Summary
We zien hier dat epigenetische herprogrammering via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) kan worden gebruikt als een instrument om muismodellen te genereren met een vooraf bepaalde T-cel receptor (TCR) specifieke kenmerken. Deze transnuclear muizen drukken de overeenkomstige TCR uit hun endogene locus onder de controle van de endogene promotor.
Abstract
Lymfocyten, zoals T-cellen, ondergaan genetische V (D) J recombinatie, aan een receptor met een bepaalde specificiteit 1 te genereren. Muizen transgene voor een herschikte antigeen-specifieke T-cel receptor (TCR) is een onontbeerlijk instrument om de T-cel ontwikkeling en functie te bestuderen. Maar deze TCRs meestal geïsoleerd van de relevante T-cellen na een lange-termijn cultuur vaak na herhaalde antigen stimulatie, die onvermijdelijk selecteert voor T-cellen met hoge affiniteit. Willekeurige genomische integratie van de TCR α-en β-keten en de expressie van niet-endogene promotors kunnen leiden tot verschillen in expressie niveau en de kinetiek.
Epigenetische herprogrammering via somatische celkerntransplantatie is een hulpmiddel om embryonale stamcellen en muizen uit een cel van belang te genereren. Bijgevolg, wanneer SCNT wordt toegepast op T-cellen van bekende specificiteit, zijn deze genetische V (D) J herschikkingen overgebracht naar het SCNT-embryonale stamcellen (SER) en de muizen zijn afgeleid van hen, terwijl de epigenetische markeringen worden gereset. We hebben aangetoond dat T-cellen met vooraf gedefinieerde specificiteit tegen Toxoplasma gondii kan worden gebruikt om muismodellen dat de specifieke TCR uiten van hun endogene loci, zonder experimenteel geïntroduceerde genetische modificatie te genereren. Het relatieve gemak en de snelheid waarmee dergelijke transnuclear modellen kunnen worden verkregen houdt belofte voor de bouw van andere ziekte-modellen.
Protocol
Deze methode werd gebruikt in het onderzoek gerapporteerd in Kirak et al.., Science 328 (5975), 243-248 (2010) .
1. Isolatie van donorcellen
Voor specifieke T-of B-cellen kan worden gebruikt als donor cellen om transnuclear muismodellen genereren muizen moeten worden besmet met een ziekteverwekker van belang of geïmmuniseerd met een antigeen van belang. Aangezien wij gebruik hebben gemaakt van CD8 + cellen die specifiek zijn voor Toxoplasma gondii, zal het volgende protocol beschrijft de generatie en het isolement van deze cellen en moet worden aangepast aan persoonlijke interesse.
- Cysten afgeleid van een muis hersenhomogenaat (ongeveer 40) worden geïnjecteerd intra-peritoneaal in BL / 6 x Balb / c F1 (B6CF1) muizen, die isolatie van zowel H-2 b en H-2 d beperkte CD8 + T-cellen mogelijk maakt.
- Op het hoogtepunt van de immuunrespons, de geïnfecteerde muis is gedood, de milt geïsoleerd en geplaatst in een schotel met 6 ml rode bloedcellen (RBC) lysis buffer.
- Met behulp van de matte zijkanten van twee dekken dia's, is de milt zorgvuldig grond en geïncubeerd in het RBC-lysis buffer voor 5 min bij RT.
- Voeg 14 ml PBS, filter de celsuspensie door middel van een cel-zeef (40 of 70 micrometer) in een 50 ml Falcon buis en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300g.
- Supernatant te verwijderen, resuspendeer de cel pellet in 1 ml PBS en breng in een 1,5 ml Eppendorf buis. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300g en daarna verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de cel pellet in 50 ul PBS, voeg fluorescent gelabelde antilichamen tegen het celtype van belang (bijvoorbeeld CD3, B220, CD8 en CD4) te identificeren, en fluorescent gelabelde MHC-I tetrameer (MHC-II tetrameer voor de CD4 T-cellen) geladen met het peptide van belang zijn voor de celsuspensie en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
- Voeg 1 ml PBS, centrifugeer 5 minuten bij 300 g, hersuspenderen pellet in 3 ml PBS, en filter de celsuspensie door middel van een cel-zeef (40 of 70 micrometer) in een buis.
- Voer FACSorting door het instellen van de poorten streng (Figuur 1B).
