Vorbereitung der Beschwerde Matrizen zur Quantifizierung von Cellular Kontraktion

Summary

In diesem Video zeigen wir die experimentelle Techniken verwendet, um konform, extrazellulären Matrix (ECM) beschichtete Substrate für Zellkulturen herzustellen, und die durchaus in Zugkraft Mikroskopie und Beobachten Auswirkungen der ECM Steifigkeit auf das Verhalten der Zelle.

Abstract

Die Regulation der zellulären Adhäsion an die extrazelluläre Matrix (ECM) ist von wesentlicher Bedeutung für die Zell-Migration und ECM Umbau. Fokalen Adhäsionen sind makromolekulare Baugruppen, die Kopplung der kontraktilen F-Aktin-Zytoskelett der ECM. Diese Verbindung ermöglicht die Übertragung von intrazellulären mechanischen Kräfte durch die Zellmembran mit dem darunterliegenden Substrat. Neuere Arbeiten haben gezeigt, die mechanischen Eigenschaften der ECM regulieren fokale Adhäsion und F-Aktin-Morphologie sowie zahlreiche physiologische Prozesse, einschließlich der Zelldifferenzierung, Division, Proliferation und Migration. So hat der Einsatz von Zellkultursubstraten zu einem immer vorherrschende Methode zur präzisen Steuerung und modulieren ECM mechanischen Eigenschaften.

Zur Quantifizierung Zugkräfte an fokalen Adhäsionen in einer adhärenten Zelle, entsprechen Substraten in Verbindung mit hochauflösenden Bildgebung und rechnergestützte Techniken in einem Verfahren genannt Traction Force Mikroskopie (TFM) verwendet. Diese Technik beruht auf Messungen der lokalen Größe und Richtung der Substrat Verformungen durch zelluläre Kontraktion induziert. In Kombination mit hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie von fluoreszenzmarkierten Proteinen ist es möglich, Zytoskelett-Organisation und Umbau mit Zugkräften zu korrelieren.

Hier präsentieren wir Ihnen ein ausführliches Versuchsprotokoll für die Herstellung von zweidimensionalen, konforme Matrizen für die Zwecke der Schaffung einer Zellkultur Substrat mit einem gut charakterisierten, abstimmbaren mechanische Steifigkeit, die für die Messung zellulärer Kontraktion ist. Diese Protokolle umfassen die Herstellung von Polyacrylamid-Hydrogele, Beschichtung von ECM-Proteine ​​auf solche Gele, Plattieren Zellen auf Gele und hochauflösenden konfokalen Mikroskopie mit einem Perfusionskammer. Darüber hinaus bieten wir eine repräsentative Stichprobe von Daten, die zeigen Lage und das Ausmaß der zellulären Kräfte mit angeführt TFM-Protokolle.

Protocol

1. Die Aktivierung der Oberfläche Deckglas

1. Deckgläser (# 1.5, 22x40 mm) gereinigt werden mit einer Reihe von Seife und Ethanol wäscht in einem zuvor beschriebenen Protokoll (Waterman-Storer, 1998) zu reinigen und zu entstauben.
2. Legen Sie Deckgläser in einer Edelstahl-Halterung Rack, sind derart, dass Deckgläser beabstandet und berühren sich nicht.
3. In Laborabzug (Nitril-Handschuhe und Schutzbrille empfohlen), verdünnte voller Stärke 3-aminopropyltrimethoxysilan in Isopropanol zu einer Endkonzentration von 2% (2 ml Silan / 100 ml Isopropanol) zu einem Quadrat Glasschale (~ 350ml Volumen) füllen. Aufgrund Reaktivität mit Kunststoff, mit einem Glas Pasteur Pipette 3-Aminopropyltrimethoxysilan gelten für die Isopropanol.
4. Voll eintauchen Deckgläser von 1,2 in diese Lösung für 10 min unter leichtem Rühren auf einer Rührplatte im Abzug.
5. Wash Deckgläser durch Eintauchen in ddH ₂ O (4 Austausch von Wasser). Lassen Sie 10 min Einwirkzeit für die endgültige Austausch unter Rühren. Amino-Silan-haltigen Lösungen sollte als Sondermüll entsorgt werden.
6. Dry Deckgläser in Brutschrank bei warmen Temperaturen (~ 37 ° C) für 10 Minuten in einer staubfreien Umgebung.
7. Auf Raumtemperatur abkühlen.
8. In der Abzugshaube, rühren tauchen Deckgläser in 1% Glutaraldehyd-Lösung in ddH ₂ O in einem Glas Quadrat Gericht auf Platte für 30 Minuten.
9. Wash von 3 Austausch von ddH ₂ O für 10 Minuten pro Austausch unter Rühren. Entsorgen von Glutaraldehyd als gefährlicher Abfall.
10. Trocken bei Raumtemperatur, Abdecken mit Alufolie, um Staub vom Kleben an den Deckgläschen zu vermeiden.
11. An einem trockenen Ort, geschützt vor Staub, für bis zu 2 Monaten.

