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Biology

Azul nativos electroforesis en gel de poliacrilamida (BN-PAGE) para el análisis de los complejos Multiproteinas de lisados ​​celulares

doi: 10.3791/2164 Published: February 24, 2011
* These authors contributed equally

Summary

En este video, se describe la caracterización de los complejos multiproteicos (PSM) por el azul electroforesis nativa en gel de poliacrilamida (BN-PAGE). En una primera dimensión, se dializan lisados ​​celulares están separados por BN-PAGE para identificar PSM individual. En una segunda dimensión SDS-PAGE, PSM de interés se subdividen para analizar sus componentes por inmunotransferencia.

Abstract

Complejos multiproteicos (PSM) juegan un papel crucial en la señalización celular, ya que la mayoría de las proteínas se pueden encontrar en complejos funcionales o de reglamentación con otras proteínas (Sali, Glaeser et al. 2003). Así, el estudio de las redes de interacción proteína-proteína requiere de la caracterización detallada de los países socios mediterráneos para obtener una comprensión integradora de la función de la proteína y la regulación. Para la identificación y el análisis, los países socios mediterráneos deben ser separados en condiciones nativas. En este video, se describe el análisis de los países socios mediterráneos por el azul de electroforesis en gel de poliacrilamida nativo (BN-PAGE). BN-PAGE es una técnica que permite la separación de los PSM en una conformación nativa con una resolución mayor que la ofrecida por filtración en gel o ultracentrifugación de densidad de sacarosa, y por tanto es útil para determinar el tamaño del MPC, la composición y abundancia relativa (Schagger y von Jagow 1991) ; (Schagger, Cramer et al, 1994).. Mediante este método, las proteínas se separan según su tamaño y forma hidrodinámica en una matriz de poliacrilamida. En este caso, se demuestra el análisis de los PSM del total de lisados ​​celulares, señalando que la diálisis lisado es el paso crucial para hacer BN-PAGE aplicable a las muestras biológicas. Usando una combinación de primera dimensión BN-y segunda dimensión SDS-PAGE, se muestra que los países socios mediterráneos separados por BN-PAGE se pueden subdividir en sus componentes individuales por SDS-PAGE. La visualización de los componentes MPC después de la separación de gel se realiza por immunoblotting estándar. A modo de ejemplo para el análisis de MPC por BN-PAGE, se optó por el 19S bien caracterizados eucariotas, 20S, 26S y los proteasomas.

Protocol

** Este protocolo de vídeo se basa en una publicación asociada 1: Azul electroforesis en gel de poliacrilamida nativos (BN-PAGE) para la identificación y análisis de los complejos Multiproteinas. Mahima Swamy, Gabrielle M. Siegers, Susana Minguet, Bernd Wollscheid, y Wolfgang WA Schamel. STKE de la ciencia 2006 (345): PL2, 25 de julio de 2006, [DOI: 10.1126/stke.3892006pl4]. Por favor, haga clic aquí para ver esta publicación .

1. Preparación de lisado celular dializado

  1. Cosecha de 10x10 6 células por centrifugación y el precipitado en 350 gramos por 5 min a 4 ° C.
  2. Lavar el pellet de células tres veces con 1 ml de helado de PBS (receta 1), centrifugar como en el paso 1.1.
  3. Resuspender el pellet en 250 l de helado de BN-Tampón de lisis (receta 2) e incubar en hielo durante 15 minutos.
  4. Se centrifuga a 13.000 g durante 15 min a 4 ° C para eliminar el material insoluble.
  5. Derretir un agujero en la tapa de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con la cara caliente de gran diámetro de una pipeta de Pasteur, y luego colocar el tubo en hielo para enfriar a 4 ° C.
  6. Transferir el sobrenadante del paso 1.4 en el tubo refrigerado con el agujero en la tapa.
  7. Colocar una membrana de diálisis (peso molecular de corte de 10 kDa) con una pinza en la parte superior del tubo abierto, cerrar la tapa, y cortar el exceso de membrana de diálisis que sobresale.
  8. Sello de la tapa en el lado cuidadosamente con Parafilm.
  9. Invertir los tubos de centrífuga y al revés en la velocidad más baja posible en un tubo cónico de 50 ml en una centrífuga de cultivo celular de 10 segundos a 4 ° C. Retire el tubo invertido de la centrífuga con unas pinzas para evitar el giro a la derecha del tubo hacia arriba.
  10. Prepare un vaso de 100 ml con agua fría BN-diálisis Buffer (receta 3) y una placa de agitación. Utilice por lo menos 10 ml de solución de diálisis por BN-100-l de la muestra.
  11. Colocar el tubo con la cinta al revés en el interior del vaso, y eliminar las burbujas de aire por el agujero debajo de la tapa con una inclinación pipeta Pasteur.
  12. Vaso de lugar en lo alto de un agitador magnético, interruptor en el agitador y se deja durante 6 horas o toda la noche en el cuarto frío. Compruebe de vez en cuando para asegurarse de que la agitación no es la creación de burbujas de aire en la membrana de diálisis.
  13. Recoger el lisado celular dializado en un tubo de microcentrífuga refrigerada nuevo.

