Summary
इस वीडियो में, हम प्रयोगात्मक आज्ञाकारी, बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) लेपित substrates सेल संस्कृति के लिए उपयुक्त बनाना करने के लिए इस्तेमाल किया तकनीकों का प्रदर्शन, और जो कर्षण शक्ति माइक्रोस्कोपी करने के लिए उत्तरदायी हैं और सेल के व्यवहार पर ECM कठोरता के प्रभाव को देख.
Abstract
सेलुलर आसंजन के बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) विनियमन सेल प्रवास और ECM remodeling के लिए आवश्यक है. फोकल adhesions macromolecular विधानसभाओं कि सिकुड़ा एफ actin ईसीएम के लिए cytoskeleton जोड़े हैं. इस संबंध intracellular यांत्रिक बलों के कोशिका झिल्ली भर में अंतर्निहित सब्सट्रेट करने के लिए प्रसारण के लिए अनुमति देता है. हाल ही में काम दिखाया गया है ईसीएम के यांत्रिक गुणों फोकल आसंजन और एफ actin आकारिकी के रूप में अच्छी तरह के रूप में सेल भेदभाव, विभाजन, प्रसार और प्रवास सहित कई शारीरिक प्रक्रियाओं को विनियमित. इस प्रकार, सेल संस्कृति substrates के उपयोग में तेजी से प्रचलित विधि को ठीक नियंत्रण और ईसीएम यांत्रिक गुणों मिलाना बन गया है.
एक पक्षपाती कक्ष में फोकल adhesions पर कर्षण बलों यों, आज्ञाकारी substrates उच्च संकल्प इमेजिंग और एक विधि करार दिया कर्षण शक्ति माइक्रोस्कोपी (TFM) में कम्प्यूटेशनल तकनीकों के साथ संयोजन के रूप में किया जाता है. इस तकनीक को स्थानीय परिमाण और सब्सट्रेट विकृतियों की दिशा सेलुलर संकुचन द्वारा प्रेरित के माप पर निर्भर करता है. Fluorescently टैग प्रोटीन का उच्च संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में, यह संभव है cytoskeletal और कर्षण बलों के साथ संगठन remodeling के सहसंबंधी.
यहाँ हम एक अच्छी तरह से विशेषता, tunable यांत्रिक कठोरता, जो सेलुलर संकुचन को मापने के लिए उपयुक्त है के साथ एक सेल संस्कृति सब्सट्रेट बनाने के उद्देश्य के लिए दो आयामी, आज्ञाकारी matrices की तैयारी के लिए एक विस्तृत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल उपस्थित थे. ये प्रोटोकॉल polyacrylamide hydrogels के निर्माण, ऐसे जैल पर ECM प्रोटीन की कोटिंग, जैल पर चढ़ाना कोशिकाओं, और उच्च संकल्प confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर एक छिड़काव चैम्बर शामिल हैं. इसके अतिरिक्त, हम स्थान और सेलुलर उद्धृत TFM प्रोटोकॉल का उपयोग बलों के परिमाण का प्रदर्शन डेटा के एक प्रतिनिधि नमूने प्रदान करते हैं.
Protocol
1. Coverslip सतह को सक्रिय
- Coverslips (# 1.5, 22x40 मिमी) एक पहले से वर्णित प्रोटोकॉल (डांडी स्तोरेर, 1998) में साबुन और इथेनॉल washes के एक श्रृंखला का उपयोग करने के लिए स्वच्छ और धूल हटाने के लिए साफ कर रहे हैं.
- एक स्टेनलेस स्टील धारक के रैक में रखें coverslips, कि इस तरह coverslips अलग स्थान दिया गया है और नहीं छू.
- रासायनिक धूआं हुड (nitrile दस्ताने और काले चश्मे की सिफारिश), 2% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए isopropanol में पूर्ण 3 aminopropyltrimethoxysilane ताकत को कमजोर (2ml silane 100 / एमएल isopropanol) के लिए एक वर्ग गिलास पकवान (~ 350ml मात्रा) को भरने के. प्लास्टिक के साथ जेट के कारण, एक गिलास पाश्चर विंदुक का उपयोग करने के लिए isopropanol के लिए 3-aminopropyltrimethoxysilane लागू.
