Summary
Demonstramos aqui que a reprogramação epigenética via transferência nuclear de células somáticas (TNCS) pode ser usado como uma ferramenta para gerar modelos de ratos com pré-definidos receptor de células T (TCR) especificidades. Estes ratos transnuclear expressar a TCR correspondente do seu lócus endógeno sob o controle do promotor endógeno.
Abstract
Linfócitos, como as células T, são submetidos a genética V (D) recombinação J, para gerar um receptor com uma certa especificidade 1. Camundongos transgênicos para um reorganizados antígeno-específica do receptor de células T (TCR) têm sido uma ferramenta indispensável para estudar o desenvolvimento de células T e função. No entanto, tais TCRs são geralmente isolados a partir de células T relevantes após longo período de cultura, muitas vezes após estimulação antigênica repetida, o que inevitavelmente seleciona para as células T com alta afinidade. Integração genômica aleatória da TCR α e β-corrente e de expressão de não-endógenos promotores podem levar a variações no nível de expressão e cinética.
Reprogramação epigenética via transferência nuclear de células somáticas fornece uma ferramenta para gerar células-tronco embrionárias e camundongos a partir de qualquer célula de interesse. Conseqüentemente, quando SCNT é aplicada às células T de especificidade conhecida, estes rearranjos genéticos V (D) J são transferidos para as células-tronco embrionárias SCNT (CES) e os ratos deles derivados, enquanto marcas epigenéticas são repostas. Nós demonstramos que as células T com pré-definidos especificidades contra o Toxoplasma gondii pode ser usado para gerar modelos de ratos que expressam o TCR específicas de seus loci endógena, sem experimentalmente introduziu modificação genética. A relativa facilidade e rapidez com que tais modelos transnuclear pode ser obtido é promissor para a construção de modelos de outras doenças.
Protocol
Este método foi utilizado na pesquisa, publicada na Kirak et al. Ciência 328 (5975), 243-248 (2010) .
1. Isolamento de células do doador
Antes T específicos ou células B podem ser usados como células do doador para gerar modelos de ratos transnuclear, ratos precisam ser infectado por um patógeno de interesse ou imunizados com um antígeno de interesse. Uma vez que temos utilizado células CD8 + específicas para Toxoplasma gondii, o protocolo a seguir irá descrever a geração eo isolamento dessas células e precisa ser adaptado de acordo com interesses pessoais.
- Cistos são derivados de um homogenato de cérebro de rato (cerca de 40) são injetados intra-peritoneally em BL / 6 x Balb / c F1 (B6CF1) camundongos, que permite o isolamento de ambos H-2 b e H-2 d restrito células T CD8 +.
- No pico da resposta imune, o rato infectado é sacrificados, o baço isolados e colocados em um prato contendo 6 mL de glóbulos vermelhos (RBC) tampão de lise.
- Usando os lados fosco de duas lâminas de cobertura, o baço é cuidadosamente chão e incubadas no tampão de lise RBC por 5 min à temperatura ambiente.
- Adicionar 14 mL PBS, filtrar a suspensão de células através de um filtro de células (40 ou 70 mm) em um tubo de 50 mL falcon e centrifugar por 5 min a 300g.
- Remover o sobrenadante, ressuspender o pellet celular em 1 mL de PBS e transferir para um tubo Eppendorf 1,5 mL. Centrifugar por 5 min em 300g e remover o sobrenadante depois.
- Ressuspender o pellet celular em 50 mL PBS, adicione anticorpos fluorescente etiquetado para identificar o tipo de células de interesse (por exemplo, CD3, B220, CD8 e CD4), e fluorescente etiquetado MHC-I tetrâmero (MHC-II tetrâmero de células CD4 T) carregados com o peptídeo de interesse para a suspensão de células e incubar por 30 min a 4 ° C.
- Adicionar 1 mL de PBS, centrifugue por 5 min a 300 g, ressuspender sedimento em 3 ml de PBS, e filtrar a suspensão de células através de um filtro de células (40 ou 70 mm) em um tubo.
- Executar FACSorting definindo as portas rigorosamente (Figura 1B).