2. Vorbereitung von Polyacrylamid (PAA)-Gel

1. Stammlösungen von Acrylamid / Bisacrylamid-Mix aus 40% Acrylamid und 2% Bisacrylamid, folgende Tabelle 1. Wir unterhalten mehrere Lager-Lösungen, die für die PAA-Gele unterschiedlicher Steifigkeit optimiert werden; Beispiele sind in Tabelle 1 und 2 aufgeführt. Stammlösungen kann für mehrere Jahre aufbewahrt werden, solange sie in einem abgedunkelten Flasche bei 4 C gehalten
2. Working-Lösungen mit den endgültigen gewünschten Konzentrationen von Acrylamid / Bisacrylamid sind ab Lager Lösungen erhalten. Zum Beispiel bereiten wir eine funktionierende Lösung von 7,5% acrylamide/0.10% Bisacrylamid in ddH ₂ O für die Herstellung 2.8kPa PAA-Gelen.
3. Degas Acrylamid-Lösung in einer Vakuumkammer für 20 min, um Sauerstoff in die Lösung, die PAA Polymerisation verhindert zu reduzieren.
4. Bereiten Sie 10% Ammoniumpersulfat (APS)-Lösung (0.5g/5mL). Verwenden Sie frische arbeiten lieferbar innerhalb von 3 Tagen. Alternativ können Aktien eingefroren werden, um zu späteren Zeitpunkten verwendet werden.
5. Während Acrylamid Entgasung, wischen einem 1x3 "Mikroskop Objektträger aus Glas mit Regen-X wischt energisch auf Objektträger aus Glas Oberfläche hydrophob zu machen. Um überschüssige Regen-X zu entfernen, wischen Glasträger mit feuchten Kimwipe. Set Glasträger beiseite, abgedeckt.
6. Entfernen Acrylamid-Lösung aus der Vakuumkammer und fügen fluoreszierende Kügelchen (1 Vol-%, 5 ul für die funktionierende Lösung in Tabelle 1 aufgeführt). Add 0.75μl TEMED und 2,5 ul 10% APS, die Gel-Polymerisation zu initiieren wird. Gut mischen durch Pipettieren für ~ 5 sec, um die Einführung von Blasen zu minimieren,
7. Bewerben 10-12 ul des Acrylamid-Lösung von hydrophoben Objektträger (hergestellt in Schritt 2,4) und Platz aktiviert 22x40mm Deckglas auf der Oberseite des Tropfens. Gel-Lösung sollte Mantel gesamte Deckglas. Glätten Sie alle Blasen, die in der Lösung enthalten sein können. Lassen Sie das Gel-Lösung bei Raumtemperatur für ~ 10 min polymerisieren.
8. Der Abschluss der Polymerisation kann durch Umdrehen verbleibende Lösung in Mikrozentrifugenröhrchen beurteilt werden. Auch kann der polymerisierten Gel entfernt Deckglas Kanten ziehen. Unmittelbar nach dem makroskopischen Polymerisation beobachtet wird, trennen Sie die Deckglas vom Objektträger aus Glas. Mit der feinen Spitze einer Pinzette oder einer Rasierklinge Rand, entfernen Sie vorsichtig Deckglas, mit Gel angebracht, von Objektträger Oberfläche und tauchen Gel in ddH ₂ O, um die Hydrierung zu erhalten.

3. Coupling extrazellulären Matrix (ECM)-Proteine ​​an die PAA-Gel

Drei verschiedene Methoden verwendet, um ECM-Protein entweder Wert auf die Oberseite des PAA-Gel (3,1 und 3,2) oder die Aufnahme ECM-Protein im Gel Volumen (3,3) werden. Hier diskutieren wir die Kopplung von Fibronectin zu PAA-Gele in einer Oberfläche Ligandendichte das entspricht der Menge an Glas nach Inkubation adsorbiert mit 10 pg / mL Fibronektin-Lösung für 1 Stunde ist das Ergebnis. Überlegungen für die Wahl einer Methode sind in der Diskussion erläutert.