- पूरी तरह से 10 मिनट के लिए इस समाधान में 1.2 से विसर्जित coverslips जबकि धीरे धूआं हुड में एक हलचल प्लेट पर क्रियाशीलता.
- DDH 2 हे (पानी की 4 एक्सचेंजों) में डुबो कर coverslips धो लें. 10 मिनट सरगर्मी के साथ अंतिम आदान - प्रदान के लिए समय भिगोने की अनुमति दें. एमिनो - silane युक्त समाधान खतरनाक कचरे के रूप में निपटाया जाना चाहिए.
- इनक्यूबेटर में गर्म तापमान पर ड्राई coverslips (~ 37 डिग्री सेल्सियस) एक धूल मुक्त वातावरण में 10 मिनट के लिए.
- कमरे के तापमान को शांत.
- धूआं हुड, DDH 2 हे एक गिलास वर्ग डिश में 1% glutaraldehyde समाधान में पर विसर्जित कर coverslips 30 मिनट के लिए थाली हलचल.
- DDH 2 हे 3 एक्सचेंजों द्वारा विनिमय प्रति 10 मिनट के लिए सरगर्मी के साथ धोएं. खतरनाक कचरे के रूप में glutaraldehyde को फेंक.
- कमरे के तापमान पर सूखी, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर coverslips करने के लिए चिपके से धूल से बचने के.
- एक सूखी जगह में स्टोर, धूल से दूर 2 महीने के लिए.
2. Polyacrylamide की तैयारी (Paa) जेल
- 40% acrylamide और 2% बीआईएस acrylamide तालिका 1 के बाद से मिश्रण / बीआईएस - acrylamide acrylamide के शेयर समाधान तैयार करें. हम कई शेयर समाधान है कि अलग कठोरता के Paa जैल के लिए अनुकूलित कर रहे हैं को बनाए रखने, उदाहरण तालिका 1 और 2 में सूचीबद्ध हैं. शेयर समाधान कई वर्षों के लिए रखा जा सकता है, के रूप में लंबे समय के रूप में वे एक अंधेरे बोतल में 4 सी. में रखा जाता है
- कार्य acrylamide / बीआईएस - acrylamide के अंतिम वांछित सांद्रता युक्त समाधान शेयर समाधान से प्राप्त कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, हम 2.8kPa Paa जैल बनाने के लिए 7.5 acrylamide/0.10% DDH 2 हे% बीआईएस - acrylamide का एक काम समाधान तैयार करते हैं.
- देगास 20 मिनट के लिए एक निर्वात चैम्बर में acrylamide समाधान, समाधान है जो Paa polymerization रोकता के भीतर ऑक्सीजन कम.
- 10% अमोनियम persulfate (ए पी एस) समाधान (0.5g/5mL) तैयार करें. 3 दिनों के भीतर नए सिरे से काम कर रहा शेयर का प्रयोग करें. वैकल्पिक रूप से, शेयरों को बाद की तारीखों में इस्तेमाल किया जा जमे हुए किया जा सकता है.
- जबकि acrylamide degassing है, वर्षा - एक्स पोंछे के साथ एक 1x3 "खुर्दबीन गिलास स्लाइड सख्ती पोंछ गिलास स्लाइड सतह hydrophobic अधिक वर्षा एक्स निकालने के लिए, नम Kimwipe के साथ कांच स्लाइड पोछ लो. तरफ गिलास स्लाइड सेट, कवर..
- निर्वात चैम्बर से acrylamide समाधान निकालें और फ्लोरोसेंट मोती जोड़ने (मात्रा से 1%, काम तालिका 1 में सूचीबद्ध समाधान के लिए 5 μl). जोड़ें 0.75μl TEMED और 2.5 μl% 10 ए पी एस, जो जेल polymerization आरंभ हो जाएगा. ~ 5 सेकंड के लिए pipetting द्वारा अच्छी तरह मिक्स, बुलबुले की शुरूआत के कम से कम,
- Acrylamide हाइड्रोफोबिक माइक्रोस्कोप (2.4 चरण में तैयार) स्लाइड और जगह छोटी बूंद के शीर्ष पर 22x40mm coverslip सक्रिय करने के लिए समाधान के 10-12 μl लागू करें. जेल समाधान कोट पूरे coverslip चाहिए. किसी भी बुलबुले कि समाधान के भीतर प्रकट हो सकता है चिकना. जेल ~ 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर polymerize समाधान की अनुमति दें.