2. Transferência nuclear de células somáticas
Existem alguns protocolos para somáticas. O aqui descrito faz uso de ovócitos preso em Metáfase II e da inibição da segunda divisão meiótica utilizando citocalasina B. Portanto células do doador são necessários que estão em fase G0/G1.
- Preparação de oócitos
- Camundongos fêmeas da BDF1 fundo são injetados intra-peritoneally com 5IU PMS rato por cinco horas - sete horas.
- Cerca de 47 horas depois, cada rato é injetado intra-peritoneally com HCG 5IU.
- Prepare um prato de cultura (KSOM-AA cai sob óleo) para os ovócitos no mesmo dia como a injeção de HCG e colocá-los em uma incubadora a 37 ° C, 5% CO 2. Além disso, preparar as agulhas necessárias para SCNT (7μm para enucleação e 4 ou 5m de transferência nuclear de núcleos de linfócitos) por carregá-los com mercúrio.
- Euthanize ratos e isolar ovidutos sobre 13h após HCG (aproximadamente 8:00). Recolher os ovidutos em 1-2 gotas de HCZB.
- Um por um movimento do oviduto em uma queda contendo M2 w / Hialuronidase. Nick oviduto a cuidadosamente com uma pinça e passar o oócito-cumulus complexo para a queda. Afinal oócito-cumulus complexos foram isolados, o prato é incubada a 37 ° C.
- Depois de 2-5 min (o tempo exato depende do lote de Hialuronidase) recolher os ovócitos, lave em HCZB e placa-los em KSOM-AA gotas.
- Enucleação de ovócitos
- Use a tampa de uma placa de Petri para preparar o prato TNCS. Configure o microscópio, e os micromanipulador.
- Lavar a agulha enucleação (7 mm) em PVP antes de começar com enucleação.
- Para enucleação, coloque um grupo de ovócitos (10-30) em uma gota de HZCB com citocalasina B (5 mg / mL). Durante a incubação (min. 5 min) line-up os oócitos horizontalmente.
- Tome um ovócito e colocá-lo na frente da agulha segurando. Fixar o óvulo para a agulha segurando pela aplicação de um vácuo. Utilizando a agulha de enucleação, por sua vez o ovócito até o cromossomo eixo complexas (CSC, muitas vezes chamado de "núcleo") está na posição de 3 horas.
- Usando piezo-pulso penetrar na zona pelúcida cuidadosamente, sem danificar o óvulo. Lugar a abertura da agulha adjacente ao fuso-Metáfase II e aplicar vácuo. O "núcleo" deve mover lentamente para dentro da agulha, ea membrana deve selar-se uma vez que é completamente removido.
- Transferir os oócitos enucleados de volta para as gotas KSOM-AA, e lavá-los várias vezes. E repetir oetapas de nucleação com um novo grupo de oócitos. Continue até que todos os ovos são enucleados ou até cerca de 11:00.
- Transferência Nuclear
- Para a transferência nuclear, troca a agulha enucleação (7 mm) com uma agulha de transferência nuclear (4 ou 5 mm) e lave-o com PVP.
- Coloque as suas células de interesse (por exemplo, células CD8 + T) em uma queda com PVP, misture bem e incubar por um mínimo de 10 min.
- Coloque um grupo de oócitos enucleados (10-30) em uma gota de HCZB com citocalasina B (2,5 mg / mL). Durante a incubação (min. 5 min) line-up oócitos na horizontal, utilizando a agulha de transferência nuclear.
- Pegar uma célula doadora da suspensão de células-PVP e aspire-lo em-e-out até a membrana externa foi quebrada (fragmentos da membrana e citoplasma deve ser visível). Se necessário, um piezo-pulso pode ser aplicada. Uma vez que um núcleo foi isolado, movê-lo um pouco acima na agulha, e continuar a pegar núcleos até que você tenha 10-30.
- Mover-se para a queda contendo os oócitos enucleados alinhados. Fix um ovócito para a agulha segurando pela aplicação de vácuo. Coloque a agulha de transferência nuclear (o núcleo deve ser longe da abertura) adjacente à zona pelúcida e aplicar piezo-pulse até que a agulha atravessou a zona pelúcida. Cuidadosamente mover um núcleo para a ponta da agulha, introduza a agulha do oócito até a ponta da agulha é 2 / 3 dentro. Aplique uma pequena pressão negativa, de modo que um pouco da membrana do oócito está na agulha.