2. Vertido de BN-gel

  1. Gel de gradiente verter se hace a temperatura ambiente con un mezclador de gradiente. Los guantes deben ser usados ​​porque es muy poliacrilamida neurotóxica. Evitar cualquier contacto con SDS.
  2. Coloque la mezcla en el gradiente de una placa de agitación y adjuntarlo a un trozo de tubo flexible. Cerrar el canal con la válvula de la tubería y cerrar con una pinza. Coloque un agitador magnético del 15% en el "alto" cilindro conectado a la tubería.
  3. Pase el tubo flexible a una bomba de peristalitic y adjuntar una aguja de la jeringa hasta el final. Luego, colocar la aguja entre las dos placas de vidrio del aparato de gel.
  4. Prepare un 4% (ver receta 5) y el 15% (ver receta a 6) que separa las soluciones de gel, y agregó APS y TEMED inmediatamente antes del uso. Los volúmenes combinados debe ser igual al volumen del gel de separación.
  5. Vierta las soluciones de gel en los cilindros correspondientes del mezclador de gradiente (4% en el nivel "bajo" y un 15% en el "alto" del cilindro).
  6. Abra la válvula y la fuerza de la burbuja de aire en el interior del canal que une los dos depósitos de gel pulsando sobre el cilindro de la izquierda con el pulgar.
  7. Encienda el agitador magnético, quitar la pinza, y el interruptor de la bomba peristalitic a 5 ml por minuto. Deje que el gel fluya lentamente entre las placas de vidrio. Asegúrese de que la aguja está siempre por encima del líquido.
  8. Permita que todo el líquido para entrar en el aparato del gel, y luego suavemente con superposición de isopropanol. Deje que el gel polimeriza por lo menos 30 minutos a temperatura ambiente.
  9. Limpie el aparato verter inmediatamente con dH 2 O (no usar detergente).
  10. Retire el isopropanol, lavado con dH 2 O, y quitar el dH 2 O con un papel Whatman.
  11. Preparar un gel de 3,2% de apilamiento (receta 7), la adición de APS y TEMED inmediatamente antes del uso.
  12. Verter el gel de apilamiento en la parte superior del gel de separación e introducir el peine entre las placas de vidrio, evitando las burbujas. Después de que el gel de apilamiento ha polimerizado, el gel frío a 4 ° C.
  13. Inmediatamente antes de la carga de la muestra, retire el peine lentamente, tirando de él en un ángulo con el plano del gel. Esto permite que el aire entre en los bolsillos rápidamente, lo que mejora la calidad de los pozos.

3. La separación de lisado celular dializado por BN-PAGE

  1. Carga 1 a 40 l de lisado dializado y de 10 a 20 l de mezcla de marcadores (fórmula 10) en los pozos secos a 4 ° C. Superposición de las muestras en cada pocillo con solución tampón de cátodo frío (ver receta a 8).
  2. Llenar la cámara interior con gato fríoHode de Estabilización y la cámara exterior / inferior con el tampón del ánodo frío (ver receta a 9).
  3. Aplicar 100 V a 150 V o un minigel a un gel grande, hasta que las muestras han entrado en el gel de separación. Correr el gel a 4 ° C.
  4. Aumentar la tensión de 180 V (minigel) o 400 V (gel de gran tamaño) y se extenderán hasta la parte delantera tinte llega al final del gel. El plazo es de 3 a 4 horas para un mini-, y de 18 a 24 horas para un gel de gran tamaño.