- polymerization के पूरा inverting microcentrifuge ट्यूब में शेष काम कर समाधान के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. इसके अलावा, polymerized जेल coverslip किनारों से दूर खींच सकता है. तुरंत बाद macroscopic polymerization मनाया जाता है, तो गिलास स्लाइड से अलग coverslip. चिमटी की एक जोड़ी या एक रेजर ब्लेड बढ़त के ठीक टिप का उपयोग करना, ध्यान से coverslip निकालने के लिए, जेल संलग्न के साथ, खुर्दबीन स्लाइड सतह और DDH 2 हे में विसर्जित कर जेल से, जलयोजन बनाए रखने.
3. Paa जेल बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन (ईसीएम) युग्मन
तीन अलग तरीकों Paa जेल के ऊपर सतह (3.1 और 3.2) या जेल की मात्रा (3.3) के भीतर ECM प्रोटीन को शामिल ECM प्रोटीन या तो संलग्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ, हम Paa जैल fibronectin युग्मन चर्चा के लिए एक सतह ligand घनत्व है कि 10 / 1 घंटे के लिए μg एमएल fibronectin समाधान के साथ कांच पर ऊष्मायन के बाद adsorbed राशि के बराबर है में परिणाम. एक विधि को चुनने के लिए विचारणीय बातें चर्चा में विस्तृत रहे हैं.
- क्रॉस जोड़ने Paa जेल सतह के लिए प्रोटीन पर Sulfo SANPAH प्रतिक्रियाशील amines द्वारा ECM प्रोटीन covalently heterobifunctional पार linker Sulfo - SANPAH द्वारा Paa जेल सतह करने के लिए संलग्न
- एस भंग करके 40 Sulfo SANPAH के μl काम aliquots की तैयारी निर्जल डाइमिथाइल sulfoxide में पाउडर ulfo SANPAH (DMSO) (Sulfo SANPAH के मिलीग्राम प्रति 20 μl). फ्लैश और -80 में तरल नाइट्रोजन की दुकान में फ्रीज शेयरों डिग्री सेल्सियस बाद में उपयोग के लिए.
- जेल coverslip स्पिनर (<2sec) का उपयोग कर सतह से DDH 2 हे निकालें. जेल सुखाने से बचें.
- तुरंत का उपयोग करें और कोट जेल सतह (~ 200 μl) से पहले DDH 2 हे (2mg/ml, पीएच 7) में Sulfo SANPAH - DMSO aliquots पतला . ध्यान दें कि आधा जीवन Sulfo SANPAH के जेट कम पानी में कमरे के तापमान पर (~ 5 मिनट) है, इसलिए, इन चरणों का एक तीव्र गति से किया जाना चाहिए.
- यूवी प्रकाश के लिए एक यूवी पार linker ओवन (8W, 254 एनएम तरंगदैर्ध्य 1.5 मिनट के लिए 2-3 इंच की दूरी पर) में जेल सतह बेनकाब. Sulfo SANPAH रंग में नारंगी से भूरे रंग बदल जाएगा.
- ताजा DDH 2 हे के साथ एक बीकर में डुबकी यूवी इलाज coverslips और जेल coverslip स्पिनर (<2sec) का उपयोग कर सतह से अतिरिक्त पानी निकालने के.
- ~ Parafilm पर ठंड 1mg/ml (FN) fibronectin Pbs, 7.4 पीएच () के 50 μL पिपेट पेट्री डिश कंटेनर में. FN ड्रॉप के शीर्ष पर coverslip उलटें, जेल की ओर FN उजागर.
- 1-2 घंटे के लिए या 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया.
- प्लेस coverslips, 6 सेमी टिशू कल्चर पीबीएस (7.4 पीएच) से युक्त व्यंजन में काफी coverslip को कवर करने के लिए टिशू कल्चर हुड में बाँझ शर्तों के तहत,.
- पीबीएस (7.4 पीएच) के कई (3-5) बाँझ शर्तों के तहत, washes के साथ बड़े पैमाने पर धो लें.
- Germicidal दीपक के टिशू कल्चर हुड में 30 मिनट के लिए उपयोग द्वारा coverslips जीवाणुरहित.
