Er werd vastgesteld dat MEFs die waren blootgesteld aan het adeno-virus verscheen Cre gecontracteerd en langwerpig in de morfologie in vergelijking met niet-geïnfecteerde cellen, in overeenstemming met eerdere verslagen 2,5. Het adenovirus methode van Cre recombinase aflevering is voordelig als het adeno-virus Cre is makkelijk verkrijgbaar, en gendeletie via Cre in bijna 100% van de cellen kan worden bereikt met optimale adenovirale infectie.
Protocol
Ontdooien cellen
- Verkrijgen bevroren muis embryonale fibroblasten (MEF) (voorheen gegenereerd uit individuele embryo primaire culturen) van vloeibare stikstof.
- Dooi cellen door onderdompeling flacon in 37 ° C water met wervelende totdat de inhoud volledig ontdooid.
- Voeg 9ml van DMEM dat is aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine met een 10cm celcultuur plaat.
- Voeg de ontdooide celsuspensie druppelsgewijs op de plaat, schud de plaat naar de cellen en laat de plaat te verspreiden in een 37 ° C, 5% CO 2 incubator 's nachts. Merk op dat als de cellen gevoelig zijn voor DMSO (uit de bevriezing proces), de eerste media kunnen worden vervangen door vers medium nadat cellen hebben gehandeld op grond van de plaat (ongeveer vier uur na de plating). Ook dat samenvloeiing van de cellen opmerking na ontdooien hangt af van het aantal van bevroren cellen, de opbrengst van de cellen na het bevriezen, en de groei van de cellen.
Passage cellen
- Wanneer cellen zijn gegroeid in wezen 100% confluentie (dat wil zeggen: de volgende dag), zuigen uit de media en was cellen met 5 ml steriele PBS.
- Verwijder de PBS en voeg 1 ml trypsine bevat 10 mM EDTA en laat de plaat in de incubator voor ongeveer 5 minuten om cellen te los van de plaat.
- Wanneer de cellen hebben losgemaakt, voeg 9ml van media om de getrypsiniseerd cellen, pipet 2-3 keer om groepjes uiteen te drijven, 1 ml van deze suspensie voeg druppelsgewijze op een nieuwe plaat met 9ml van de media, en deze plaats in het 37 ° C incubator 's nachts . De aanwezigheid van FBS in de media zal de trypsine alternatief te inactiveren, kunnen cellen eerst gewassen te verdunnen het trypsine.
Tellen en beplating cellen op dekglaasjes
- Verwijder de cellen van incubator, wassen en trypsinize als voorheen, behalve dat dit keer weer toevoegen 5-6 ml media om de getrypsiniseerd cellen in plaats van 9ml.
- Pipet cellen grondig in te vullen dissociatie zorgen in een enkele celsuspensie en verwijder 15μL met 15μL van trypan blauw te combineren in een aparte microfugebuis.
- Mix deze cel / trypan blauw schorsing door en neer te pipetteren meerdere malen, en voeg 15μL aan de hemocytometer.
- Onder de microscoop, wordt dode cellen verschijnen blauw. Tel het aantal duidelijke / kleurloze (levende) cellen in een van de 4X4 roosters op de hemocytometer. Herhaal deze rekenen op de drie andere 4x4 grids (aangeduid A, B, C en D) en gebruik de volgende vergelijking om het aantal cellen per microliter van de ophanging te berekenen:
- Door middel van protocol optimalisatie, hebben wij vastgesteld dat plating 30.000 cellen resultaten in geschikte celdichtheid voor visualisatie aan het einde van het experiment.
- Voor het berekenen van het volume van de celsuspensie die nodig is voor 30.000 cellen, gebruikt u de volgende vergelijking:
- Plaats nu een steriele glazen deksel glijden in elk putje van een zes goed gerecht en voeg 2 ml van de media aan elk putje, en dan voeg druppelsgewijze uit uw celsuspensie het volume nodig voor 30.000 cellen in elk putje. Merk op dat glas dekglaasjes worden gebruikt voor dit experiment omdat we zullen het visualiseren van de cellen met behulp van fluorescentie microscopie op een later tijdstip, niet alle toepassingen zullen noodzakelijkerwijs microscopie, en dus dekglaasjes mag niet worden verlangd.