1. Die Vernetzung ECM-Protein auf PAA-Gel Oberfläche durch Sulfo-SANPAH reaktiven Amine auf Proteine ​​kovalent an die PAA-Gel Oberfläche durch die hetero-Cross-Linker Sulfo-SANPAH befestigt
   1. Bereiten Sie 40 ul arbeiten Aliquots von Sulfo-SANPAH durch Auflösen von S ulfo-SANPAH Pulver in wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO) (20 ul pro mg Sulfo-SANPAH). Flash-Freeze Aktien in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C für eine spätere Verwendung.
   2. Entfernen ddH ₂ O aus Gel Oberfläche mit einem Deckglas spinner (<2 Sek.). Vermeiden Sie das Trocknen des Gels.
   3. Verdünnen Sulfo-SANPAH-DMSO-Aliquots in ddH ₂ O (2mg/ml, pH 7) unmittelbar vor dem Gebrauch und Fell Geloberfläche (~ 200 ul). Beachten Sie, dass die Reaktivität Halbwertszeit von Sulfo-SANPAH kurz ist (~ 5 min) bei Raumtemperatur in Wasser, daher diese Schritte sollten in einem rasanten Tempo durchgeführt werden.
   4. Expose Geloberfläche mit UV-Licht in einem UV-Crosslinker Backofen (8W, 254 nm Wellenlänge, bei einem Abstand von 2-3 cm für 1,5 min). Sulfo-SANPAH wird in der Farbe von orange bis braun wechseln.
   5. Dip UV-behandelten Deckgläschen in ein Becherglas mit frischem ddH ₂ O, und entfernen Sie überschüssiges Wasser aus Gel-Oberfläche mit einem Deckglas spinner (<2 Sek.).
   6. Pipette ~ 50 ul kalten 1mg/ml Fibronektin (FN) (in PBS, pH 7,4) auf Parafilm in Petrischale Container. Invert Deckglas auf der FN fallen, ausgesetzt Gelseite zu FN.
   7. Reagieren bei Raumtemperatur für 1-2 Stunden oder bei 4 ° C über Nacht.
   8. Legen Sie Deckgläser in 6 cm Gewebekulturschalen mit PBS (pH 7,4), reicht zur Deckung Deckglas, unter sterilen Bedingungen in Zellkultur Kapuze.
   9. Wash ausführlich mit mehreren Wäschen (3-5) von PBS (pH 7,4), unter sterilen Bedingungen.
   10. Sterilisieren der Deckgläser durch die Verwendung von Entkeimungslampe in Gewebekultur Haube für 30 min.
   11. Inkubieren Deckgläser in Zelle Medien für 30-45 min vor dem Beschichten Zellen.
2. Die Vernetzung ECM der PAA-Gel Oberfläche von Hydrazinhydrat Kohlenhydrate Gruppen auf Proteinen oxidiert werden und mit dem Gel unter Verwendung von Hydrazinhydrat.
   1. Bereiten Polyacrylamidgelen, wie in Abschnitt 2 beschrieben.
   2. Legen Sie PAA-Gel Deckgläser in Kunststoff-Petrischale in einem Abzug und mit Handschuhen Pipette ca. 1 ml der unverdünnten Hydrazinhydrat auf die Oberfläche eines jeden PAA-Gel und Inkubation für mindestens zwei Stunden, aber nicht länger als 24 Stunden
   3. Add ddH ₂ O auf die Petrischale entfernen Hydrazinhydrat-Lösung und als gefährlicher Abfall zu entsorgen.
   4. Add 5% Essigsäure auf die Petrischale auf Deckglas einzutauchen. Cover und inkubieren für eine Stunde.
   5. Entfernen Sie die Essigsäure und wäscht mit ddH ₂ O. Inkubieren in ddH ₂ O für eine Stunde. Die Deckgläser sind nun aktiviert und bereit zu vernetzen Fibronektin (FN) oxidiert.
   6. Verdünnen Sie 10 ul 1 mg / ml FN-Lösung in 940 ul 50 mM Natriumacetat-Puffer (pH 4,5) in einem dunklen Mikro-Zentrifugenröhrchen, so dass eine Endkonzentration von 10 ug / ml.
   7. Machen Bestand von 20X Natrium-meta-Perjodat durch Zugabe von 80 mg Natrium-meta-Perjodat zu 1 ml 50 mM Natriumacetat-Puffer (pH 4,5).
   8. Add 50 ul 20fach Natrium-meta-Perjodat Lager an die FN-Lösung in 3.2.6 vorbereitet, so dass endgültige Arbeitskonzentration 10 pg / ml FN und 4 pg / ml Natrium-meta-Perjodat. Inkubieren im Dunkeln Röhrchen bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
   9. Entfernen Sie überschüssiges ddH ₂ O aus aktivierten Gel-Oberfläche in 3.2.5 unter Verwendung eines Deckglases spinner (<2 Sek.). Vermeiden Sie das Trocknen des Gels.
   10. Pipet ~ 500 ul der FN-Lösung auf aktivierte Gel-Oberfläche und Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
   11. Legen Sie Deckgläser in Schalen mit PBS (pH 7,4), genug, um Deckglas abdecken.
   12. Wash ausführlich mit mehreren Wäschen (3-5) von PBS (pH 7,4).
   13. Sterilisieren der Deckgläser durch die Verwendung von Entkeimungslampe in Gewebekultur Haube für 30 min.
   14. Inkubieren Deckgläser in Zelle Medien für 30-45 min vor dem Beschichten Zellen.
3. Bulk-Konjugation von ECM-Protein in PAA-Gel durch Acryloyl-X, Succinimidylester Dieses Protokoll wird vor 2.5 getan. Reaktiven Amine auf Proteine ​​sind eine Acrylamidmonomer mit NHS-Ester-Chemie gekoppelt und dann in den Hauptteil der PAA-Gel co-polymerisiert.
   1. Konjugat ECM-Protein der Wahl, um Acryloyl-X pro Anweisungen des Herstellers. Stammlösungen von konjugierten Protein bei 4 ° C gelagert werden
   2. Berechnen Sie das Volumen des PAA funktionierende Lösung für Gel-Herstellung (z. B. 10 uL pro Deckglas) erforderlich.
   3. Subtrahieren 50 ul (zB 10% Volumen) von Wasser aus Menge in der Arbeitslösung Rezept in Tabelle 1 aufgelistet und die Polymerisation.
   4. Entfernen Sie Volumen in 3.3.2 berechnet und fügen ECM / Acryloyl-X-Lösung zu 10% Volumen. (Z. B. 1 ul ECM / Acryloyl-X 9 ul PAA-Lösung). Dieser Schritt sollte zügig durchgeführt werden, wie Gel polymerisiert.
   5. Führen Sie die Schritte 2,6 und 2,7, wie vorher beschrieben.
   6. Wash ausführlich mit mehreren Wäschen (3-5) von PBS (pH 7,4), unter sterilen Bedingungen.
   7. Sterilisieren der Deckgläser durch die Verwendung von Entkeimungslampe in Gewebekultur Haube für 30 min.
   8. Inkubieren Deckgläser in Zelle Medien für 30-45 min vor dem Beschichten Zellen.