4. La segunda dimensión SDS-PAGE

  1. Elaborar una norma del 10% SDS-gel (recetas 12-15) con un solo carril grande para la primera dimensión BN-PAGE carril, un carril normal para el marcador de peso molecular, y uno de los carriles regulares de una alícuota del lisado dializado que ha ha mezclado con tampón de muestra SDS (receta 11) y se hierve durante 5 min a 95 ° C. Utilice espaciadores cuyo espesor se incrementó en dos capas de cinta adhesiva para simplificar la carga de la rebanada de gel BN-PAGE en el gel SDS.
  2. Quitar el gel, BN-PAGE en las placas del aparato de electroforesis y suavemente levante un plato.
  3. Quitar el gel de apilamiento y cortar el carril del gel BN-PAGE que contiene las proteínas de interés.
  4. Coloque la rebanada de gel BN-PAGE en tampón de muestra 2x SDS y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente.
  5. Hervir el gel brevemente BN-PAGE parte (no más de 20 segundos) en un horno de microondas.
  6. Incubar la rebanada de gel de BN-PAGE en el tampón de muestra SDS caliente para otros 15 minutos a temperatura ambiente.
  7. Cargar la rebanada de gel de BN-PAGE en el amplio y bien sobre el gel de apilamiento de las burbujas de gel SDS-PAGE de aire para evitar, y la superposición de la rebanada con tampón de muestra SDS. Cargar el marcador y el control de lisado.
  8. Realice la electroforesis de acuerdo a los protocolos estándar.

5. Detección de las subunidades de MPC por inmunotransferencia

  1. Para la transferencia, elaborar seis documentos Whatman y una membrana de PVDF apropiado para el tamaño de la SDS-gel.
  2. Incubar la membrana de PVDF en el 100% de metanol durante 30 s, y empape los papeles Whatman en tampón de transferencia (receta 16).
  3. Coloque tres Whatman papeles, la membrana de PVDF, el SDS-gel (gel de apilamiento eliminar), y de nuevo tres papeles Whatman en una estructura de sándwich en una celda de transferencia semiseco.
  4. Aplicar 20 V por 25 min.
  5. Detectar las proteínas de acuerdo a los protocolos estándar de inmunotransferencia.

6. Resultados representante

Se presenta el análisis de los eucariotas 19S, 20S, 26S y proteasomas como un ejemplo para la caracterización de MPC por BN 2D / SDS-PAGE (Figura 1). HEK293 células fueron lisadas con un tampón que contiene 0,1% de Triton X-100 como un detergente para romper las membranas y solubilizar complejos de proteínas de membrana. Estos lisados ​​fueron dializados contra buffer BN-diálisis para eliminar las sales y metabolitos pequeños. Entonces, los países socios mediterráneos se separaron por gradiente de 4-15% BN-PAGE seguida de una segunda dimensión SDS-PAGE. Las proteínas se visualizaron mediante inmunotransferencia con anticuerpos contra las subunidades β2 y Mcp21 del proteasoma 20S.

Figura 1
Figura 1. Una de dos dimensiones BN-PAGE/SDS-PAGE enfoque utilizando lisados ​​celulares. (A) Diagrama de flujo de un enfoque BN-PAGE/SDS-PAGE 2D a partir de lisados ​​celulares. (B) Esquema de un plan de BN-PAGE/SDS-PAGE 2D. Las proteínas y los socios mediterráneos se encuentran separados en condiciones nativas por BN-PAGE en una primera dimensión. Para la segunda dimensión, las proteínas y / o PSM se desnaturalizan por SDS en la franja de gel después de la separación por BN-PAGE y posteriormente sometido a SDS-PAGE. Proteínas monoméricas migrarán en un debido hiperbólica diagonal al gel de gradiente en la primera y un gel lineal en la segunda dimensión. Componentes de un concreto MPC se encuentra debajo de la diagonal, que se encuentra en una línea vertical.