2. Somatic Cell Nuclear Transfer
Er zijn een paar protocollen voor Somatic Cell Nuclear Transfer. De hier beschreven wordt gebruik gemaakt van eicellen gearresteerd op metafase-II en de remming van de tweede meiotische deling met behulp van cytochalasine B. Daarom donor cellen nodig zijn die in G0/G1 fase.
- Voorbereiding van de eicellen
- Vrouwelijke muizen van BDF1 achtergrond zijn geïnjecteerd intra-peritoneaal met 5IU PMS per muis zeventien-negentien.
- Ongeveer 47 uur later, is elke muis geïnjecteerd intra-peritoneaal met 5IU HCG.
- Bereid een cultuur schotel (KSOM-AA druppels onder olie) voor de eicellen op dezelfde dag als de HCG injectie en ze in een incubator 37 plek ° C, 5% CO 2. Ook de voorbereiding van de naalden die noodzakelijk zijn voor SCNT (7μm voor enucleatie en 4 of 5 urn voor nucleaire transfer van lymfocyten kernen) door ze met kwik.
- Euthanaseren muizen en isoleren eileiders ongeveer 13u na de HCG (ongeveer 8u). Verzamel de eileiders in 1-2 druppels HCZB.
- Een voor een gaan de eileiders in een daling met M2 w / Hyaluronidase. Nick de eileider voorzichtig met een pincet en zet de eicel-cumulus-complex in de drop. Nadat alle eicel-cumulus-complexen zijn geïsoleerd, de schotel wordt geïncubeerd bij 37 ° C.
- Na 2-5 minuten (de exacte tijd hangt af van de partij Hyaluronidase) het verzamelen van de eicellen, wassen in HCZB en plaat ze in KSOM-AA druppels.
- Enucleatie van eicellen
- Gebruik het deksel van een petrischaaltje de SCNT plaat voor te bereiden. Stel de microscoop en de micromanipulator.
- Was de naald enucleatie (7 micrometer) in PVP alvorens te beginnen met enucleatie.
- Voor enucleatie, plaats een groep van eicellen (10-30) in een druppel HZCB met cytochalasine B (5 ug / ml). Terwijl de incubatie (min. 5 min) line-up van de eicellen horizontaal.
- Neem een eicel en plaats deze in de voorkant van de holding naald. Bevestig de eicel naar de holding naald door het toepassen van een vacuüm. Met behulp van de enucleatie naald, draai de eicel tot de chromosoom-spindel-complex (CSC, ook wel de "kern") is in de drie positie.
- Met behulp van piëzo-puls zorgvuldig doordringen in de zona pellucida zonder beschadiging van de eicel. Plaats de opening van de naald naast de metafase-II-as en de toe te passen vacuüm. De "kern" moet langzaam bewegen in de naald, en het membraan moeten zegel zelf zodra deze is volledig verwijderd.
- Zet het enucleated eicellen in de KSOM-AA drops, en was ze meerdere keren. Herhaal de enucleatie stappen met een nieuwe groep van eicellen. Ga door totdat alle eieren zijn enucleated of tot ongeveer 11 uur.
- Nuclear Transfer
- Voor de nucleaire transfer, wisselen de naald enucleatie (7 micrometer) met een nucleaire overloopnaald (4 of 5 micrometer) en was het met PVP.
- Plaats uw cellen van belang (bijvoorbeeld CD8 + T-cellen) in een druppel met PVP, meng goed en incubeer een minimum van 10 minuten.
- Plaats een groep van enucleated eicellen (10-30) in een druppel HCZB met cytochalasine B (2,5 ug / ml). Terwijl de incubatie (min. 5 min) line-up eicellen horizontaal met behulp van de nucleaire overloopnaald.
- Pick-up een donor cel van de PVP-celsuspensie en zuig het in-en-uit tot het buitenste membraan onklaar is geraakt (fragmenten van het membraan en cytosol zichtbaar moeten zijn). Indien nodig een piëzo-puls kan worden toegepast. Zodra een kern is geïsoleerd, beweeg het een beetje in de naald, en verder op te halen kernen tot je 10-30.
- Ga naar de druppel die de lijn enucleated eicellen. Fix een eicel van de holding naald door het toepassen van vacuüm. Plaats de nucleaire overdracht naald (de kernen uit de buurt van de opening), grenzend aan de zona pellucida en piëzo-puls totdat de naald is gegaan door de zona pellucida van toepassing zijn. Voorzichtig bewegen een kern naar het punt van de naald, steek de naald in de eicel tot aan de punt van de naald is 2 / 3 binnen. Breng een kleine onderdruk, zodat er een beetje van de eicel membraan wordt in de naald.