- 30-45 चढ़ाना कोशिकाओं को पहले मिनट के लिए सेल मीडिया में coverslips सेते हैं.
- क्रॉस जोड़ने Paa जेल सतह प्रोटीन पर hydrazine हाइड्रेट कार्बोहाइड्रेट समूहों द्वारा ECM ऑक्सीकरण और hydrazine हाइड्रेट जेल का उपयोग करने के लिए युग्मित कर रहे हैं.
- Polyacrylamide के रूप में धारा 2 में वर्णित जैल तैयार.
- एक धूआं हुड में प्लास्टिक पेट्री डिश और दस्ताने का उपयोग प्लेस Paa जेल coverslips प्रत्येक Paa जेल और सेते की सतह पर कम से कम दो घंटे के लिए undiluted hydrazine हाइड्रेट के लगभग 1 मिलीलीटर पिपेट, लेकिन 24 घंटे से अधिक लंबी नहीं
- पेट्री डिश में जोड़ें DDH 2 हे, hydrazine हाइड्रेट समाधान निकालें और खतरनाक कचरे के रूप में निपटान.
- पेट्री डिश के लिए 5% एसिटिक एसिड जोड़ें coverslip विसर्जित. कवर और एक घंटे के लिए सेते हैं.
- एसिटिक एसिड निकालें और DDH 2 ओ के साथ धो DDH 2 हे में एक घंटे के लिए सेते हैं. coverslips अब सक्रिय कर रहे हैं और पार से लिंक (FN) fibronectin ऑक्सीकरण के लिए तैयार है.
- 1 मिलीग्राम / एक अंधेरे सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में 50 मिमी सोडियम एसीटेट बफर (4.5 पीएच) के 940 μl में मिलीलीटर FN समाधान के 10 μl पतला, 10 μg / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता बना.
- 50 मिमी सोडियम एसीटेट बफर (4.5 पीएच) के 1 मिलीग्राम सोडियम मेटा periodate के 80 मिलीग्राम जोड़कर 20X सोडियम मेटा - periodate के शेयर करें.
- FN 3.2.6 में तैयार समाधान के लिए 20X मेटा periodate शेयर सोडियम की 50 μl जोड़ें, जैसे कि अंतिम काम एकाग्रता 10 μg / एमएल एफ एन और 4 / μg मिलीलीटर सोडियम मेटा periodate हैं. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे ट्यूब में सेते हैं.
- सक्रिय जेल कहा 3.2.5 में coverslip स्पिनर (<2 सेकंड) का उपयोग कर तैयार की सतह से अतिरिक्त DDH 2 हे निकालें. जेल सुखाने से बचें.
- ~ Pipet सक्रिय जेल और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सतह सेते पर FN समाधान के 500 μl.
- पीबीएस (7.4 पीएच) से युक्त व्यंजन में प्लेस coverslips, coverslip को कवर करने के लिए पर्याप्त है.
- पीबीएस के कई washes (3-5) (7.4 पीएच) के साथ बड़े पैमाने पर धो लें.
- Germicidal दीपक के टिशू कल्चर हुड में 30 मिनट के लिए उपयोग द्वारा coverslips जीवाणुरहित.
- 30-45 चढ़ाना कोशिकाओं को पहले मिनट के लिए सेल मीडिया में coverslips सेते हैं.
- Paa जेल में Acryloyl एक्स द्वारा ECM प्रोटीन का थोक संयुग्मन, succinimidyl एस्टर इस प्रोटोकॉल 2.5 से पहले किया जाता है. रिएक्टिव प्रोटीन पर amines एनएचएस एस्टर रसायन शास्त्र के साथ एक acrylamide monomer के लिए युग्मित कर रहे हैं और फिर सह Paa जेल की थोक में polymerized.
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार Acryloyl एक्स पसंद के संयुग्म ECM प्रोटीन. संयुग्मित प्रोटीन का स्टॉक समाधान 4 में संग्रहित किया जाना चाहिए डिग्री सेल्सियस
- Paa काम कर जेल निर्माण (जैसे 10 coverslip प्रति उल) के लिए आवश्यक समाधान की मात्रा की गणना.
- तालिका 1 में काम कर समाधान नुस्खा में सूचीबद्ध राशि से पानी की 50 μL (जैसे 10% मात्रा) घटाएँ और polymerization के आरंभ.
