Summary
Vi visar här att epigenetiska omprogrammering via somatisk kärnöverföring (SCNT) kan användas som ett verktyg för att generera musmodeller med fördefinierade T cell receptor (TCR) särdrag. Dessa transnuclear möss uttrycka motsvarande TCR från deras endogena lokus under kontroll av den endogena arrangören.
Abstract
Lymfocyter, som t.ex. T-celler, genomgå genetiska V (D) J rekombination för att generera en receptor med en viss specificitet 1. Möss transgena för en ordnas antigen-specifika T cells receptorn (TCR) har ett oumbärligt verktyg för att studera T-cell utveckling och funktion. Dock är sådana TCRs oftast isolerad från de relevanta T-celler efter långvarig kultur ofta efter upprepade antigen stimulering, vilket oundvikligen väljer för T-celler med hög affinitet. Slumpmässiga genomisk integrering av TCR α-och β-kedjan och uttryck från icke-endogena projektansvariga kan leda till variationer i uttryck nivå och kinetik.
Epigenetiska omprogrammering via somatisk kärnöverföring är ett verktyg för att generera embryonala stamceller och möss från en cell av intresse. Följaktligen, när SCNT appliceras på T-celler av kända specificitet, är dessa genetiska V (D) J omorganiseringar överförs till SCNT-embryonala stamceller (ESC) och möss härrör från dem, medan epigenetiska märken återställs. Vi har visat att T-celler med fördefinierade särdrag mot Toxoplasma gondii kan användas för att generera musmodeller som uttrycker den specifika TCR från deras endogena loci, utan experimentellt införda genetiska modifieringen. Den relativa lätthet och snabbhet med vilken sådant transnuclear modeller kan erhållas håller löftet för byggande av annan sjukdom modeller.
Protocol
Denna metod användes i forskningen redovisas i Kirak et al. Science 328 (5975), 243-248 (2010) .
1. Isolering av donatorer celler
Innan specifika T-eller B-celler kan användas som givare celler att generera transnuclear musmodeller, möss behöver vara smittad av en patogen av intresse eller immuniserade med ett antigen av intresse. Eftersom vi har använt CD8 + celler specifika för Toxoplasma gondii, kommer följande protokoll beskriver generering och isolering av dessa celler och måste anpassas efter personligt intresse.
- Cystor härrör från en mus hjärna homogenatet (ca 40) injiceras inom peritoneally i BL / 6 x BALB / c F1 (B6CF1) möss, som möjliggör isolering av både H-2 B och H-2 d begränsad CD8 + T-celler.
- På toppen av immunförsvaret, är den infekterade musen dödshjälp, mjälte isolerade och placeras i en skål som innehåller 6 ml röda blodkroppar (RBC) lyseringsbuffert.
- Använda frostade sidorna av två täcker diabilder, är mjälten noga marken och inkuberas i RBC lyseringsbuffert i 5 min vid RT.
- Tillsätt 14 ml PBS, filtrera cellsuspension genom en cell sil (40 eller 70 mikrometer) i ett 50 ml Falcon rör och centrifugera i 5 min på 300g.
- Avlägsna supernatanten och resuspendera cellpelleten i 1 mL PBS och överför till ett 1,5 ml Eppendorf-rör. Centrifugera i 5 min på 300 g och avlägsna supernatanten efteråt.
- Resuspendera cellpelleten i 50 mikroliter PBS, lägga fluorescerande antikroppar för att identifiera celltypen av intresse (t.ex. CD3, B220, CD8, och CD4) och fluorescerande MHC-I tetramer (MHC-II tetramer för CD4 T-celler) laddade med peptid av intresse för cellsuspension och inkubera i 30 minuter vid 4 ° C.
- Tillsätt 1 mL PBS, centrifugera i 5 min på 300 g, återsuspendera pelleten i 3 ml PBS och filtrera cellsuspension genom en cell sil (40 eller 70 mikrometer) till ett rör.
- Utför FACSorting genom att ställa in portarna strikt (Figur 1B).
2. Somatisk kärnöverföring
Det finns några protokoll för somatisk cellkärnöverföring. Det som beskrivs här använder sig av oocyter greps vid Metaphase-II och hämningen av den andra meiotiska divisionen med Cytochalasin B. Därför celler givare behövs som är i G0/G1 fas.