- De volgende stap is zeer kritisch, want het is het enige moment waarop de eicel is eigenlijk "open". Breng een enkele puls met piezo, duw de kern uit van de naald door het toepassen van positieve druk, trek de naald terug, zodat de top is ongeveer 1 / 3 in de eicel, en vervolgens toe te passen negatieve druk en blijven terug te trekken van de naald verzegeling van de eicel. Herhaal deze stap bij elke eicel.
- Nadat alle eicellen van een groep hebben een kern, worden ze gewassen en gekweekt in KSOM-AA media. Herhaal deze procedure met alle eicellen.
- Nadat de laatste groep is culturen in KSOM-AA voor een minimum van 30 min, zijn de SCNT-embryo's overgebracht in druppels van Ca-gratis activering media met SrCl2.
- Na 6 uur van de activering, is de hoeveelheid pseudo-pronuclei (PPN)-positieve SCNT-embryo's bepaald. De embryo's worden vervolgens gewassen en gekweekt in KSOM-AA druppels voor extra 3,5 dagen tot het bereiken van de blastocyst stadium.
- Drugs of chemische producten naar keuze (zoals trichostatine A) kan worden toegevoegd aan de activering en cultuur media.
3.Derivation van embryonale stamcellen
De SCNT-blastocysten kan worden gebruikt om te zetten in pseudo-zwangere vrouwen (ook bekend als direct of in een stap klonen) of af te leiden embryonale stamcellen (ook bekend als indirecte of in twee stappen klonen). Want het is veel efficiënter om ES cellen te genereren, kiezen we de twee-staps procedure. In het geval dat de wetenschapper geïnteresseerd is in de directe klonen, kan de blastocysten direct worden omgezet in pseudo-drachtige vrouwtjes zoals beschreven in paragraaf 5.
Er zijn veel protocollen beschrijven de winning van embryonale stamcellen. De hier beschreven is een standaard techniek, die feeder cellen en foetaal kalf serum gebruikt.
- De tweede dag na de nucleaire transfer, bereiden een 96-U-wells plaat voor ES-cel afleiding.
- Voeg 100 ul Gelatine in elke well van een 96-U-well plaat, incubeer voor een minimum van 10 minuten, en daarna te verwijderen.
- Dooi feeder-cellen en resuspendeer in een volgens volume van ESD medium, bijvoorbeeld feeder cellen gelijk aan een oppervlakte van 25 cm 2 worden opnieuw gesuspendeerd in 10 ml ESD medium en 200 pi van de celsuspensie wordt toegevoegd aan elk van de gelatine-behandelde goed.
- Zet de plaat in een couveuse en de cultuur bij 37 ° C, 5% CO 2.
- Na 3,5 dag, moet de embryo's in het blastocyst stadium.
- Bereid een steriele bacteriële gerecht door uitplating een paar druppels ES-cel-medium en zure thyrode.
- De blastocysten worden eerst overgedragen van de KSOM-AA druppels in druppels met normale ES-cel-medium en tweemaal gewassen.
- Breng voorzichtig een groep van blastocysten (5-10 blastocysten) in een druppel zuur thyrode en blijf daar totdat de zona pellucida is opgelost.
- De blastocysten worden dan overgebracht naar een druppel met ES medium, twee keer gewassen en vervolgens geplaatst in de feeder-gecoate 96-U-well plaat (een blastocyst tot een goed).
- De embryo's worden vervolgens gekweekt gedurende 5-7 dagen in een incubator bij 37 ° C, 5% CO 2 zonder ze te storen. Dit geeft het embryo de tijd om eenttach aan de feeder-laag, en een uitgroei te vormen.
- Bereid 24-well platen, door uitplating feeders in ESD medium in elk putje, bijvoorbeeld Resuspendeer een equivalent van 50 cm 2 feeder in 12 ml ESD medium, en voeg 500 pi van de celsuspensie in elk putje.
- Voorzichtig de ESD medium uit de 96-U-wells plaat met de embryo's, twee keer wassen elk putje met 250 pi Hepes (of PBS), voeg 50 ul trypsine en incubeer gedurende ongeveer 5 min op 37 ° C.
- Pipet op en neer meerdere malen, totdat uitgroei is gedaald uiteen in een single-celsuspensie, over in een 24-well plaat en incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2.
- Als ESC afleiding is gelukt, moet ESC kolonies zichtbaar zijn na 7-10 dagen.