Virus Transductie
- Na een aantal uren of een nacht (voldoende tijd om ervoor te zorgen dat de cellen zich houden aan de dekglaasjes), verwijder de media en wassen cellen met 1 ml van het serum-vrij DMEM.
- Voeg 1 ml serum-vrije media aan elk goed voor de toevoeging van het virus. Voor dit experiment werd adeno-Cre virus in de handel verkrijgbaar bij Vector Biolabs.
- Vorige protocol optimalisatie heeft aangetoond dat een multipliciteit van infectie (MOI) van 500 zeer efficiënte transductie-gen geeft in primaire MEFs met weinig of geen effect op de levensvatbaarheid van de cellen. MOI kan als volgt worden berekend:
- Direct toe te voegen het berekende volume van het virus aan elk goed, dat is besmet zijn, schud de plaat aan het virus en de plaats cellen 's nachts verspreidt zich in de 37 ° C incubator.
- De volgende ochtend, verwijder de virus-bevattende media uit de cellen en de cellen in 1 ml steriele PBS gewassen en voeg 2 ml van de reguliere media aan elk putje.
- In het geval van de Rac1 cellen toegelicht in dit experiment, morfologische veranderingen opgetreden in de cellen op ongeveer 72 uur na transductie.
Representatieve resultaten
Cellen werden visualiserend door kleuring met de kleurstof actine phalloidin (voor imaging doeleinden) en beeld gebracht met behulp van de Leica TCS-SP5 multifoton confocale laser scanning microscoop op de Advanced Analysis Centre van de Universiteit van Guelph. Figuur 1 toont de gecontracteerde en langwerpige morfologie van de Rac1 Flox / Flox cellen die waren adeno-Cre virus worden blootgesteld in vergelijking met dezelfde cellen niet worden blootgesteld aan het virus.
Figuur 1. Vergelijking tussen Rac1 Flox / Flox cellen die geïnfecteerd zijn met adeno-Cre virus (links) vergeleken met niet-geïnfecteerde cellen uit dezelfde bron (rechts).
Discussion
De bijhorende video is een voorbeeld van hoe een recombinant virus kan worden gebruikt om accijnzen een specifiek gen in vitro gebruik van Cre recombinase. De ontwikkeling van dit protocol echter wel onthullen een aantal specifieke punten waard adressering.
- De juiste veiligheidsprocedures moeten altijd worden gebruikt bij het werken met adenovirussen. Een laboratoriumjas en handschoenen moeten worden gedragen op elk moment tijdens het werken met het virus. Media en kunststofmateriaal moeten worden behandeld met 10% bleekmiddel voor ten minste 30 minuten, en kunststofmateriaal moet daarna worden geautoclaveerd.
- Vermijd herhaaldelijk bevriezen en ontdooien van het virus aandelen als deze kunnen dus virus titer beïnvloeden en te verminderen transductie efficiëntie. Kleine hoeveelheden van het virus voorraad moet in eerste instantie worden in hoeveelheden verdeeld in aparte buizen.
- MOIS variërend 50 tot 500 werden getest tijdens de methode-ontwikkeling en efficiënte transductie percentages werden waargenomen in de meeste gevallen, zonder negatieve effecten op de levensvatbaarheid van de cellen.
- Adeno-GFP werd ook gebruikt tijdens de ontwikkeling van methodes om snel het scherm transductie efficiëntie. Deze controle (of een lege vector) moeten worden uitgevoerd tijdens het experiment aan dat virale infectie alleen zorgen niet leidt tot cellulaire veranderingen. Evenzo, als de weg te snijden floxed gen van interesse in je cellen niet resulteert in een cellulaire veranderingen (dat wil zeggen veranderingen in de morfologie of levensvatbaarheid), dan infecteert hetzelfde celtype met adeno-GFP is een belangrijk controle te gebruiken om aan te tonen dat virus transductie is voorkomen.