- Beredning av oocyter
- Honmöss av BDF1 bakgrund är injiceras intra-peritoneally med 5IU PMS per mus från 05:00 till 07:00.
- Om 47 timmar senare, varje mus injiceras inom peritoneally med 5IU HCG.
- Förbered en kultur skål (KSOM AA droppar under olja) för ägg samma dag som hCG-injektionen och placera dem i en inkubator 37 ° C, 5% CO 2. Dessutom förbereder nålar behövs för SCNT (7μm för enucleation och 4 eller 5μm för nukleär överföring av lymfocyter kärnor) genom att ladda dem med kvicksilver.
- Euthanize möss och isolera äggledarna om 13h efter hCG (ca 08:00). Samla äggledarna i 1-2 droppar HCZB.
- En i taget flytta äggledarna in i en droppe innehåller M2 w / Hyaluronidas. Nick the äggledare försiktigt med en forcep och flytta äggcellen-cumulus-komplexet i droppe. Efter alla äggcellen-cumulus-komplex har isolerats, är skålen inkuberas vid 37 ° C.
- Efter 2-5 min (exakt tid beror på parti Hyaluronidas) samla in ägg, tvätta i HCZB och platta dem till KSOM-AA droppar.
- Enucleation av oocyter
- Använd locket på en petriskål att förbereda SCNT plattan. Ställ in mikroskopet, och mikromanipulator.
- Tvätta enucleation nål (7 mikrometer) i PVP innan du börjar med enucleation.
- För enucleation, placera en grupp av oocyter (10-30) till en droppe HZCB med Cytochalasin B (5 mikrogram / ml). Medan inkubationstiden (minst 5 min) line-up av oocyter horisontellt.
- Ta en äggcell och placera den framför håller nålen. Fäst äggcellen att innehavet nålen genom att tillämpa ett vakuum. Använda enucleation st, vänd ägget tills kromosom-spindel-komplex (CSC, som ofta kallas "kärnan") är i 3 klockan.
- Använda piezo-puls penetrera zona pellucida försiktigt utan att skada äggcellen. Placera öppningen av nålen intill Metaphase-II spindel och tillämpa vakuum. "Kärnan" bör långsamt flytta in nålen och membranet bör tätningen sig när den tas bort helt.
- Överför enucleated ägg tillbaka in i KSOM-AA droppar, och tvätta dem flera gånger. Upprepa ekärnbildning steg med en ny grupp av oocyter. Fortsätt tills alla äggen är enucleated eller tills ca 11:00.
- Kärnöverföring
- För kärnöverföring, byta ut enucleation nål (7 mikrometer) med en kärnöverföring nål (4 eller 5 mikrometer) och tvätta den med PVP.
- Placera dina celler av intresse (t.ex. CD8 + T-celler) i en droppe med PVP, blanda väl och inkubera i minst 10 min.
- Placera en grupp enucleated oocyter (10-30) till en droppe HCZB med Cytochalasin B (2,5 mikrogram / ml). Medan inkubationstiden (minst 5 min) line-up oocyter vågrätt med hjälp av kärnöverföring nålen.
- Plocka upp en donator celler från PVP-cellsuspension och aspirera det i och ut tills det yttre membranet gått sönder (fragment av membranet och cytosolen ska vara synlig). Om det behövs en piezo-puls kan tillämpas. När en kärna har isolerats, flytta den en bit upp i nålen, och fortsätter att plocka upp kärnorna tills du har 10-30.
- Flytta till nedgången som innehåller anpassade enucleated oocyter. Fäst en äggcell till den anläggning som nålen genom att tillämpa vakuum. Placera kärnöverföring nålen (kärnan ska vara borta från öppningen) i anslutning till zona pellucida och tillämpa piezo-puls tills nålen har gått igenom zona pellucida. Försiktigt flytta en kärna på nålspetsen, tryck in nålen i ägget tills nålspetsen är 2 / 3 inuti. Applicera en liten undertryck, så att lite av äggcellen membranet i nålen.