Se ha demostrado que mediante la combinación de la primera dimensión de BN y segunda dimensión SDS-PAGE, las proteínas monoméricas migrar dentro de una diagonal hiperbólico, debido a que el gel de gradiente en el primero y el gel lineal en la segunda dimensión ((Camacho-Carvajal, Wollscheid et al 2004);. fig. 1B). Componentes de los PSM se encuentra por debajo de esta diagonal. Proteínas que representan las subunidades de la misma MPC se pueden encontrar en una línea vertical en la segunda dimensión, mientras que varios puntos de la misma proteína en una línea horizontal indican la presencia de la proteína en varios PSM distinto. La figura 2 muestra que en nuestro experimento de inmunotransferencia contra β2 y Mcp21 reveló la presencia de complejos de proteínas específicas que contienen estas subunidades proteasomal. Ambas proteínas se detectaron como puntos individuales dispuestos en una línea horizontal, lo que indica que β2 y Mcp21 representan componentes de varios PSM distinto. Estos PSM podría ser claramente identificado como el proteasoma 26S (20S, más tapa 19S), el proteasoma 20S, junto con la subunidad reguladora PA28, y el 20S proteasoma solo, sobre la base de su tamaño y composición. En conjunto, estos results demostrar que los países socios mediterráneos endógena puede ser identificado y caracterizado por un enfoque BN-PAGE/SDS-PAGE de dos dimensiones utilizando lisado celular. Este método es aplicable para la determinación del tamaño, composición y abundancia relativa de los países socios mediterráneos.

Figura 2
Figura 2. La detección de las diferentes formas de la proteasoma eucariotas por inmunotransferencia después de dos dimensiones BN-PAGE/SDS-PAGE. Para la identificación y el análisis de los proteasomas eucariotas, HEK293 células fueron lisadas con 0,1% Triton X-100. Lisados ​​celulares fueron dializados y posteriormente sometido a BN-PAGE (15.4%) de los países socios mediterráneos por separado. Posteriormente, una segunda dimensión SDS-PAGE (10%) se realizó para la separación de tamaño de subcomponentes individuales. Immunoblotting se realizó con anticuerpos específicos y el reconocimiento de la Mcp21 β2 subunidad del complejo núcleo 20S y la subunidad reguladora PA28.

I. Tabla de reactivos específicos (por orden alfabético):

Reactivo Empresa Comentarios
6-aminohexanoico
(Ε-aminocaproico)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania Este producto químico es un irritante y deben ser manejados con guantes.
Acrilamida-bisacrilamida solución (40%), mezcla de 32:1 Applichem, Darmstadt, Alemania Esta solución es neurotóxico y deben ser manejados con guantes.
Bis-tris Roth, Karlsruhe, Germa-ny
Brij 96 Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania
Azul de Coomassie G250 Serva, Heidelberg, Ale-mania No sustituyen otros tipos de Coomassie colorante como azul de Coomassie R250 o coloidal azules Coo-Massie.
Digitonina Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania Digitonina es tóxico. Se deben usar guantes al manipular tampones o las muestras que contienen este detergente.
Dodecylmaltoside Applichem, Darmstadt, Alemania
Triton X-100 Roth, Karlsruhe, Germa-ny Triton X-100 es tóxico. Se deben usar guantes al manipular tampones o las muestras que contienen este detergente.