- 3.3.2 में गणना की मात्रा निकालें और 10% की मात्रा के ईसीएम / Acryloyl एक्स समाधान जोड़ने. (जैसे 1 / ईसीएम Acryloyl एक्स के Paa समाधान के 9 μL μL). इस कदम को तेजी से किया जाना चाहिए, के रूप में जेल polymerizing है.
- पूरा 2.6 और 2.7 कदम के रूप में पहले वर्णित है.
- पीबीएस (7.4 पीएच) के कई (3-5) बाँझ शर्तों के तहत, washes के साथ बड़े पैमाने पर धो लें.
- Germicidal दीपक के टिशू कल्चर हुड में 30 मिनट के लिए उपयोग द्वारा coverslips जीवाणुरहित.
- 30-45 चढ़ाना कोशिकाओं को पहले मिनट के लिए सेल मीडिया में coverslips सेते हैं.
इन चरणों के बाद कोशिकाओं को ECM-लेपित जेल सब्सट्रेट (~ 6-12 बजे) पर फैल अनुमति दी गई है आयोजित की जाती हैं. Confocal इमेजिंग कक्ष (आर सी-30WA) को इकट्ठा करने के लिए, यह करने के लिए मार्गदर्शन के लिए वार्नर उपकरण वेबसाइट से परामर्श के लिए उपयोगी है.
- गर्म सेल मीडिया और 0.5% या 0.25% और एक 5ml या 10ml सिरिंज में trypsin लोड.
- एक वार्नर उपकरण confocal इमेजिंग कक्ष (आर सी 30WA) के शीर्ष Coverslip धारक पर एक 22x30mm coverslip वैक्यूम तेल का उपयोग करने के लिए जगह में coverslip रखने लोड.
- Coverslip के शीर्ष पर रबर गैसकेट बनाने चैम्बर प्लेस, दोनों Inlet और आउटलेट पॉलीथीन टयूबिंग के लिए उपयोग की अनुमति. यह 150-1000 सुक्ष्ममापी शीर्ष coverslip और जेल में लिपटे 22x40mm coverslip, पाल बांधने की रस्सी के आकार इस्तेमाल पर निर्भर करता है के बीच की दूरी की अनुमति होगी.
- इनलेट टयूबिंग पर लोड संबंधक किट, और जाँच करें कि मीडिया टयूबिंग के माध्यम से और शीर्ष Coverslip पर बहती है और कोई बुलबुले प्रवाह लाइनों में स्पष्ट कर रहे हैं के माध्यम से, सीरिंज.
- चैम्बर के आधार और जेल में लिपटे लोड 22x40mm coverslip, सेल साइड पर वैक्यूम तेल लागू करें. कोशिकाओं को गर्म मीडिया को लागू करें.
- प्लेस चैम्बर के आधार पर शीर्ष Coverslip चैंबर गैसकेट जेल लेपित coverslip से अलग के साथ, धारक. सुनिश्चित करें कि चैम्बर के आधार के भीतर का पता लगाने पिंस शीर्ष Coverslip में पता लगाने छेद के भीतर बैठ.
- चैम्बर आधार प्रेशर प्लेट लागू करें और प्रेशर प्लेट रिंच का उपयोग में पेंच और प्रेशर प्लेट सुरक्षित.
- टयूबिंग और कक्ष के माध्यम से मीडिया के प्रवाह की जाँच के लिए कक्ष के भीतर किसी भी संभावित लीक की निगरानी और कोशिका की सतह पर किसी भी मीडिया से मुक्त क्षेत्रों को खत्म करने. नोट: एक छोटे गेज सुई का उपयोग करने के लिए एक मामूली निर्वात आकर्षित करते हुए मीडिया के साथ infusing मीडिया मुक्त क्षेत्र को खत्म करने में मदद कर सकते हैं.
- स्टेज इमेजिंग के लिए एक खुर्दबीन धारक के भीतर स्थित एडाप्टर के लिए confocal इमेजिंग कक्ष लागू करें.
- छवि fluorescently लेबल प्रोटीन और फ्लोरोसेंट एक confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर जेल सब्सट्रेट के भीतर एम्बेडेड मोती.