le "> 4. Loading Deckglas in konfokale Bildgebung Kammer

Diese Schritte werden durchgeführt, nachdem die Zellen haben es bereits auf ECM-beschichteten Substrat-Gel (~ 6-12 Uhr) zu verbreiten. Zur Montage der konfokalen Imaging-Kammer (RC-30WA), ist es sinnvoll, die Warner Instruments Website zu Rate ziehen.

1. Warm Zelle Medien-und 0,5% oder 0,25% Trypsin und laden zu einem 5ml oder 10ml Spritze.
2. Laden Sie ein 22x30mm Deckglas auf die Top Deckglas Inhaber eines Warner Instruments konfokalen Imaging-Kammer (RC-30WA) mit Vakuum-Fett auf das Deckglas in Position zu halten.
3. Legen Sie eine Kammer bilden, Gummidichtung auf der Oberseite des Deckglases, wodurch der Zugriff auf Ein-und Austritt PE-Rohre. Damit können in einem Abstand von 150-1000 um zwischen dem oberen Deckglas und der Gel-beschichteten 22x40mm Deckglas, abhängig von der Größe der Dichtung verwendet.
4. Laden Spritzen auf Zulaufschlauch über Anschluss-Kit, und überprüfen Sie, dass Medien durch Schläuche und auf Top Deckglas fließt und keine Blasen in den Stromlinien sichtbar.
5. Bewerben Vakuumfett auf Basis der Kammer-und Last-Gel-beschichteten 22x40mm Deckglas, Zell-Seite nach oben. Bewerben warme Medien Zellen.
6. Legen Sie Top Deckglas den Halter an die Kammer Basis, mit Kammer Dichtung trennt sie vom Gel-beschichteten Deckglas. Stellen Sie sicher, dass die Zentrierstifte in der Kammer Basis innerhalb der Aufnahmebohrungen in den Top Deckglas sitzen.
7. Übernehmen Sie die Druckplatte in die Kammer Basis und die Druckplatte Schraubenschlüssel die Schraube in und sichern Sie die Druckplatte.
8. Überprüfen Sie den Fluss der Medien durch den Schlauch und Kammer, um mögliche Leckagen innerhalb der Kammer zu überprüfen und sämtliche Medien-freie Zonen auf der Zelloberfläche zu beseitigen. Hinweis: mit einem kleinen Nadel, um ein leichtes Vakuum ziehen, während die Infusion mit Medien helfen bei der Vermeidung Medien-freie Zonen.
9. Übernehmen Sie die konfokale Bildgebung Kammer auf die Bühne Adapter in einem Mikroskop Halter für die Bildgebung entfernt.
10. Bild fluoreszenzmarkierten Protein und fluoreszierende Kügelchen innerhalb des Gels Substrat auf einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop eingebettet.
11. Um ein Bild des unbelasteten Sicke Positionen innerhalb des Gels, perfuse Trypsin, zelluläre Adhäsionen aus dem Gel zu lösen, und nehmen Sie ein Bild der fluoreszierende Kügelchen in die gleiche Bildfeld, wo die Zelle eingehalten werden. Vergleich von gespannten und ungespannten bead Positionen ermöglicht die Quantifizierung von Gelsubstrat Verschiebung unter Kontraktion.