II. Tabla de materiales y equipos específicos:

Equipo Empresa
Membranas de diálisis (peso molecular de corte de 10 a 50 kD) Roth, Karlsruhe, Alemania
Gel sistema de electroforesis Por ejemplo, de Bio-Rad, Munich, Alemania
Gradiente de mezcla Propio o disponible en el mercado de Bio-Rad, Munich, Alemania
Bomba peristáltica Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania
Difluoruro de polivinilideno (PVDF) membrana Immobilon-P, Millipore, Eschborn, Alemania
Semi-seco de transferencia de equipos Por ejemplo, de Bio-Rad, Munich, Alemania
Tubos de silicona (3 a 5 mm de diámetro, 1 m de longitud) NeoLab, Heidelberg, Alemania

III. Tabla de recetas:

No. Tampones y soluciones Contenido Comentarios
1 De buffer fosfato salino (PBS) Na 2 HPO 4 8.1 mMKH 2
PO 4 1.5 mM
NaCl 138 mM
KCl 2,7 mM
Solución debe ser un pH de 7,4, si preparados adecuadamente.
2 BN-Tampón de lisis Base de búfer
Bis-Tris 20 mM
ε-aminocaproico 500 mM
NaCl 20 mM
EDTA, pH 8,0 2 mM
Glicerol al 10%

Ajustar el pH a 7.0 con HCl. Almacenar a 4 ° C.

Detergente
Digitonina 0,5 a 1,0%
o Brij 96 0,1 al 0,5%
o Triton X-100 0,1 al 0,5%
o Dodecylmaltoside 0,1 al 0,5%

De la proteasa y los inhibidores de la fosfatasa
Aprotinina 10 mg / ml
Leupeptina 10 ug / mL
PMSF 1 mM
Fluoruro de sodio al 0,5 mM
Ortovanadato de sodio 0,5 mM
El detergente adecuado debe ser determinada empíricamente y debe ser el mismo que el utilizado en las recetas buffer de lisis otros.

Digitonina hay que añadir inmediatamente antes del uso de una solución de reserva del 2% en dH 2 O (tienda en 5 ml alícuotas a -20 ° C).

De la proteasa y fosfatasa inhibir los alcaldes hay que añadir inmediatamente antes del uso.

Tras la adición de sodio orthova-nadate, el buffer será de color amarillento.
3 BN-diálisis Buffer Base de búfer
Bis-Tris 20 mM
ε-aminocaproico 500 mM
NaCl 20 mM
EDTA, pH 8,0 2 mM
Glicerol al 10%

Ajustar el pH a 7.0 con HCl. Almacenar a 4 ° C.

Detergente
Digitonina 0,3 a 0,5%
o Triton X-100 0,1%
o Brij 96 0,1%
o Dodecylmaltoside 0,1%

De la proteasa y los inhibidores de la fosfatasa
PMSF 1 mM
Ortovanadato de sodio 0,5 mM
El detergente adecuado debe ser determinada empíricamente y debe ser la misma que la utilizada en los buffers de lisis, pero a la menor indicó concentraciones.

Detergente se debe agregar a prevenir la agregación en el paso de electroforesis en gel de apilamiento.

De la proteasa y fosfatasa inhibir los alcaldes hay que añadir inmediatamente antes del uso.
4 3x BN-Gel Buffer Bis-Tris 150 mM
ε-aminocaproico 200 mM

Ajustar el pH a 7.0 con HCl. Almacenar a 4 ° C.
5 4% gel separador 3x BN-Gel Buffer (receta 4) 5,00 ml
Acrilamida / bisacrilamida 1,50 ml
dH 2 O 8,50 ml
APS, 10% en dH 2 O 54 l
TEMED 5,4 l
Añadir APS y TEMED inmediata-tely antes de verter en gel, ya que estos reactivos promover la polimerización.

Esta receta es suficiente para poner en un gel de 30 ml. Ajuste el volumen para el número y tamaño de los geles que se vierte.
6 15% de gel separador 3x BN-Gel Buffer (receta 4) 5,00 ml
Acrilamida / bisacrilamida 5,63 ml
Glicerol 70% 4,38 ml
APS, 10% en dH 2 O 42 l
TEMED 4,2 l
Añadir APS y TEMED inmediata-tely antes de verter en gel, ya que estos reactivos promover la polimerización.

Esta receta es suficiente para poner en un gel de 30 ml. Ajuste el volumen para el número y tamaño de los geles que se vierte.

La concentración de acrilamida-bisacrilamida también puede variar según sea necesario 10 a 18%.
7 3,2% gel de apilamiento 3x BN-gel buffer (receta 4) 3,00 ml
Acrilamida / bisacrilamida 0,72 ml
dH 2 O 5,28 ml
APS, 10% en dH 2 O 120 l
TEMED 12 l
Añadir APS y TEMED inmediata-tely antes de verter en gel, ya que estos reactivos promover la polimerización.

