שיטת התרבות העובר שלמים מכרסמים באמצעות Rotator מסוג התרבות מערכת בקבוק

Summary

טכניקה שלמים תרבות העובר מאפשר לנו עכבר התרבות עוברי חולדה

Abstract

העובר שלמים תרבות (WEC) הטכניקה פותחה בשנת 1950 על ידי בניו של וחבריו, והגיש בקשה בביולוגיה התפתחותית ^1. למרות התפתחות וצמיחה של עוברי יונקים תלויים באופן קריטי על תפקוד השליה, WEC הטכניקה מאפשרת לנו עכבר התרבות עוברי חולדה מצב vivo לשעבר בתקופות מוגבל המתאים בשלבים עובריים midgestation במהלך היום (ה ') 6.5-E12.5 ב עכבר או E8.5-E14.5 בחולדה ^{2, 3, 4.} ב WEC, אנחנו יכולים ישירות ליעד המבוקש תחומי עוברים באמצעות קנס זכוכית הנימים כי עוברי ניתן להשפיע מתחת למיקרוסקופ. לכן, WEC מכרסם הוא טכניקה שימושית מאוד כאשר אנו רוצים ללמוד תהליכים התפתחותיים הדינמי של עוברי יונקים postimplanted. עד כה, מספר סוגים של מערכות WEC פותחו ^1. בין אלה, את הכתף מסוג התרבות מערכת בקבוק הוא הפופולרי ביותר מתאים לתרבות לטווח ארוך של עוברים ב midgestation, כלומר, לאחר E9.5 ואת E11.5 של העכבר חולדה, בהתאמה ^1. בפרוטוקול הווידאו הזאת, אנחנו מדגימים את הנהלים הרגילה שלנו של WEC עכברוש לאחר E12.5 באמצעות מודל מזוקק של מערכת המפרק המקורי, אשר תוכנן על ידי ניו Cockroft ^{5, 6,} ו להציג יישומים שונים של טכניקת WEC ללימודי התפתחותי יונקים הביולוגיה.

Protocol

1. הגדרת מערכת WEC

1. המשותף קרום 0.22 מיקרומטר מסנן צינור סיליקון מפרצון בתוך מערכת ^WEC).
2. פתח את השסתום של גליל גז המכיל O ₂ (95%) ו - CO ₂ (5%). תזרים את תערובת גז לתוך התוף דרך בקבוק המכיל מים מבעבעים autoclaved.
3. התאם את עוצמת הזרימה של התערובת דלק 50 סמ"ק.
4. הכנס את בואו צינור סיליקון לתוך בקבוק המים לבדוק את זרימת תערובת הגזים.
5. סובב את התוף במהירות של 20 סל"ד / min.

2. הכנת בינוני תרבות

1. עכברוש להפשיר מיד, centrifuged (IC) בסרום על 37.0 מעלות צלזיוס ^ב). הוסף את D-גלוקוז (2 מ"ג / מ"ל) לתוך בסרום מופשר בכוס 100 מ"ל autoclaved. בינוני התרבות צריכים להיות מוכנים ברמה התרבות העיקרי (למשל, באמצעות מכסה המנוע).
2. הוסף לאנטיביוטיקה antimycotic (100x) נוזל סרום עם 1: 400 דילול.
3. לאדות isoflurane הנותרים (עקב ההרדמה של חולדות במהלך איסוף דם) מן הנסיוב למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ^ג).
4. לעקר את המדיום תרבות באמצעות 0.45 קרום מסנן מיקרומטר.
5. יוצקים 3.0 מ"ל של המדיום בבקבוק כל תרבות לאטום את החלק העליון של כל בקבוק עם פקק סיליקון, מכוסה בנייר אלומיניום (ראה נ"צ. 14) ^ד).
6. הכן שלוש או ארבע צלחות פטרי המכילות לרשות ^הדואר מלוחים של ^Tyrode).