Repräsentative Ergebnisse:

Das obige Protokoll beschreibt die experimentellen Verfahren zur Herstellung konform PAA-Gele zur Untersuchung von Zell Kontraktilität und ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Gel-Oberfläche mit diesem Protokoll erhalten ist relativ flach und glatt, mit fluoreszierenden Beads gleichmäßig eingebettet sind (Abbildung 2A).

Wenn die Messung Gel Kontraktion an der Stelle des fokalen Adhäsionen, die Abbildung der Zelle (Abb. 3a) und Gel-Oberfläche (Abbildung 3B) sollte bei der konfokalen optischen Ebene der fokalen Adhäsionen durchgeführt werden. Die Kontraktion eines Gels kann durch Verschieben der embedded fluoreszierende Kügelchen (Abbildung 3B) visualisiert an der Gel-Oberfläche, wenn die Zellen adhärent (angespannte) versus freistehende (spannungsfreie) sind. Der Einsatz von Computer-Algorithmen können Ertrag Traktion betont mit Sicke Verschiebung und entsprechende Elastizitätsmodul des Gels (Abb. 3C und 3D) (Sabass et al., 2008) verbunden. Wenn Bildgebung erfolgt tiefer in das Gel, dann bead Verschiebungen werden kleiner und nicht repräsentativ für Zugkräfte an fokalen Adhäsionen ausgeübt.

Abbildung 1. Schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus. Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, kompatible Matrizen für die Zwecke des Studiums zellulären Kontraktion zu erzeugen. Der erste Schritt der experimentellen Verfahrens ist es, Deckgläser von amino-silane/glutaraldehyde Behandlung zum Zwecke der Verankerung polymerisierten Gels zu aktivieren. Der zweite Schritt ist, um ein Polyacrylamidgel polymerisieren, enthält fluoreszierende Kügelchen, auf die aktivierte Deckglas. Der dritte Schritt beinhaltet die chemische Vernetzung der extrazellulären Liganden an der Oberfläche der Polyacrylamidgel mit einem der drei Kopplungstechniken in Schritt 3 aufgeführt. Die Zellen werden dann auf das Gel überzogen und erlaubt zu haften und zu verbreiten. Unter aktiven zellulären Kontraktion verdrängen Perlen in das Gel eingebettet.

Abbildung 2. Optical konfokalen Scheibe Oberseite PAA-Gel, wie visualisiert (A.) fluoreszierende 40nm Perlen im Gel eingebettet und (B) Fibronektin Immunfluoreszenz.

Abbildung 3. Repräsentatives Ergebnis für eine Zugkraft Experiment. (A.) fokalen Adhäsionen in einer menschlichen Osteosarkom U2OS Zelle marked von GFP-Paxillin und (B) Positionen der fluoreszierende Kügelchen in die PAA-Gel zugrunde liegenden fokalen Adhäsionen in der angespannten (grün) und ungedehnten (rot) Staaten eingebettet. Die Pfeile zeigen die Beispiele von bead Verschiebung. (C) Traction Spannungsvektoren und (D.) entsprechende Wärme-Karte im Maßstab von Traktion Spannungen aus der Kontraktion des Gels abgeleitet, mit Computer-Algorithmen (Sabass et al., 2008). Balken = 5 um.

Tabelle 1:

Beispiel Lager-und Arbeitsbedingungen PAA-Lösungen (Data in Tabelle 1 wurde erstmals von Yeung et. Al. Und unabhängig in unserem Labor bestätigt werden.)

Lager PAA-Lösung
Schubmodul der PAA-Gel (Pa)	230	2833	8640	16344
40% Acrylamid (ml)	1,25	3,12	2,34	2,50
2% Bisacrylamid (ml)	0,50	0,83	1,88	0,60
Wasser (ml)	3,25	1,04	0,78	1. 90
Gesamtvolumen (ml):	5	5	5	5

Working PAA-Lösung
Stammlösung verwendet (Pa)	230	2833	8640	16344
Stammlösung Volume (ul)	150	150	200	300
Water (ul)	341,75	341,75	291,75	191,75
Perlen (ul)	5	5	5	5
TEMED (ul)	0,75	0,75	0,75	0,75
10% APS (ul)	2,5	2,5	2,5	2,5
Gesamtvolumen (ul):	500	500	500	500
Finale Acrylamid%	3	7,5	7,5	12
Abschließende Bis-Acrylamid%	0,06	0,1	0,3	0,15