Esta receta es suficiente para poner en un gel de 30 ml. Ajuste el volumen para el número y tamaño de los geles que se vierte.
8 Cátodo Buffer Bis-Tris 15 mM
Tricina 50 mM
Azul de Coomassie G250 0,02%

Preparar un litro como una acción de 10x, ajustar el pH a 7.0 con HCl y se almacenan a 4 ° C.
Diluir 1:10 con dH 2 O antes de su uso.
No sustituyen otros tipos de Coomassie colorante como azul de Coomassie R250 o coloidal azul Coomassie.
9 Buffer ánodo Bis-Tris 50 mM

Preparar un litro como una acción de 10x, ajustar el pH a 7.0 con HCl y se almacenan a 4 ° C.
Diluir 1:10 con dH 2 O antes de su uso.
10 Marcador Mix Aldolasa (158 kD) 10 mg / ml
Catalasa (232 kDa) 10 mg / ml
Ferritina (440 y 880 kD) 10 mg / ml
Tiroglobulina (670 kD) 10 mg / ml
BSA (66 y 132 kD) 10 mg / ml
Bis-Tris 20 mM
NaCl 20 mM
Glicerol al 10%

Ajustar el pH a 7.0 con HCl. Almacenar a 4 ° C.
Marcadores de peso molecular también están disponibles comercialmente a partir de varias fuentes, incluyendo Invitro-gen o Pharmacia.
11 SDS muestra de amortiguación Tris 12,5 mM
SDS al 4%
20% de glicerol
Azul de bromofenol 0,02%

Ajustar el pH a 6.8. Para reducir los puentes disulfuro, añadir 9 ml β-mercaptoetanol.
SDS en forma de polvo y β-mer captoethanol son tóxicos. Por lo tanto, usar guantes y trabajar bajo una campana.
12 Buffer 4 veces menor Tris 1,5 M
SDS 0,4%

Ajustar el pH a 8.8.
SDS en forma de polvo es tóxico. Por lo tanto, usar guantes y trabajar bajo una campana.
13 Amortiguación superior 4x Tris 0,5 M
SDS 0,4%

Ajustar el pH a 6.8.
SDS en forma de polvo es tóxico. Por lo tanto, usar guantes y trabajar bajo una campana.
14 10% de gel separador Acrilamida (30%) 2,0 ml
4x buffer del 1,5 mL
dH 2 O 2,454 ml
APS, 10% en dH 2 O 40 l
TEMED 6 l
Añadir APS y TEMED inmediata-tely antes de verter en gel, ya que estos reactivos promover la polimerización.

Esta receta es suficiente para poner en un gel de 30 ml. Ajuste el volumen para el número y tamaño de los geles que se vierte.
15 4,8% gel de apilamiento Acylamide (30%) 320 l
4x amortiguación superior 500 l
dH 2 O 1,16 ml
APS, 10% en dH 2 O 20 l
TEMED 2 l
Añadir APS y TEMED inmediata-tely antes de verter en gel, ya que estos reactivos promover la polimerización.

Esta receta es suficiente para poner en un gel de 30 ml. Ajuste el volumen para el número y tamaño de los geles que se vierte.
16 Semiseco tampón de transferencia Tris 48 mM
Glicina 39 mM
Metanol al 20%
SDS 0,1%

Ajustar el volumen a 1 litro con dH 2 O. Conservar a temperatura ambiente.
SDS en forma de polvo y el metanol son tóxicos. Por lo tanto, usar guantes y trabajar bajo una campana.

Discussion

En este estudio, se describe el análisis de los países socios mediterráneos por BN-PAGE. Un enfoque en 2D se utiliza para separar los PSM primera virtud de las condiciones, y luego más que dividir en sus componentes individuales de una segunda dimensión SDS-PAGE.