3. הרדמה של החולדה ובידוד של הרחם

1. הרדימי עכברוש מתוזמן בהריון שאיפה עמוקה עם הרדמה או Parenteral.
2. נקו את אזור הבטן של חולדה בהריון הרדים עם אתנול 70%.
3. תרימי את העור עם מלקחיים exteriorize את דופן הבטן על ידי חיתוך העור עם מספריים גדולות ^ו).
4. תרימי את דופן הבטן עם זוג מלקחיים ולעשות בצורת U חתכים האורך גדול על דופן הבטן במספריים גדולים עד ^g רמת ^החזה).
5. דובי משם את המעי לצד שמאל עם זוג מלקחיים ולחשוף קצה אחד של הרחם קשור השחלה.
6. תרים את הקצה של הרחם עם זוג מלקחיים ולחתוך את המיקום בין הרחם לשחלות במספריים גדולים.
7. קח את הרחם מן החולדה בהריון על ידי חיתוך שומן סביב הרחם עד לקצה השני של הרחם.
8. מעבירים את הרחם כדי בצלחת פטרי המכילה תמיסת מלח של Tyrode.
9. להרדים את העכברוש על ידי הממשל יתר של חומרי הרדמה או פריקה צוואר הרחם לאחר הסרת הרחם.

4. הסרת עוברים מן הרחם

1. בקצרה לשטוף את הרחם מלוחים של Tyrode ולהעביר אותו בצלחת פטרי השני עם צמד מצוין מלקחיים ^ח).
2. תחת מיקרוסקופ המשקפת, להרים את קיר הרחם עם זוג מלקחיים בסדר וחתך את קיר הרחם בבית מול צד mesometrium חיבור עם כלי דם באמצעות מספריים עיניים ישר.
3. הכנס את קצה מספריים עיניים ישר אל תוך החלל שבין קיר הרחם decidua. חותכים את דופן הרחם longitudinally בצד antimesometrial.
4. סבך decidua בצד mesometrial ו conceptuses נפרד מן הרחם באמצעות שני זוגות מלקחיים בסדר ^i).
5. העברת conceptuses כדי בצלחת פטרי השלישי עם טפטפת זכוכית מעוקר עם קוטר מתאים.

5. Dissection של עוברי חולדה

1. להוסיף אחת קצה microforceps לתוך decidua ולעשות חתך רוחבי על decidua סביב conceptus עם שני זוגות מלקחיים.
2. הכנס את קצות מלקחיים לתוך decidua בצד השליה לעשות שני חתכים על האורך decidua למעלה.
3. הסר את decidua בצד השליה ידי קריעה על כך עם שני זוגות מלקחיים. הסר את decidua שנותרו עם שני זוגות מלקחיים.
4. תרימי הממברנה של רייכרט, לעשות חתך אופקי על זה, להפריד את הקרום מן conceptus בצד אנטי השליה.
5. עושים חור קטן על שק החלמון ליד ראשו של העובר עם שני זוגות מלקחיים, וחתך את שק החלמון עם זוג מספריים עיניים מעוקל. חשוב לא לפגוע בכלי הדם הגדולים.
6. תרימי את amnion באתר סביב ראשו של העובר עם שני זוגות מלקחיים בסדר, בעדינות לשלוף את העובר מתוך שק החלמון על ידי קריעת ^{h amnion).} גופתו של העובר צריך להיות שלף של שק החלמון כדי להגדיל את אספקת החמצן לעובר בשלב midgestation.

6. העובר שלמות תרבות

1. בדוק נזקים על השליה, שק החלמון, ואת מצבם של פעימות הלב ואת זרימת הדם.
2. להיות מודע לא למתוח את חבל הטבור, העברתהעובר על בקבוק תרבות עם טפטפת זכוכית מעוקר. נשיאה של מעל מלוחים של Tyrode על בקבוקי תרבות צריך להיות כמה שפחות.
3. הסרת התוספת הלא חור סיליקון מהתוף rotator. חבר את בקבוק תרבות עם תקע עם חור אל התוף מסובב של מערכת WEC בניצב. היזהר שלא לשים בכוח על התוף לכיוונים מתאימים מאז תוף rotator הוא ציוד עדין מאוד. הבקבוקים המכילים את העובר גזור מועברים תרבות אחד אחד; פתיחת הדלת הקדמית של החממה צריך להיות ממוזער, כדי למנוע את הטמפרטורה בחממה יורדת ^י).
4. לאחר 10 שעות של תרבות, להגדיל את היקף הזרימה של התערובת דלק של עד 75 סמ"ק עד 100 סמ"ק לאחר 24 שעות (טבלה 1).
5. המדיום תרבות יש לשנות סביב 24 שעות על ידי העברת העובר תרבותי לתוך בקבוק תרבות חדשה עם המדיום מוכן טרי. להגדיל את נפח זרימת עד 125 סמ"ק לאחר שעה 34 ועד 150 סמ"ק לאחר 48 שעות (טבלה 1)
6. מדי פעם לבדוק את מצבם של העוברים בתרבית על ידי ספירת קצב פעימות הלב (כלומר, 120-150/min הוא אופטימלי) ועל ידי התבוננות זרימת הדם. אם יש צורך לספור את מספר somites לשפוט את הצמיחה של עוברים מלוחים של Tyrode. בהתפתחות נורמלית, אחד somite הוא הוסיף תוך שעתיים.
7. WEC כאשר הוא סיים, להפסיק אספקת תערובת גז לנתק את צינור היניקה ואת קרום מסנן כדי למנוע חזרה לזרום לתוך צינור היניקה מהבקבוק מבעבע.