Tabelle 2:

Schubmodul der PAA Substrate verschiedener letzten Acrylamid und Bisacrylamid Prozentsätze

12% Acrylamid			7,5% Acrylamid
% Bis-Acrylamid	Schubmodul (Pa)		% Bis-Acrylamid	Schubmodul (Pa)
0,145	16344		0,01	689
0,28	30067		0,03	1535
0,45	34263		0,05	2286
0,55	42375		0,075	2833
0,575	50873		0,1	4069
0,6	55293		0,2	5356
			0,3	8640
5% Acrylamid			3% Acrylamid
% Bis-Acrylamid	Schubmodul (Pa)		% Bis-Acrylamid	Schubmodul (Pa)
0,05	430		0,02	1,3
0,075	600		0,04	54
0,1	1431

Discussion

Das hier beschriebene Verfahren für den Aufbau einer Zugkraft-Mikroskopie (TFM) Experiment, zusammen mit der Umsetzung der Computational Tracking-Routinen (Sabass et al., 2008), ermöglicht die Quantifizierung von zellulären Kräfte mit Mikrometer-Skala räumlicher Auflösung. Zur Optimierung der experimentellen Protokoll, ist es entscheidend, eine reine und gleichmäßige Gelsubstrat mit gleichmäßigen Beschichtung von ECM-Liganden zu bilden. Wir diskutieren mögliche Fallstricke unter:

Non-Uniform Geloberfläche oder Tears:

Nach unserer Erfahrung gibt es mehrere Schritte, die kritisch auf die Bildung eines schönen Uniform Gel erscheinen. Wenn Ihr Geloberfläche scheint dunkle Löcher in sie haben, ist es wahrscheinlich, dass überschüssiges Regen-X Tröpfchen nicht vollständig von der Glasscheibe entfernt, bilden eine unebene hydrophobe Oberfläche für Ihre Gel gegen polymerisieren. Auch wir haben festgestellt, dass für extrem weiche Gele (<100 Pa), die Gel-Oberfläche höchst uneinheitlich fällig zum Quellen der adhärenten PAA-Gel auf das Deckglas Oberfläche; eine Möglichkeit, diesen Effekt zu minimieren, ist das Wasser mit einem geeigneten Puffer ersetzen so dass osmotische Druck von Gelpolymerisation zu bildgebenden gepflegt.

Risse oder Risse in der Gel-Oberfläche können aus mehreren Gründen auftreten. Wenn Gelpolymerisation ist nicht vor der Deckglas-slide-Sandwich Demontage abgeschlossen, kann dies zu großen Brüchen oder Rissen führen. Zu viel Haftung auf dem Objektträger aus Glas (dh Beseitigung des Regen-X-Beschichtung) oder zu schwach Haftung auf dem Deckglas Oberfläche (dh Probleme mit der Aktivierung Schritt Deckglas Oberfläche oder halten aktiviert Deckgläschen in einer staubigen Umgebung) können auch große Risse oder Blei Risse in der Oberfläche. Schließlich, wenn die PAA-Gel entwässert, während sich in dem Deckglas / Dia-Sandwich, Tränen sind eher auftreten und Risse können visualisiert werden über die Gel-Oberfläche. Diese Probleme werden häufiger bei der Arbeit mit Gele mit <1 kPa Steifigkeit. Tränen oder Rips kann oft durch geringe Vergrößerung (10-20x) Phasenkontrast-Abbildung des Gels (dh auf einer Gewebekultur Mikroskop) vor ECM-Kopplung identifiziert werden.

Wahl der ECM-Kupplung:

Bulk-Aufnahme von ECM-konjugiert Acryloyl-X ist bei weitem die einfachste Methode zur Ausführung (Reinhart-King et al., 2005). Wir haben bestätigt, dass der Einbau ECM / Acryoyl-X mit 10% Volumenanteil nicht auswirken PAA-Gel Steifigkeit. Zwei Vorteile dieser Technik sind: (1), wie hier beschrieben, verwendet es die geringste Menge an ECM-Protein so dass es optimal für Situationen, in denen die ECM-Protein ist teuer und (2) den Großteil Konjugation erleichtert auch die Herstellung von Gelen mit sehr großen Fläche, die wir zu beschichten großen Glasplatten mit einer PAA-Gel für Western Blot oder RT-PCR-Experimente verwendet wurden. Zwei Einschränkungen mit dieser Technik sind, dass die Änderungen in einer Gesamtmenge von Oberflächen-Liganden zur Verfügung (wir haben Flächendichte von Ligand zu 10% Volumenanteil sättigen gefunden), und dass einige Proteine, wie Kollagen, nicht in das Gel enthalten in einem homogenen Weise aufgrund ihrer Neigung, sich spontan zu polymerisieren.