- जेल के भीतर शांत मनका पदों की एक छवि को प्राप्त करने के लिए, trypsin perfuse जेल से सेलुलर adhesions अलग है, और वही इमेजिंग क्षेत्र है जहां सेल पालन में फ्लोरोसेंट मोतियों की एक छवि ले. तनावपूर्ण और शांत मनका पदों की तुलना संकुचन के तहत जेल सब्सट्रेट विस्थापन की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है.
प्रतिनिधि परिणाम:
ऊपर प्रोटोकॉल के अनुरूप Paa जैल सेल सिकुड़ना के अध्ययन के लिए तैयार करने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन करता है और चित्रा 1 में सचित्र है. जेल इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त की सतह फ्लोरोसेंट भर में समान रूप से एम्बेडेड मोती (2A चित्रा) के साथ अपेक्षाकृत सपाट और चिकनी है.
यदि फोकल adhesions के स्थान, सेल के इमेजिंग (चित्रा 3A) और जेल सतह (चित्रा 3B) पर जेल संकुचन को मापने फोकल adhesions की confocal ऑप्टिकल विमान में किया जाना चाहिए. एक जेल के संकुचन एम्बेडेड फ्लोरोसेंट मोतियों के विस्थापन (3B चित्रा) द्वारा कल्पना जेल सतह पर जब कोशिकाओं (तनावपूर्ण) पक्षपाती बनाम अलग (शांत) कर रहे हैं किया जा सकता है. कम्प्यूटेशनल एल्गोरिदम का उपयोग जोर दिया मनका विस्थापन और जेल की इसी लोचदार मापांक (चित्रा -3 सी और 3 डी) (Sabass एट अल, 2008) के साथ जुड़े कर्षण उपज कर सकते हैं . यदि इमेजिंग जगह लेता है जेल के भीतर गहरी, तो मनका displacements के छोटे हो सकता है और नहीं होगा कर्षण फोकल adhesions पर exerted बलों के प्रतिनिधि.
चित्रा 1 प्रयोगात्मक सेटअप के योजनाबद्ध चित्रण. इस प्रक्रिया के समग्र लक्ष्य सेलुलर संकुचन का अध्ययन करने के उद्देश्य के लिए आज्ञाकारी matrices बनाने के लिए है. प्रयोगात्मक प्रक्रिया का पहला कदम polymerized जैल प्रस्तोता के प्रयोजन के लिए amino-silane/glutaraldehyde उपचार द्वारा coverslips सक्रिय है. दूसरे चरण के लिए एक polyacrylamide जेल polymerize, फ्लोरोसेंट मोती सक्रिय coverslip पर, युक्त है. तीसरे चरण रासायनिक शामिल पार जोड़ने कोशिकी ligand के polyacrylamide जेल की सतह के लिए, एक तीन चरण 3 में सूचीबद्ध युग्मन तकनीक का उपयोग. कक्ष फिर जेल पर चढ़ाया जाता है और पालन करने के लिए और प्रसार की अनुमति दी. सक्रिय सेलुलर संकुचन के तहत जेल में एम्बेडेड मोती विस्थापित.
चित्रा 2 Paa जेल के ऊपर की सतह के ऑप्टिकल confocal टुकड़ा, के रूप में (ए) फ्लोरोसेंट 40nm जेल के भीतर एम्बेडेड मोती और (बी) fibronectin immunofluorescence के द्वारा visualized.
चित्रा 3 एक कर्षण बल प्रयोग के लिए प्रतिनिधि परिणाम. (ए) एक मानव ऑस्टियो सार्कोमा U2OS सेल में फोकल adhesions मीटरGFP-paxillin और (बी) पदों फ्लोरोसेंट Paa (हरा) तनावपूर्ण और शांत राज्यों (लाल) में फोकल adhesions अंतर्निहित जेल में एम्बेडेड मोती के द्वारा arked. तीर मनका विस्थापन के उदाहरण से संकेत मिलता है. (सी.) ट्रैक्शन तनाव वैक्टर और (डी) कर्षण की इसी गर्मी पैमाने पर नक्शे जेल के संकुचन से व्युत्पन्न जोर दिया, कम्प्यूटेशनल एल्गोरिदम का उपयोग कर (Sabass एट अल., 2008 ). स्केल बार = 5 सुक्ष्ममापी.