7. הערות

1. הטמפרטורה בתוך המערכת WEC נשמר כל הזמן על 37.0-37.5 ° C.
2. עכברוש 100% IC בסרום משמש באופן שגרתי WEC שלנו עוברים חולדה ועכבר, והמשיך ב -20 מעלות לפני השימוש.
3. אנו לרכוש עכברוש IC בסרום, אשר נאסף חולדות מורדמים עם isoflurane.
4. בקבוקי פנויה זמינים גם מן Ikemoto ריקה. בקבוקים אטמי סיליקון יש autoclaved.
5. Dissection של עוברי צריך להתבצע בכל RT כי שמירה של עוברים בטמפרטורה נמוכה או גבוהה במהלך דיסקציה להשפיע על התפתחות שלאחר מכן ב WEC.
6. כלים לניתוח הם מעוקרים ידי חום יבש.
7. העור ואת דופן הבטן צריך לחתוך בנפרד, כדי למנוע זיהום של שערות לתוך צלחת האפשרי. אנו שינוי מספריים מלקחיים גדולים עם זוג חדש של אותם כאשר אנו לגזור את העור לבודד את הרחם, בהתאמה.
8. בעזרת מלקחיים שקצותיהם בסדר חשוב מאוד לנתח רקמות בהחלט. אנו ידני לחדד את קצות מלקחיים עם אבן שמן מכונות.
9. אנו משתמשים צד אחד של מלקחיים כמו סכין כדי למנוע לחץ עודף על עוברים.
10. כאשר הטמפרטורה בתוך המערכת WEC פוחתת ידי פתיחת הדלת שוב ושוב, אנו ממשיכים להדליק את האור כדי לשמור על הטמפרטורה בתוך המערכת.

8. נציג תוצאות

איור 1 מציג נהלים של דיסקציה של העובר חולדה עוברי חולדה תרבותי.

באיור 1. תרבות העובר שלמים של העובר E12.5 את העכברוש. (א) conceptus גזור מן הרחם של חולדה בהריון. (ב) הסרת decidua בצד השליה. (ג) הסרת קרום של רייכרט. (ד) פתיחת שק החלמון. (ה) העובר עכברוש culturing בבקבוק במשך 6 שעות לאחר תחילת WEC. (ו) העובר עכברוש תרבותי עבור 42 שעות. ד, decidua; R; קרום של רייכרט, p, השליה, ys, שק חלמון, דואר, העובר.

	0 hr	12 שעות	24 שעות	36 שעות	48 שעות
E12.5 עכברוש העובר	95% 50 סמ"ק	95% 75 סמ"ק (10 שעות)	95% 100 סמ"ק	95% 125 סמ"ק (34 שעות)	95% 150 סמ"ק

טבלה 1. מצב חמצן אופטימלית.

Discussion

ישנם שני שלבים קריטיים WEC מכרסם להצלחה. ראשית, הליך לנתיחה צריך להיות מדויק ולא עוברים נזק, בעיקר כלי הדם. שנית, ההליך צריך להיות מהר ככל האפשר כי החמצן מזין אינם מסופקים דרך השליה לאחר במנותק מן הרחם. זה קריטי עוברים יותר. במקרה של WEC עכברוש לאחר E12.5, אנחנו צריכים להעביר את העוברים גזור לתוך בקבוקים תרבות בתוך 30 דקות.