Buiten het onderzoek van de signalering cascades in de cultuur, heeft het adeno-Cre aanpak ook is gebruikt in vivo voorwaardelijk genen te verwijderen van proefdieren 3,4, en specifieke populaties van cellen label binnen een organisme 6. Het adenovirus systeem kan ook worden aangepast aan andere genen dan de Cre-recombinase in gastheercellen te introduceren. Twee belangrijkste voordelen van het gebruik van deze aflevering vector door zijn hoge transductie en gen delivery-efficiëntie, en het gebrek aan integratie met gastheer-DNA. Echter, de generatie van nieuwe recombinante adenovirussen te arbeidsintensief. Het protocol beschreven hier dus benut de kracht van het adenovirale systeem door gebruik te maken van de eerder ontwikkelde adeno-Cre virus, en de koppeling die met onze floxed allel van belang, Rac1. Door middel van deze voorwaardelijke knock-out experiment, hebben we bevestigd dat transductie met behulp van het adeno-virus van Cre MEFs het dragen van een floxed Rac1 allel wel degelijk excisie van Rac1 die leidt tot de veranderingen in de cellulaire morfologie kenmerk van Rac1-deficiënte cellen 2,5 veroorzaken.
Disclosures
Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Canadese Raad voor Dierenaangelegenheden Care set.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Dr Rizaldy Scott bedanken Mount Sinai Hospital in Toronto, Ontario voor zijn gave van de primaire Rac1 Flox / Flox muis embryonale fibroblasten. Dit werk werd ondersteund door exploitatiesubsidies ten behoeve van New Jersey van de Canadese Institutes of Health Research (CIHR, MOP 2.009 tot 93.526 duizend) en de Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC, RG 327.372-06). SH en MW worden ondersteund door CGSMA en CGS-M onderscheidingen van CIHR en NSERC, respectievelijk.
Steve Hawley en Melanie Wills droegen ook aan deze krant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ad-CMV-Cre virus | Vector Biolabs | 1045 | |
| DME High glucose media 500mL | Fisher Scientific | SH3002201 | |
| FBS Canadian origin 500mL | VWR international | CAA15-701 | |
| PEN-STREP 1X solution 100mL | Fisher Scientific | SV30010 | |
| Texas Red-X phalloidin | Invitrogen | T7471 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4549 |
References
- Guo, F., Debidda, M., Yang, L., Williams, D. A., Zheng, Y. Genetic Deletion of Rac1 GTPase Reveals Its Critical Role in Actin Stress Fiber Formation and Focal Adhesion Complex Assembly. J. Biol. Chem. 281, 18652-18659 (2006).
- Glogauer, M., Marchal, C. C., Zhu, F., Worku, A., Clausen, B. E., Foerster, I., Marks, P., GP, D. owney, Dinauer, M., Kwiatkowski, D. J. Rac1 deletion in mouse neutrophils has selective effects on neutrophil functions. J. Immunol. 170, 5652-5657 (2003).
- Prost, S., Sheahan, S., Rannie, D., Harrison, D. J. Adenovirus-mediated Cre deletion of floxed sequences in primary mouse cells is an efficient alternative for studies of gene deletion. Nucleic Acids Res. 29, E80-E80 (2001).
- Rijnkels, M., Rosen, J. M. Adenovirus-Cre-mediated recombination in mammary epithelial early progenitor cells. J. Cell. Sci. 114, 3147-3153 (2001).
- Vidali, L., Chen, F., Cicchetti, G., Ohta, Y., Kwiatkowski, D. J. Rac1-null mouse embryonic fibroblasts are motile and respond to platelet-derived growth factor. Mol. Biol. Cell. 17, 2377-2390 (2006).
- Wang, H., Xie, H., Zhang, H., Das, S. K., Dey, S. K. Conditional gene recombination by adenovirus-driven Cre in the mouse uterus. Genesis. 44, 51-56 (2006).