तालिका 1:
उदाहरण स्टॉक और Paa समाधान कार्य (1 तालिका में डेटा पहले Yeung एट अल से प्राप्त हुई थी और स्वतंत्र रूप से हमारी प्रयोगशाला में पुष्टि की .)
| स्टॉक Paa समाधान | ||||
| Paa जेल के अपरुपण मापांक (पा) | 230 | 2833 | 8640 | 16344 |
| 40% Acrylamide (एमएल) | 1.25 | 3.12 | 2.34 | 2.50 |
| 2% बीआईएस - Acrylamide (एमएल) | 0.50 | 0.83 | 1.88 | 0.60 |
| जल (एमएल) | 3.25 | 1.04 | 0.78 | 1. 90 |
| कुल वॉल्यूम (एमएल): | 5 | 5 | 5 | 5 |
| कार्य Paa समाधान | ||||
| स्टॉक समाधान खेतों में प्रयुक्त किए गए पुराने यंत्र (पा) | 230 | 2833 | 8640 | 16344 |
| स्टॉक समाधान वॉल्यूम (μL) | 150 | 150 | 200 | 300 |
| पानी (μL) | 341.75 | 341.75 | 291.75 | 191.75 |
| मोती (μL) | 5 | 5 | 5 | 5 |
| TEMED (μL) | 0.75 | 0.75 | 0.75 | 0.75 |
| 10% ए पी एस (μL) | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
| कुल वॉल्यूम (μL): | 500 | 500 | 500 | 500 |
| Final Acrylamide% | 3 | 7.5 | 7.5 | 12 |
| अंतिम% बीआईएस - Acrylamide | 0.06 | 0.1 | 0.3 | 0.15 |
तालिका 2:
विभिन्न अंतिम acrylamide और बीआईएस - acrylamide प्रतिशत की Paa substrates के अपरुपण मापांक
| 12% Acrylamide | 7.5% Acrylamide | |||
| बीआईएस - Acrylamide% | अपरुपण मापांक (पा) | बीआईएस - Acrylamide% | अपरुपण मापांक (पा) | |
| 0.145 | 16344 | 0.01 | 689 | |
| 0.28 | 30067 | 0.03 | 1535 | |
| 0.45 | 34263 | 0.05 | 2286 | |
| 0.55 | 42375 | 0.075 | 2833 | |
| 0.575 | 50873 | 0.1 | 4069 | |
| 0.6 | 55293 | 0.2 | 5356 | |
| 0.3 | 8640 | |||
| 5% Acrylamide | 3% Acrylamide | |||
| बीआईएस - Acrylamide% | अपरुपण मापांक (पा) | बीआईएस - Acrylamide% | अपरुपण मापांक (पा) | |
| 0.05 | 430 | 0.02 | 1.3 | |
| 0.075 | 600 | 0.04 | 54 | |
| 0.1 | 1431 | |||
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Discussion
प्रक्रिया एक कर्षण बल (TFM) माइक्रोस्कोपी प्रयोग की स्थापना के लिए यहाँ वर्णित है, कम्प्यूटेशनल ट्रैकिंग दिनचर्या (Sabass एट अल., 2008) के कार्यान्वयन के साथ, माइक्रोन पैमाने पर स्थानिक संकल्प के साथ सेलुलर बलों की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है. प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने के लिए, यह ECM ligand के समान कोटिंग के साथ एक शुद्ध और एक समान जेल सब्सट्रेट के रूप में महत्वपूर्ण है. हम संभावित नुकसान नीचे चर्चा:
गैर वर्दी जेल भूतल या आँसू:
हमारे अनुभव में, वहाँ कई कदम है कि एक अच्छा वर्दी जेल बनाने के लिए महत्वपूर्ण दिखाई देते हैं. यदि आपके जेल सतह में अंधेरे छेद है प्रकट होता है, यह संभावना है कि अधिक वर्षा एक्स बूंदों गिलास स्लाइड से पूरी तरह हटाया नहीं गया, अपने जेल के खिलाफ polymerize के लिए एक असमान सतह hydrophobic बनाने. इसके अलावा, हमने पाया है कि बेहद सॉफ्ट जैल के लिए (<100 पा), जेल की सतह कारण पक्षपाती Paa जेल coverslip सतह पर विवश सूजन अत्यधिक असमान हो जाता है, इस प्रभाव को कम करने का एक तरीका एक उपयुक्त बफर के साथ पानी की जगह है जेल polymerization से इमेजिंग ऐसी है कि आसमाटिक दबाव बनाए रखा है.