4.Blastocyst injectie
De injectie van blastocysten is een routine techniek om elke vorm van transgene muismodel te genereren. Het is belangrijk te vermelden dat de injectie van blastocysten en de daaropvolgende overdracht naar pseudo-zwangere vrouwen moet goed worden getimed.
- Prime vrouwelijke muizen met PMS en HCG zoals beschreven in paragraaf 2.1. Na de HCG injectie gezet vrouwelijke muizen, samen met mannelijke muizen (een vrouwelijke en een mannelijke muizen per kooi).
- De volgende dag, controleer dan vrouwtjes voor stekkers. Dit wordt geteld als 0.5dpc (dag na de coïtus).
- Bevruchte embryo's worden dan gescheiden van de eileider, zoals beschreven in paragraaf 2.1, en gekweekt in KSOM-AA voor extra 3 dagen.
- Bereid ES-cellen op de dag van blastocyst injectie (3.5dpc).
- Verwijderen medium van ES-cellen, tweemaal wassen met Hepes (of PBS), voeg trypsine en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
- Resuspendeer getrypsiniseerd cellen met ES medium, plaat in een schotel, en incubeer 45-60 min. bij 37 ° C, 5% CO 2 tot het bedrag van de feeder-cellen (feeder-cellen hechten sneller dan de ES-cellen) te verminderen.
- Breng de celsuspensie door middel van een cel-zeef (40 of 70 micrometer) in een buis, en centrifugeer gedurende 5 min bij 1000 tpm.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof, hersuspenderen cel pellet in 500 ui ES medium en op te slaan op ijs totdat het nodig is.
- Bereid het deksel van een steriele bacteriële gerecht door uitplating druppels met PVP en HCZB.
- Bereid een 15 um naald door het laden van met kwik, waardoor het op zijn plaats en wassen met PVP.
- Plaats een groep van blastocysten (10-30 blastocysten) in een druppel met HCZB, en voeg 50-50 uL ES celsuspensie (afhankelijk van de concentratie) in een andere druppel HCZB.
- Pick-up ES-cellen (50-100 cellen) met de injectienaald.
- Ga naar de druppel met de blastocysten. Horizontaal uitlijnen van de blastocysten, en bevestig een naald met het bedrijf door het toepassen van vacuüm.
- Met behulp van de injectienaald draai de blastocyst totdat de binnenste celmassa (ICM) is op de 9 uur positie.
- Plaats uw injectienaald om 3 uur, zorg ervoor dat er geen ES-cellen aan het uiteinde van de naald, en toe te passen piëzo-puls tot de injectienaald dringt door de zona pellucida en de trophectoderm in de blastocoel.
- Laat een paar ES-cellen (5-15 cellen), zodat de ES-cellen vasthouden aan de ICM. Ga door totdat alle blastocysten van een groep zijn geïnjecteerd met ES-cellen.
- Na een groep van blastocysten klaar is, twee keer was ze in KSOM-AA en bewaar ze op een daling met KSOM-AA tot alle blastocysten worden geïnjecteerd.
5. Embryo Transfer
De overdracht van embryo's in pseudo-zwangere vrouwen is een chirurgische ingreep, die moet worden uitgevoerd zeer zorgvuldig en volgens de richtlijnen van instituut van de onderzoeker.
- Verdoof vrouwelijke ontvangende muizen, scheren rechtsonder kwadrant, en ontsmet.
- Met een schaar open de huid en scheiden het buikvlies van de huid.
- Zoek de eierstok via het buikvlies (rode vlek), en open het buikvlies in de nabijheid van de eierstok.
- Met behulp van een tang voorzichtig pak de eileider en trek de baarmoeder.
- Pick-up een groep van ongeveer 10 blastocysten met een capillair verbonden met een mond pipet.
- Bevestig de baarmoeder met een tang, stoot een klein geheel in het met een kleine naald, en steek de capillair met de blastocysten in het lumen van de baarmoeder.
- Voorzichtig laat de embryo in de baarmoeder, en verwijder uw capillair.
- Terug te duwen de baarmoeder in de buikholte.
- Zoek de randen van het buikvlies en sluit deze met een paar steken.
- Sluit de huid van de muis met een paar nietjes.
- Voor post-operatieve pijn, beheren 5 pg Carprofen per mg van het lichaamsgewicht.
Figuur 1. Somatische celkerntransplantatiede overdracht van vooraf gedefinieerde T-cellen in B6CF1 achtergrond. Absolute en relatieve aantallen van embryo's gegenereerd op basis van CD8 + T-cellen en embryonale stamcellen afgeleid van SCNT blastocysten.