Coupling Protein auf der PAA-Gel Oberfläche mit Hydrazinhydrat bietet die größte Auswahl in Ligandendichte, sondern auch die am schwierigsten auszuführen. Wir haben festgestellt, dass die Flächendichte von Fibronektin signifikant kann durch Veränderung der Konzentration der oxidierten Fibronektin-Protein (1 bis 50 pg / mL), so dass Ligand verfügbar genau abgestimmt werden kann verändert werden. Bei ausreichend hohen Konzentrationen von Fibronektin und Natrium-meta-Perjodat in der Oxidationsreaktion kann das Fibronektin aggregieren und stark behindern die Abscheidung einer einheitlichen Schicht des Proteins. Sorgfältige Tests, wie im nächsten Abschnitt gezeigt wird benötigt, um die Abscheidung der gewünschten Menge und Qualität des Proteins zu gewährleisten. Wir haben auch diese Chemie in Verbindung mit Mikro-Kontakt Drucken von ECM-Proteinen, die räumliche Verteilung von Liganden (Stricker et al., 2010) Kontrolle eingesetzt. Ein weiterer Vorteil dieser Kupplung ist, dass es deutlich (100x) niedrigere Konzentrationen von ECM-Liganden in der Kupplung Schritt erfordert, um in einer ähnlichen Oberflächendichte Ergebnis, so dass weniger ECM-Protein ist nicht erforderlich. Nachteile dieser Technik sind der Zeitaufwand und der Mangel an geeigneten Kohlenhydrat-Gruppen, die für die Oxidation von einigen Proteinen.

Die Methode der Kopplung der PAA-Gel Oberfläche mit sulfo-SANPAH ist robust und wir haben es zu koppeln verwendet eine zahlreiche Reihe von Proteinen in PAA-Gel Oberflächen. Der bedeutendste Nachteil ist, dass eine sehr hohe Konzentration von ECM-Protein während der Konjugation Schritt (1 mg / mL) und die Ergebnisse in eine moderate Menge an der Oberfläche zur Verfügung Liganden erforderlich ist. Somit kann diese Methode des Verbrauchs von einer sehr hohen Menge an ECM-Protein führen. Ein weiterer Fallstrick kann eine schlechte Kopplung durch den Verlust der Reaktivität von sulfo-SANPAH aufgrund schlechter werdenLagerung oder Zeitverzögerungen bei der Zubereitung. Allerdings sind diese Unstimmigkeiten minimal mit der hier beschriebenen Methode.

Bestätigung und Quantifizierung der zur Verfügung stehende Oberfläche Ligand:

Um zu bestätigen, die Dichte von Protein-Ligand auf der Gel-Oberfläche haben wir genutzt gegen Fibronektin (Abbildung 2B) oder Kollagen Immunfluoreszenz und haben im Vergleich der Intensität der Bilder von der Gel-Oberfläche gegen eine Reihe von Standards für die (eine Reihe von Fibronektin Konzentrationen auf Glas adsorbiert ). Weitere quantitative Maßnahmen können durch radioaktive Markierung (Rajagopalan et al., 2004) durchgeführt werden. Die ECM-Protokolle beschreiben hier Methoden, um Gele, die ungefähr die gleiche Flächendichte von Fibronektin als eine haben fabrizieren würde durch Adsorption 10 pg / mL Fibronektin auf einer unbehandelten Deckglas für 1 Stunde bei Raumtemperatur erhalten. Dies ist ausreichend für die meisten Zellen, um sich gut eingehalten und zu verbreiten. Dies ist die maximale Oberflächendichte erhielten wir mit sulfo-SANPAH oder AcryoylX Methoden haben, höhere Oberflächendichten kann mit der Hydrazinhydrat-Methode gewonnen werden.

Schlechte Kupplung kann durch unsachgemäße Handhabung und anschließende Verlust der Reaktivität von sulfo-SANPAH und Acryloyl-X führen. Darüber hinaus ist es wichtig, den pH-Wert der extrazellulären Matrix-Protein von rund 7,0 zu halten, wenn Sie sulfo-SANPAH oder Acryloyl-X als Vernetzer, um eine ordnungsgemäße Vernetzung der PAA-Gel. Auch bei der Oxidation Schritt der Hydrazinhydrat-Protokoll haben wir festgestellt, dass höhere Konzentrationen von Natriummetaperiodat als der Betrag, den hier empfohlenen Ertrag große Aggregate von Proteinen, die nicht paar gleichmäßig auf die Gel-Oberfläche.

Bitte beachten Sie, dass die Zellen länger dauern kann, sich auszubreiten und auf Soft-Gel Oberflächen haften, als man früher mit Gewebekulturen aus Kunststoff oder Glas Deckgläser arbeiten werden.