- O próximo passo é muito importante, pois é o único momento em que o óvulo é realmente "aberto". Aplicar um único pulso de piezo, empurre o núcleo para fora da agulha através da aplicação de pressão positiva, cuidadosamente puxe a agulha para que a ponta é de cerca de 1 / 3 no ovócito, e em seguida, aplicar pressão negativa e continuar a puxar a agulha para selar o ovócito. Repita este passo com cada ovócito.
- Depois de todos os oócitos de um grupo ter recebido um núcleo, que são lavadas e cultivadas em KSOM-AA mídia. Repita este procedimento com todos os ovócitos.
- Após o último grupo foi culturas em KSOM-AA para um mínimo de 30 min, o SCNT-embriões são transferidos para gotas de mídia Ca-livre ativação contendo SrCl2.
- Após 6 horas de ativação, a quantidade de pseudo-pronúcleo (PPN)-positivo SCNT-embriões é determinada. Os embriões são, então, lavadas e cultivadas em KSOM-AA cai para 3,5 dias adicionais até que tenham alcançado o estágio de blastocisto.
- Drogas ou produtos químicos de escolha (como Tricostatina A) podem ser adicionados à ativação e meios de cultura.
3.Derivation de células-tronco embrionárias
Os blastocistos SCNT pode ser usado tanto para transferi-los para pseudo-grávida do sexo feminino (também conhecida como clonagem direta ou one-step) ou para derivar células-tronco embrionárias (também conhecida como clonagem indireta ou duas etapas). Uma vez que é muito mais eficiente para gerar células-tronco embrionárias, escolhemos o procedimento em duas etapas. No caso de o cientista está interessado na clonagem direta, a blastocistos podem ser transferidos diretamente para pseudo-grávida fêmeas, conforme descrito na seção 5.
Existem muitos protocolos descrevendo a derivação de células-tronco embrionárias. O aqui descrito é uma técnica padrão, que utiliza células alimentadoras e soro fetal bovino.
- O segundo dia após a transferência nuclear, preparar uma placa de 96-U-bem para a derivação de células ES.
- Adicionar 100 mL de gelatina em cada poço de uma placa de 96-U-bem, incubar por um mínimo de 10 min, e removê-lo depois.
- Descongelar células alimentador e ressuspender em um volume de meio de acordo ESD, por exemplo, células de alimentação equivalente a uma área de 25 cm 2 são ressuspenso em 10 ml de meio de ESD e 200 mL da suspensão de células é adicionado em cada uma das gelatina-bem tratados.
- Coloque a placa em uma incubadora e cultura a 37 ° C, 5% CO 2.
- Após 3,5 dias, os embriões devem estar no estágio de blastocisto.
- Prepare um prato estéril bactérias por plaqueamento algumas gotas médias de células ES e thyrode ácido.
- Os blastocistos são primeiro transferidos das gotas KSOM-AA em gotas contendo meio de célula normal ES e lavadas duas vezes.
- Transferir cuidadosamente um grupo de blastocistos (blastocistos 10/05) em uma gota de ácido thyrode e manter lá até que a zona pelúcida se dissolveu.
- Os blastocistos são então transferidos para uma gota com meio ES, lavados duas vezes, e em seguida colocado no alimentador revestido-96-U-bem placa (um blastocisto em um bem).
- Os embriões são então cultivadas por 5-7 dias em uma incubadora a 37 ° CO C, 5% 2 sem perturbá-los. Isto dá ao embrião a um tempottach para a camada de alimentação, e para formar uma conseqüência.
- Prepare placas de 24 poços, por alimentadores de chapeamento em meio ESD em todos os poços, por exemplo, ressuspender o equivalente a 50 alimentador cm 2 em 12 ml de meio de ESD, e adicionar 500 mL da suspensão de células em cada poço.
- Remova cuidadosamente o meio ESD da placa de 96-U-bem com os embriões, lavar cada cavidade duas vezes com 250 mL Hepes (ou PBS), adicionar 50 mL Tripsina e incubar por aproximadamente 5 min a 37 ° C.