Figuur 2. Vertegenwoordiger flowcytometrische analyse van chimère muizen geïnjecteerd met SCNT embryonale stamcellen. Gate en nummer (procent per totaal CD8 + T-cellen) duidt op de aanwezigheid van specifieke CD8 + T-cellen in chimère muizen.
Discussion
We hebben hier laten zien dat SCNT gebruikt kan worden om transnuclear muizen van T-cellen met vooraf gedefinieerde specificiteit te genereren. Hoewel het hier niet getoond, moet de techniek ook gebruikt kunnen worden om transnuclear muizen genereren uit B-cellen met vooraf gedefinieerde specificiteit.
Een belangrijk ding om te overwegen is de stam en het geslacht van de muis, die besmet is of geïmmuniseerd en wordt gebruikt om T-of B-cellen van belang te isoleren. Omdat T-en B-cellen hebben een zeer lage herprogrammering efficiëntie in het algemeen, raden we met behulp van F1-hybriden van de gewenste haplotype. Omdat de donor cel bepaalt ook het geslacht, raden wij het gebruik T-of B-cellen van mannelijke muizen. Dit houdt in dat alleen mannelijke chimere muizen zou de TCR of BCR verstuurt via de kiembaan, met mannelijke muizen worden eenvoudiger en sneller om te broeden.
Bij elkaar genomen, denken we dat epigenetische herprogrammering via SCNT is een krachtig hulpmiddel om een nieuw type muis modellen, die zal van groot voordeel voor de immunologische veld te genereren.
Disclosures
Een octrooi is ingediend.
Acknowledgments
De auteurs zijn dankbaar voor H. Eisen, M. Gubbels, K. van Grinsven, E. Guillen, A. Drake, V. Mahajan, Q. Gao, en G. Yap voor vruchtbare discussies en reagentia. Wij zijn dankbaar voor J. Dausman, R. Flannery, en J. Jackson voor hulp bij het beheer van de muis kolonie. Wij zijn dankbaar voor P. Wisniewski voor FACSorting. EMF werd ondersteund door de Human Frontiers Science Program. RJ werd ondersteund door het National Institute of Health beurzen RO1-HD045022 en R37-CA084198. HLP werd ondersteund door subsidies van de National Institute of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red Blood Cell lysis Buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | REF 352340 | |
| Pregnant Mare Serum (PMS) | Calbiochem | 367222 | |
| Human Chorionic Gonadotropin (HCG) | Calbiochem | 230734 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | Type IV-S |
| KSOM-AA | EMD Millipore | MR-106-D | |
| HCZB | EMD Millipore | MR-173-D | Customized medium |
| Ca-free medium for activation | EMD Millipore | MR-174-D | Customized medium |
| SrCl2 | Sigma-Aldrich | 255521 | 100mM = 10x |
| AlbuMAX I | GIBCO, by Life Technologies | 11020-021 | |
| PVP | MP Biomedicals | 102787 | Make 10% solution using HCZB, and add 0.1% AlbuMAX I |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | 500μg/ml = 100x |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich | T8552 | 5mM = 1000x |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | |
| Holding needle | Humagen | MPH-SM-30 | |
| Injection and transfer needles | Humagen | 4-15, 7-15, 15-15 | |
| Mouth pipette | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | or something similar |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | or something similar |
| Wound Clip Applicator | BD Biosciences | 427630 | |
| Wound Clips | BD Biosciences | 427630 | |
| Suture | Ethicon Inc. | K871H | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | 15% |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza Inc. | 17-602E | 100x |
| Glutamin | MP Biomedicals | 101806 | 200mM = 100x |
| Non-essential Aminoacids | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | 100x |
| β-Mercapt–thanol | GIBCO, by Life Technologies | 21985-023 | 5μl in 500ml |
| LIF | EMD Millipore | ESG1106 | 1000x |
| MEK inhibitor | Cell Signaling Technology | 9900L | For ES derivation only, add to ES medium (final concentration 50μM) |
References
- Schatz, D. G. V(D)J recombination. Immunol. Rev. 200, 5-5 (2004).
- Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R., R, F. Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements. Immunol. Cell Biol. 76, 34-34 (1998).
- Eggan, K. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 6209-6209 (2001).
- Kishigami, S. Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer. Biochem Biophys Res Commun. 340, 183-183 (2006).
- Wakayama, T., Yanagimachi, R. Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type. Mol Reprod Dev. 58, 376-376 (2001).