Reproduzierbarkeit der Gel Steifigkeit:

Das Gel Rezepte hier beschriebenen Ertrag Gele mit einer extrem reproduzierbare Steifigkeit im Laufe von vielen Jahren in verschiedenen Laboren und mehrere Hände, die unabhängig Gel Steifigkeit haben bestätigt, mit Bulk-Rheologie. Dennoch ist es ratsam, Gel Steifigkeit durch Rheologie Methoden zu bestätigen. Beachten Sie, dass die Steifigkeit berichtet hier der Schubmodul, nicht der Elastizitätsmodul ist. Die beiden Werte werden durch E verwandten = 2G (1 + υ), wobei E der Elastizitätsmodul, G der Schubmodul und υ ist die Poissonzahl des Materials.

Das Vorhandensein von Sauerstoff und Schadstoffen in Puffern oder Labor Wasser, wie Metalle und Nicht-Puffer-Ionen hemmen können Acrylamid Polymerisation, was zu inkonsistenten Ergebnissen. Darüber hinaus sollte die 5 ml Stammlösung ausreichen, um die Herstellung von Tausenden von Gelen im Laufe des Experiments zu erleichtern und somit zu minimieren Widersprüchlichkeiten. Dennoch ist es ratsam, Gel Steifigkeit durch Rheologie Methoden zu bestätigen.

Auswirkungen auf die ECM-Kopplung auf Gel-Steifigkeit:

Wir haben bestätigt, dass Bulk-Konjugation von ECM Proteinen unter Verwendung von Acroyl-X ändert nichts an der Steifigkeit der PAA-Gele. Andere haben bestätigt, dass die Konjugation mit sulfo-SANPAH hat keinen Einfluss auf lokale Steifigkeit (Engler et al., 2004).

Wahl der Korngröße:

Wir haben 40 nm Kügelchen gefunden, um eine optimale Korngröße auf die Verwendung von High-Density von Perlen zu erleichtern, wie es in unserer repräsentatives Bild gezeigt. Diese Kügelchen sind hell genug, um Bildgebung mit beiden weites Feld und konfokale Mikroskopie zu erleichtern, aber nicht zu groß, um einen messbaren Effekt auf die Steifigkeit der Polyacrylamidgel haben. Zur Erleichterung der Bildgebung, können größere Perlen verwendet werden.

Nützliche Anwendungen von Traction Force Mikroskopie (TFM):

Die Anwendungen der konformen Hydrogele und TFM sind breit gefächert. Wir und andere haben dieses Protokoll verwendet, um viele Aspekte der zellulären Differenzierung, Proliferation, Migration und Kontraktion sowie fokale Adhäsion Montage, Wartung und Demontage zu studieren. Pharmakologische Wirkstoffe, die entweder hemmen oder zu aktivieren Protein-Aktivität in Verbindung mit TFM verwendet worden, um die Rolle von spezifischen Proteinen auf zellulärer Zugkräfte zu untersuchen. Darüber hinaus können die kinetischen Eigenschaften von Proteinen unter Verwendung von fluoreszierenden Speckle-Mikroskopie (Gardel et al., 2008) oder Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) beurteilt werden und korreliert, um Zugkräfte. Darüber hinaus ist die Anwendung von siRNA für den Einfluss von Protein Knockdown auf Zugkraft Anstrengung Sonde auch eine nützliche Methode, um die Rolle von spezifischen Proteinen in zellulären Veränderung biophysikalischen Eigenschaften zu beurteilen. Insgesamt ergibt die Kombination von TFM mit hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie eine starke Annäherung an dynamischen und mechanischen Eigenschaften der Zelle zu korrelieren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-aminopropyltrimethyoxysilane	Aldrich	28, 177-8
40% Acrylamide	Bio-Rad	161-0140
2% Bis-acrylamide	Fisher Scientific	BP1404
TEMED	Fisher Scientific	BP 150-20
Ammonium persulfate	Fisher Scientific	BP179
40nm fluorescent micro-spheres	Invitrogen	F8789
Sulfo-SANPAH	Pierce, Thermo Scientific	22589
Confocal imaging chamber (RC-30)	Warner Instruments	64-0320
Coverslip spinner	Home made	NA
Ultraviolet lamp CL1000	UVP Inc.	95-0228-01
Stainless steel rack	Electron Microscopy Sciences	72239-04
acryloyl-X, SE (6-((acryloyl)amino)hexanoic acid)	Invitrogen	A-20770
Hydrazine hydrate	Sigma-Aldrich	225819
Sodium meta-periodate	Thermo Fisher Scientific, Inc.	20504
Isopropanol	Fisher Scientific	A416-4
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F2006
Collagen	BD Biosciences	354236
Coverslips (#1.5)	Corning	2940‐224
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16120
Rain-X	SOPUS Products	www.rainx.com
Acetic Acid	Acros Organics	64-19-7