ניתחנו דפוסי הנדידה של תאים עצביים לפסגה בסוג בר Pax6 עוברי עכברים מוטנטים על ידי תיוג מספר קטן של תאים עם פלורסנט לצבוע DiI או השתלת DiI שכותרתו תאים העוברים עכברוש סוג בר רקע מוטנטים ^7. מפת גורל צלחת העצבית הקדמי כבר שלופה העכבר מהתווית תאים neuroepithelial עם DiI ו culturing במשך 24 שעות ^8. WEC שימש גם לצורך השתלה של תאים לבטא את ה-GFP לתוך telencephalon של E12.5 עוברי חולדה לבחון אוטונומיה תא פגמים הגירה המוצג עכברוש Pax6 מוטציה ^9. מעכבי שונים ניתן להחיל על המדיום תרבות לבחון במעברי האותות המעורבים היווצרות ציר מחזור התא במהלך ^{10 פיתוח, 11.} יתר על כן, אנחנו יכולים פשוט להכניס פלסמידים ביטוי siRNA לתוך המוח המתפתח של עוברים בתרבית על ידי electroporation לנתח פונקציות גן ^12,13,14. אנחנו גם חקר התנהגותם של תאים neuroepithelial שכותרתו עם חלבון פלואורסצנטי בתרבות איבר או תרבות פרוסה הבאה WEC (ראו נ"צ. והפניות בו 14) ^14. לכן, WEC מכרסם מאוד שימושי לא רק לניתוח השושלת התא, אלא גם עבור הגן על ידי הבהרת פונקציות הפסד פונקציה של ולהשיג-of-פונקציה ניסויים.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
WEC system (10-0310)	Tool	Ikemoto Rika	010-0310	Another small model is also available.
Silicon plug without a hole	Tool	Ikemoto Rika	010-032-08
Gas mixture cylinder	Tool	Nikko Sanso	-	Containing 95% oxygen & 5% carbon dioxide. Custom order.
Gas regulator	Tool	Ono Seisakusho	WR-11
0.22 μm filter Millex GS	Tool	EMD Millipore	SLGS033SS
Large scissors	Tool	Napox	B-7H
Forceps	Tool	Napox	A-3-2
Disposal Petri dish (90 mm x 15 mm)	Tool	Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.	SH90-15	Deep-type dish is the best for dissection.
Isoflurane	Reagent	Abbott Laboratories	B506	For anesthesia
Pentobarbital sodium	Reagent	Merck & Co.	-	For anesthesia
Tyrode’s saline	Reagent			According as the protocol in Ref. 2. Save at 4°C.
Timed-pregnant Sprague-Dawley rat	Animal	Charles River Laboratories	-
Culture glass bottle	Tool	Ikemoto Rika	010-032-05
Disposal culture bottle	Tool	Ikemoto Rika	010-032-06
Silicon plug with hole	Tool	Ikemoto Rika	010-032-07
Aluminum foil	Tool	Any Supplier	-
Autoclaving bag	Tool	Hogy	HM-26	For culture bottles
Autoclaving bag	Tool	Hogy	HM-14A	For silicon plugs
0.45 μm filter Millex HA	Tool	EMD Millipore	SLHA033SS
50 ml conical tube	Tool	BD Biosciences	352070
100 ml beaker	Tool	Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.	TE-32
Rat IC serum	Reagent	Charles River Laboratories	-	Refer to: Mr. Kunihiko Morisaki, TEL: +81-(0) 45-474-9336; FAX: +81-(0) 45-474-9340
D(+)-Glucose	Reagent	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	041-00595
Antibiotic-antimyotic liquid	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15240
Ophthalmic straight scissors	Tool	Napox	MB50-7	For cutting the uterine wall
Ophthalmic curved scissors	Tool	Napox	MB54-2	For cutting the yolk sac
Forceps #5	Tool	Vigor	T6715
Forceps #5F	Tool	Regine	T6819
Glass pipette	Tool			Made by hand using Pasteur pipette.
Autoclaving bag	Tool	Hogy	HM-4	For glass pipettes
Binocular microscope	Tool	Leica Microsystems	Mz7s
Light	Tool	Leica Microsystems	CLS 150XD
Oil stone	Tool	Uchida Yoko	833-2000	For sharpening of forceps
Machine oil	Tool	Uchida Yoko	835-0000	For sharpening of forceps