- Pipeta cima e para baixo várias vezes, até que caiu distante conseqüência de uma suspensão de uma única célula de transferência em uma placa de 24 poços e incubar a 37 ° CO C, 5% 2.,
- Se derivação ESC foi bem-sucedida, colônias ESC deve ser visível após 7-10 dias.
Injeção 4.Blastocyst
A injeção de blastocistos é uma técnica de rotina para gerar qualquer tipo de modelo de camundongo transgênico. É importante mencionar que a injeção de blastocistos ea sua posterior transferência para pseudo-grávida fêmeas precisa ser cronometrado bem.
- Primeiro camundongos fêmeas com TPM e HCG como descrito na seção 2.1. Após a injeção de HCG colocar camundongos fêmeas, juntamente com os ratos do sexo masculino (um feminino e um masculino do rato por gaiola).
- No dia seguinte, verifique as fêmeas para plugues. Isso é contado como 0.5dpc (dias pós-coito).
- Embriões fertilizados são então isolados do oviduto conforme descrito na seção 2.1, e cultivadas em KSOM-AA para o adicional de 3 dias.
- Prepare células ES no dia da injeção de blastocisto (3.5dpc).
- Remova o meio de células-tronco embrionárias, lave duas vezes com Hepes (ou PBS), adicione Tripsina e incubar por 5 min a 37 ° C.
- Ressuspender as células tripsinizados com meio ES, placa em um prato, e incubar por 45-60 min a 37 ° C, 5% de CO 2 para reduzir a quantidade de células alimentadoras (feeder células aderem mais rapidamente do que as células ES).
- Transferir a suspensão celular através de um filtro de células (40 ou 70 mm) em um tubo, e centrifugar por 5 min a 1000 rpm.
- Remover o sobrenadante, ressuspender pellet celular em 500 mL de médio ES e armazenar no gelo até ser necessário.
- Prepare a tampa de um prato estéril bacteriana por gotas de revestimento contendo PVP e HCZB.
- Prepare uma agulha M 15, carregando com o mercúrio, colocando-o em posição e lavá-lo com PVP.
- Coloque um grupo de blastocistos (10-30 blastocistos) em uma queda com HCZB, e adicione 50-50 mL suspensão de células ES (depende da concentração) em mais uma gota de HCZB.
- Pick up células ES (5-10 células) com a agulha de injeção.
- Mover-se para a queda com a blastocistos. Alinhar os blastocistos horizontalmente, e fixar uma holding com a agulha através da aplicação de vácuo.
- Utilizando a agulha de injeção de transformar o blastocisto até que a massa celular interna (ICM) está na posição de 9 horas.
- Coloque a agulha de injeção em três horas, certifique-se que não há células-tronco embrionárias na ponta da agulha, e aplicar piezo-pulse até que a agulha de injeção penetra na zona pelúcida e do trofectoderma no blastocoel.
- Liberação de uma células ES poucos (15/05 células), de modo que as células ES ater ao ICM. Continue até que todos os blastocistos de um grupo tenham sido injetados com células-tronco embrionárias.
- Após um grupo de blastocistos terminar, lave-os duas vezes em KSOM-AA e mantê-los em uma gota com KSOM-AA até que todos os blastocistos são injetados.
5. Transferência de Embriões
A transferência de embriões em fêmeas grávidas pseudo-representa um procedimento cirúrgico, que precisa ser realizado com muito cuidado e de acordo com as diretrizes do instituto do pesquisador.
- Anestesiar ratos destinatário do sexo feminino, shave quadrante inferior direito, e desinfectar.
- Tesoura aberta usando a pele, e separar o peritônio da pele.
- Localizar o ovário através do peritônio (mancha vermelha), e abrir o peritônio próximo ao ovário.
- Usando uma pinça, cuidadosamente pegar o oviduto e retirar o útero.
- Pegar um grupo de cerca de 10 blastocistos com um capilar ligado a uma pipeta na boca.
- Fixar o útero com uma pinça, um soco nele toda pequena com uma pequena agulha, e inserir o capilar com o blastocistos para o lúmen do útero.
- Cuidadosamente liberação dos embriões no útero, e remover o seu capilar.
- Empurrar o útero de volta para a cavidade abdominal.
- Localizar as bordas do peritônio e fechá-lo com alguns pontos.