Las muestras se preparan a partir de lisados ​​celulares. Para la solubilización de muchos países socios mediterráneos, un detergente apropiado que se necesita, que conserva la estructura de los complejos de proteínas. Aquí, nosotros usamos un 0,1% Triton X-100. Sin embargo, el detergente óptimo y su concentración adecuada tiene que ser determinada empíricamente para cada MPC. En el caso de Triton X-100, por ejemplo, se ha informado de que las bajas concentraciones de detergente permite la identificación de una forma dimérica de la F 1 F 0-ATPasa complejos (Arnold, Pfeiffer et al. 1998). Mayor Triton X-100 concentraciones, sin embargo, a la disociación del dímero y el correspondiente aumento de las monoméricas F 1 F 0-ATPasa complejo. Esto está en consonancia con uno de nuestros estudios anteriores, se nos muestran que el polivalente de células T complejo receptor (TCR) se conserva cuando se extrae con bajas concentraciones de Brij 96, mientras que el uso de una mayor concentración o de otro detergente llamado digitonina resultados en la extracción de monómero TCR (Schamel, Arechaga y cols. 2005). Detergentes de uso común que pueden ser probados incluyen digitonina (0,5 a 1%), Triton X-100 (0,1 a 0,5%), Brij 96 (de 0,1 a 0,5%), o dodecylmaltoside (0,1 a 0,5%). Estos reactivos son los detergentes no iónicos, que tienden a ser mejor para la estabilidad de MPC. Tenga en cuenta que el contacto con SDS y otros detergentes fuertes se debe evitar (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004).

Diálisis de los lisados ​​se requiere para lograr la separación MPC en un BN-gel (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al 2004).; (Heiss, Junkes et al 2005).. Parece que el ajuste de la concentración de sal o la eliminación de las impurezas de bajo peso molecular es crucial para alta resolución. Es de destacar que también las preparaciones de membrana y los PSM, que han sido inmunopurificados y posteriormente eluido de los anticuerpos, son adecuados para BN-PAGE (Swamy, Siegers et al. 2006). En ambos casos, las muestras no tienen que ser dializados para la separación de BN-PAGE, si la lisis de membrana o de elución se lleva a cabo en tampón BN-lisis.

Para la separación de proteínas por BN-PAGE, el colorante azul de Coomassie es necesario, que se une inespecíficamente a las proteínas y los cubre con las cargas negativas. De esta manera, azul de Coomassie permite la movilidad electroforética de las proteínas hacia el cátodo a un pH neutro (Schagger y von Jagow 1991); (Schagger, Cramer et al, 1994).. Además, azul de Coomassie impide la agregación de proteínas en el gel de apilamiento durante la electroforesis. BN-PAGE, Coomassie G250 tiene que ser usado en lugar de azul de Coomassie R250 o coloidal azul Coomassie.

Antes de ejecutar un BN-gel, es necesario garantizar que el porcentaje del gel se adapta al tamaño esperado de la MPC de interés. Prefabricados BN-geles con gradientes de diferentes tampones adecuados y están disponibles comercialmente a partir de Invitrogen (NativePAGE Novex Bis-Tris Gel System). Sin embargo, BN-geles también pueden prepararse usando un mezclador de gradiente, junto con una bomba persistaltic. Para garantizar un gradiente intacta, el líquido debe fluir constantemente durante el vaciado y las burbujas se debe evitar. Recomendamos la carga de las diluciones de muestras diferentes en el gel, porque la sobrecarga puede dar lugar a la precipitación de proteínas durante el proceso de electroforesis. Además, el BN-geles se debe ejecutar a 4 ° C para evitar la degradación de proteínas y para mantener el PSM intacto.

Después de BN-PAGE, la visualización de los PSM se puede lograr mediante la tinción de azul brillante de Coomassie, tinción de plata o inmunotransferencia. Las bandas de proteínas visualizados por tinción con Coomassie o plata son adecuados para su posterior análisis por espectrometría de masas (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). En el caso de inmunotransferencia, las condiciones de transferencia óptima de los países socios mediterráneos de interés tiene que ser determinada empíricamente. Tenga en cuenta que Coomassie azul también es transferido durante el secante de un BN-gel. Por lo tanto, el gel se incoloro después de la transferencia con éxito, mientras que la membrana va a ejercer un color azul. Además, es importante mencionar que no todos los anticuerpos primarios, que trabaja en la detección después de SDS-PAGE, es aplicable a inmunotransferencia en BN-PAGE. Puede ocurrir que los anticuerpos no reconocen la MPC de interés debido a su epítopo se oculta en la conformación nativa de las proteínas. Para superar este problema, es posible para desnaturalizar las proteínas dentro de la BN-gel antes de la transferencia al hervir el gel en tampón 1x breve muestra de SDS.