- Nästa steg är mycket kritisk, eftersom det är den enda tid då ägget är faktiskt "öppen". Applicera en enstaka puls av piezo-, tryck kärna ur nålen med hjälp av övertryck, försiktigt dra tillbaka nålen så att spetsen är ca 1 / 3 i äggcellen och sedan använda undertryck och fortsätta att dra tillbaka nålen till tätning i äggcellen. Upprepa detta med varje äggcellen.
- Efter alla oocyter i en grupp har fått en kärna, de tvättas och odlas i KSOM-AA media. Upprepa denna procedur med alla ägg.
- Efter den sista gruppen har kulturer i KSOM-AA i minst 30 min, är SCNT-embryon överföras till droppar av Ca-fri aktiveringen media som innehåller SrCl2.
- Efter 6 timmar av aktivering, är mängden av pseudo-pronuclei (PPN)-positiva SCNT-embryon fastställas. Embryona sedan tvättas och odlas i KSOM-AA droppar för ytterligare 3,5 dagar tills de har nått blastocyststadiet.
- Läkemedel eller kemikalier i valet (som Trichostatin A) kan läggas till aktivering och mediekulturen.
3.Derivation av embryonala stamceller
Den SCNT-blastocyster kan användas för att antingen överföra dem till pseudo-gravida kvinnor (även känd som direkt eller ett steg kloning) eller att erhålla embryonala stamceller (även känd som indirekt eller två steg kloning). Eftersom det är mycket effektivare för att skapa ES-celler, väljer vi två steg. I de fall forskaren är intresserad av direkt kloning kan blastocyster överföras direkt till pseudo-dräktiga honor som beskrivs i avsnitt 5.
Det finns många protokoll som beskriver härledning av embryonala stamceller. Det som beskrivs här är en standardiserad teknik, som använder feeder celler och fetala kalvserum.
- Den andra dagen efter kärnöverföring, förbereda en 96-U-brunnar för ES-celler härledning.
- Tillsätt 100 mikroliter Gelatin i varje brunn på en 96-U-brunnar, inkubera i minst 10 min, och ta bort den efteråt.
- Tina feeder celler och återsuspendera i ett beroende volym av ESD-medium är t.ex. feeder celler motsvarar en yta på 25 cm 2 suspenderade i 10 ml ESD medelstora och 200 mikroliter av cellsuspensionen läggs till vart och ett av gelatin-behandlas väl.
- Sätt plattan i en inkubator och kultur vid 37 ° C, 5% CO 2.
- Efter 3,5 dagar bör embryona vara på blastocyststadiet.
- Förbered en steril bakteriell skålen genom bordläggning några droppar medelstora ES-celler och sura thyrode.
- Den blastocyster är först överförs från KSOM-AA droppar i droppar som innehåller normala medelstora ES-celler och tvättas två gånger.
- Försiktigt överföra en grupp av blastocyster (5-10 blastocyster) till en droppe sura thyrode och hålla där tills zona pellucida har lösts upp.
- Den blastocyster överförs sedan till en nedgång med ES medium, tvättad två gånger och sedan placeras i mataren-belagda 96-U-brunnar (en blastocyst i en brunn).
- Embryona sedan odlas i 5-7 dagar i en inkubator vid 37 ° C, 5% CO 2 utan att störa dem. Detta ger embryot tid att enttach till feeder lagret, och för att bilda en utväxt.
- Förbered 24-brunnars plattor, med plätering matare i ESD-mediet i varje brunn, t.ex. resuspendera en motsvarighet till 50 cm 2 mataren i 12 ml ESD medium och tillsätt 500 mikroliter av cellsuspensionen i varje brunn.
- Ta försiktigt bort ESD-mediet från den 96-U-brunnar med embryon, tvätta varje brunn två gånger med 250 mikroliter Hepes (eller PBS), tillsätt 50 mikroliter Trypsin och inkubera i ca 5 min vid 37 ° C.
- Pipettera upp och ner flera gånger, tills utväxt har fallit sönder i en encelliga fjädring, överföring till en 24-brunnar och inkubera vid 37 ° C, 5% CO 2.
- Om ESK härledning lyckades, borde ESK kolonier bli synlig efter 7-10 dagar.