- Feche a pele do rato com alguns grampos.
- Para dor pós-operatória, administrar 5 carprofeno mg por mg de peso corporal.
Figura 1. Nuclear de células somáticastransferência de células pré-definido em T B6CF1 fundo. Números absolutos e relativos de embriões gerados a partir de células CD8 + T e células estaminais embrionárias derivadas de blastocistos TNCS.
Figura 2. Análise de fluxo de Representante citometria de camundongos quiméricos injetados com células-tronco embrionárias TNCS. Portão e número (por cento ao total de células CD8 + T) indica a presença de específicos células T CD8 + em camundongos quiméricos.
Discussion
Nós mostramos aqui que SCNT pode ser usado para gerar ratos a partir de células T transnuclear pré-definidas especificidade. Embora não seja mostrado aqui, a técnica também deve ser usado para gerar ratos a partir de células B transnuclear pré-definidas especificidade.
Uma coisa importante a considerar é a tensão e sexo do mouse, que é infectados ou imunizados e usado para isolar T ou células B de interesse. Como as células T e B têm uma eficiência muito baixa reprogramação em geral, recomendamos a utilização de híbridos F1 do haplótipo desejado. Porque a célula doadora também determina o sexo, recomendamos o uso de T ou células B de camundongos machos. Isso significa que apenas homens ratos quiméricos iria transmitir o TCR ou BCR através da linha germinativa, com camundongos machos sendo mais fácil e rápido para se reproduzir.
Tomados em conjunto, pensamos que a reprogramação epigenética via SCNT representa uma poderosa ferramenta para gerar um novo tipo de modelos de mouse, que será de grande vantagem para o campo imunológico.
Disclosures
A patente foi arquivada.
Acknowledgments
Os autores são gratos a H. Eisen, Gubbels M., K. van Grinsven, Guillen E., A. Drake, Mahajan V., Gao P. e G. Yap para discussões frutíferas e reagentes. Somos gratos a J. Dausman, Flannery R. e J. Jackson para a assistência com a gestão da colônia mouse. Somos gratos a P. Wisniewski para FACSorting. EMF foi apoiado pelo Programa Human Frontiers Science. RJ foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde concede RO1-HD045022 e R37-CA084198. HLP foi suportado por concessões do National Institute of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red Blood Cell lysis Buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | REF 352340 | |
| Pregnant Mare Serum (PMS) | Calbiochem | 367222 | |
| Human Chorionic Gonadotropin (HCG) | Calbiochem | 230734 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | Type IV-S |
| KSOM-AA | EMD Millipore | MR-106-D | |
| HCZB | EMD Millipore | MR-173-D | Customized medium |
| Ca-free medium for activation | EMD Millipore | MR-174-D | Customized medium |
| SrCl2 | Sigma-Aldrich | 255521 | 100mM = 10x |
| AlbuMAX I | GIBCO, by Life Technologies | 11020-021 | |
| PVP | MP Biomedicals | 102787 | Make 10% solution using HCZB, and add 0.1% AlbuMAX I |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | 500μg/ml = 100x |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich | T8552 | 5mM = 1000x |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | |
| Holding needle | Humagen | MPH-SM-30 | |
| Injection and transfer needles | Humagen | 4-15, 7-15, 15-15 | |
| Mouth pipette | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | or something similar |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | or something similar |
| Wound Clip Applicator | BD Biosciences | 427630 | |
| Wound Clips | BD Biosciences | 427630 | |
| Suture | Ethicon Inc. | K871H | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | 15% |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza Inc. | 17-602E | 100x |
| Glutamin | MP Biomedicals | 101806 | 200mM = 100x |
| Non-essential Aminoacids | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | 100x |
| β-Mercapt–thanol | GIBCO, by Life Technologies | 21985-023 | 5μl in 500ml |
| LIF | EMD Millipore | ESG1106 | 1000x |
| MEK inhibitor | Cell Signaling Technology | 9900L | For ES derivation only, add to ES medium (final concentration 50μM) |
References
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- Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R., R, F. Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements. Immunol. Cell Biol. 76, 34-34 (1998).
- Eggan, K. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 6209-6209 (2001).
- Kishigami, S. Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer. Biochem Biophys Res Commun. 340, 183-183 (2006).
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