En nuestro ejemplo, que no tema el BN-gel directamente a la detección de bandas de proteínas. En su lugar, divide a la BN-PAGE de lisado separados por un segundo dimensien SDS-PAGE. En la segunda dimensión SDS-gel, proteínas monoméricas migrar dentro de una diagonal hiperbólico, debido a que el gel de gradiente en el primero y el gel lineal en la segunda dimensión (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Esto permite la fácil identificación de los países socios mediterráneos, ya que se localizan por debajo de esta hiperbólica diagonal. Subcomponentes de una distinta MPC se separan en una línea vertical en la segunda dimensión SDS-PAGE. Componentes que son constituyentes de los PSM dinstinct varios se pueden identificar en una línea horizontal en función del tamaño de la MPC. Sin embargo, hay que tener en cuenta que varios puntos de proteínas que aparecen en una línea vertical también podría formar parte de los complejos que migran por separado en la misma posición en BN-PAGE. La prueba final de que se encuentran en la misma MPC se puede obtener mediante un ensayo en gel a base de anticuerpos turno. En este ensayo, lisado celular se incuba con un anticuerpo contra una proteína representada por uno de los puntos identificados antes de la BN-PAGE. Esto se traduce en un cambio de todos los países socios mediterráneos que contienen esta proteína hacia una mayor masa molecular en la primera dimensión. Otras proteínas que son también una parte de estos países socios mediterráneos se someterán a este cambio de complejos específicos y por lo tanto fácil de identificar en la segunda dimensión SDS-gel.

No sólo la composición de los países socios mediterráneos pueden ser analizados por BN-PAGE, sino también la determinación de su estequiometría es posible (y Schamel Reth 2000); (Schamel 2001), (Swamy, Minguet y otros, 2007.). Para ello, un ensayo de NAMOS (nativo basado en anticuerpos movilidad cambio de ensayo) se puede realizar. Al igual que en el ensayo de gel a base de anticuerpos cambio, los lisados ​​celulares se incuban con anticuerpos monoclonales subunidad anticuerpos específicos. Esto conduce a la inducción de immunoshifts electroforética en los geles BN-, que permiten la inferencia de la medida del cambio en la estequiometría de los países socios mediterráneos

En conlusion, BN-PAGE es adecuado para la identificación de los países socios mediterráneos y la determinación de su tamaño, composición, así como la abundancia relativa. Realizado como un ensayo NAMOS, sino que también ofrece la posibilidad de determinar la estequiometría de una cierta MPC. Teniendo en cuenta su aplicabilidad general, esta técnica es una herramienta muy útil para la caracterización de los países socios mediterráneos (Dekker, Müller y otros, 1996.) (Wittig y Schagger 2008); (Wagner, Rehling y otros, 2009.) (Wittig y Schagger 2009) .

Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Damos las gracias a Michael Reth, Schagger Hermann, y Margarita Camacho-Carvajal de apoyo científico. Este trabajo fue financiado por FORSYS de la Bildung Bundesministerium fuer Forschung y de Alemania (BMBF), por el BIOS de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), y apoyado en parte por la Iniciativa de Excelencia de los Gobiernos de Alemania Federal y el Estado (GSC-4, Spemann Escuela de Posgrado ).

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Azul nativos electroforesis en gel de poliacrilamida (BN-PAGE) para el análisis de los complejos Multiproteinas de lisados ​​celulares
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Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates. J. Vis. Exp. (48), e2164, doi:10.3791/2164 (2011).More

Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates. J. Vis. Exp. (48), e2164, doi:10.3791/2164 (2011).

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