4.Blastocyst injektion
Injektion av blastocyster är en rutin teknik för att generera någon form av transgena musmodell. Det är viktigt att nämna att injektion av blastocyster och den efterföljande överföringen till pseudo-gravida kvinnor måste vara tidsinställda bra.
- Prime honmöss med PMS och HCG som beskrivs i avsnitt 2.1. Efter hCG injektionen sätta honmöss tillsammans med hanmöss (en hona och en hane mus per bur).
- Nästa dag, kontrollera honor pluggar. Detta räknas som 0.5dpc (dagar efter samlag).
- Befruktade embryon sedan isoleras från äggledare som beskrivs i avsnitt 2.1, och odlas i KSOM-AA för ytterligare 3 dagar.
- Förbered ES-celler samma dag som blastocysten injektionen (3.5dpc).
- Ta bort mediet från ES-celler, tvätta två gånger med Hepes (eller PBS), lägg Trypsin och inkubera i 5 minuter vid 37 ° C.
- Resuspendera trypsinized celler med ES-medium, plattan i en skål, och inkubera i 45-60 minuter vid 37 ° C, 5% CO 2 för att minska mängden feeder celler (feeder celler följa snabbare än ES-celler).
- Överför cellsuspension genom en cell sil (40 eller 70 mikrometer) i ett rör och centrifugera i 5 min vid 1000rpm.
- Avlägsna supernatanten, återsuspendera cellpelleten i 500 mikroliter ES medellång och förvara på is tills det behövs.
- Förbered locket på en steril bakteriell skålen genom bordläggning droppar innehåller PVP och HCZB.
- Förbered en 15 ìm nål genom att ladda med kvicksilver, placera den på plats och tvätta det med PVP.
- Placera en grupp av blastocyster (10-30 blastocyster) i en droppe med HCZB och lägga 5-50 mikroliter fjädring ES-celler (beroende på koncentration) till en annan droppe HCZB.
- Plocka upp ES-celler (50-100 celler) med injektionsnål.
- Flytta till nedgången med blastocyster. Rikta in blastocyster horisontellt och fixa ett med anläggningen nålen genom att tillämpa vakuum.
- Använda injektionsnål vrid blastocysten fram den inre cellmassan (ICM) är på 9 klockan.
- Placera dina injektionsnål klockan 3, se till att det inte finns några ES-celler vid spetsen av nålen, och tillämpa piezo-puls tills injektionsnålen tränger genom zona pellucida och trophectoderm i blastocoel.
- Släpp några ES-celler (5-15 celler), så att ES-celler fastnar på ICM. Fortsätt tills alla blastocyster i en grupp har injicerades med ES-celler.
- Efter en grupp av blastocyster är klar, tvätta dem två gånger i KSOM-AA och förvara dem på en droppe med KSOM-AA tills alla blastocyster injiceras.
5. Embryo Transfer
Överföringen av embryon i pseudo-gravida kvinnor är ett kirurgiskt ingrepp som måste göras mycket omsorgsfullt och enligt riktlinjerna i forskarens institutet.
- Bedöva kvinnliga mottagaren möss, raka nedre högra kvadranten, och desinficera.
- Använda sax öppnar huden, och separera bukhinnan från huden.
- Leta reda på äggstocken genom bukhinnan (röd fläck) och öppna bukhinnan i närheten av äggstocken.
- Med hjälp av en pincett försiktigt tag i äggledare och dra ut livmodern.
- Plocka upp en grupp på ca 10 blastocyster med en kapillär kopplad till en mun pipett.
- Fäst livmodern med en pincett, stansa ett litet helhet till det med en liten nål och för in kapillär med blastocyster i lumen i livmodern.
- Försiktigt släpper embryona i livmodern, och ta bort kapillär.
- Tryck livmodern tillbaka in i bukhålan.
- Leta upp kanterna på bukhinnan och stäng den med några stygn.
- Stäng huden på möss med några häftklamrar.
- Vid postoperativ smärta, administrera 5 mikrogram karprofen per mg kroppsvikt.
Figur 1. Somatisköverföring av fördefinierade T-celler i B6CF1 bakgrunden. Absoluta och relativa antalet embryon som genereras från CD8 + T-celler och embryonala stamceller från SCNT blastocyster.
Figur 2. Representant flödescytometrianalyser av chimär möss injicerades med SCNT embryonala stamceller. Gate och antal (procent per totala CD8 + T-celler) indikerar förekomst av specifika CD8 + T-celler i chimär möss.
Discussion
Vi har visat här att SCNT kan användas för att generera transnuclear möss från T-celler med fördefinierade specificitet. Även om det inte visas här, bör tekniken också användas för att generera transnuclear möss från B-celler med fördefinierade specificitet.
En viktig sak att tänka på är stam och kön mus, som är smittat eller vaccinerade och används för att isolera T-eller B-celler av intresse. Eftersom T-och B-celler har en mycket låg omprogrammering effektivitet i allmänhet, rekommenderar vi att du använder F1 hybrider av önskad haplotyp. Eftersom givaren cellen också bestämmer könet, rekommenderar vi att du använder T-eller B-celler från hanmöss. Detta innebär att endast manliga chimär möss skulle överlämna TCR eller BCR genom könsceller, med hanmöss är enklare och snabbare att föda.
Sammantaget tror vi att epigenetiska omprogrammering via SCNT är ett kraftfullt verktyg för att generera en ny typ av mus-modeller, vilket kommer att vara till stor fördel för immunologiska fältet.
Disclosures
En patentansökan har lämnats in.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma till H. Eisen, M. Gubbels, K. Van Grinsven, E. Guillen, A. Drake, V. Mahajan, Q. Gao, och G. Yap för givande diskussioner och reagens. Vi är tacksamma till J. Dausman, R. Flannery, och J. Jackson för hjälp med förvaltningen av musen kolonin. Vi är tacksamma för att s. Wisniewski för FACSorting. EMF stöddes av Human Frontiers Science Program. RJ stöddes av National Institute of Health bidrag RO1-HD045022 och R37-CA084198. HLP har finansierats med bidrag från National Institute of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red Blood Cell lysis Buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | REF 352340 | |
| Pregnant Mare Serum (PMS) | Calbiochem | 367222 | |
| Human Chorionic Gonadotropin (HCG) | Calbiochem | 230734 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | Type IV-S |
| KSOM-AA | EMD Millipore | MR-106-D | |
| HCZB | EMD Millipore | MR-173-D | Customized medium |
| Ca-free medium for activation | EMD Millipore | MR-174-D | Customized medium |
| SrCl2 | Sigma-Aldrich | 255521 | 100mM = 10x |
| AlbuMAX I | GIBCO, by Life Technologies | 11020-021 | |
| PVP | MP Biomedicals | 102787 | Make 10% solution using HCZB, and add 0.1% AlbuMAX I |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | 500μg/ml = 100x |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich | T8552 | 5mM = 1000x |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | |
| Holding needle | Humagen | MPH-SM-30 | |
| Injection and transfer needles | Humagen | 4-15, 7-15, 15-15 | |
| Mouth pipette | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | or something similar |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | or something similar |
| Wound Clip Applicator | BD Biosciences | 427630 | |
| Wound Clips | BD Biosciences | 427630 | |
| Suture | Ethicon Inc. | K871H | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | 15% |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza Inc. | 17-602E | 100x |
| Glutamin | MP Biomedicals | 101806 | 200mM = 100x |
| Non-essential Aminoacids | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | 100x |
| β-Mercapt–thanol | GIBCO, by Life Technologies | 21985-023 | 5μl in 500ml |
| LIF | EMD Millipore | ESG1106 | 1000x |
| MEK inhibitor | Cell Signaling Technology | 9900L | For ES derivation only, add to ES medium (final concentration 50μM) |
References
- Schatz, D. G. V(D)J recombination. Immunol. Rev. 200, 5-5 (2004).
- Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R., R, F. Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements. Immunol. Cell Biol. 76, 34-34 (1998).
- Eggan, K. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 6209-6209 (2001).
- Kishigami, S. Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer. Biochem Biophys Res Commun. 340, 183-183 (2006).
- Wakayama, T., Yanagimachi, R. Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type. Mol Reprod Dev. 58, 376-376 (2001).