Rips या जेल सतह में आँसू कई कारकों से उत्पन्न कर सकते हैं. यदि जेल polymerization के पहले पूरा नहीं सैंडविच coverslip - स्लाइड के disassembly है, यह बड़े ruptures या आँसू करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. गिलास स्लाइड के लिए बहुत ज्यादा आसंजन (यानी वर्षा - एक्स कोटिंग के उन्मूलन) या भी कमजोर आसंजन coverslip सतह (coverslip सतह के सक्रियण कदम या एक धूल वातावरण में सक्रिय coverslips रखने के साथ यानी समस्याओं) भी बड़ी आँसू या नेतृत्व कर सकते हैं सतह में rips. अंत में, यदि Paa जेल सैंडविच / coverslip स्लाइड में निर्जलित जबकि हो जाता है, आँसू अधिक होने की संभावना हैं और दरारें जेल सतह भर में visualized किया जा सकता है. इन समस्याओं को और अधिक प्रचलित हो जब <1 kPa कठोरता के साथ जैल के साथ काम कर रहे हैं. आँसू या Rips अक्सर कम (10-20x) बढ़ाई चरण जेल के विपरीत इमेजिंग (यानी टिशू कल्चर माइक्रोस्कोप पर) ECM युग्मन से पहले से पहचाना जा सकता है है.
ECM युग्मन विधि का विकल्प:
ECM-संयुग्मित थोक Acryloyl एक्स समावेश से दूर है,, आसान विधि निष्पादित (रीनहार्ट राजा एट अल., 2005). हम पुष्टि की है कि निगमन / ईसीएम 10% मात्रा अंश पर Acryoyl एक्स Paa जेल कठोरता प्रभाव नहीं करता है. इस तकनीक के दो लाभ हैं: (1) के रूप में यहाँ वर्णित है, यह ECM प्रोटीन का कम से कम राशि का उपयोग करता है तो यह स्थितियों में जहां ECM प्रोटीन महंगा है के लिए इष्टतम है और (2) थोक विकार भी बहुत बड़ी के साथ जैल के निर्माण की सुविधा सतह क्षेत्र है, जो हम पश्चिमी सोख्ता या RT-पीसीआर प्रयोगों के लिए एक Paa जेल के साथ कोट बड़े गिलास स्लाइड के लिए इस्तेमाल किया है. इस तकनीक के साथ दो सीमाएं हैं कि सतह उपलब्ध ligand की कुल राशि में परिवर्तन (हम ligand की सतह घनत्व 10% की मात्रा अंश पर तर में पाया गया है) और है कि कुछ प्रोटीन, कोलेजन की तरह जेल में एक सजातीय में नहीं शामिल करना उनके लिए अनायास polymerize प्रवृत्ति के कारण तरीके.
Paa जेल hydrazine हाइड्रेट का उपयोग सतह पर प्रोटीन युग्मन ligand के घनत्व में सबसे बड़ी श्रृंखला प्रदान करता है, लेकिन यह भी सबसे निष्पादित करने के लिए जटिल है. हमने पाया है कि fibronectin की सतह घनत्व ऑक्सीकरण fibronectin प्रोटीन की एकाग्रता (10-50 μg / एमएल) से, जैसे कि उपलब्ध ligand ठीक tuned किया जा सकता बदलकर काफी बदल सकते हैं. Fibronectin और मेटा - periodate सोडियम के ऑक्सीकरण प्रतिक्रिया में पर्याप्त उच्च सांद्रता में, fibronectin समग्र और दृढ़ता से प्रोटीन की एक समान कोट के बयान में बाधा कर सकते हैं. संभल के रूप में अगले अनुभाग में संकेत दिया परीक्षण करने के लिए वांछित और प्रोटीन की मात्रा और गुणवत्ता के बयान को सुनिश्चित करने की जरूरत है. हम भी ECM प्रोटीन की छपाई माइक्रो संपर्क ligands के स्थानिक वितरण (Stricker एट अल., 2010) पर नियंत्रण के साथ संयोजन के रूप में इस रसायन शास्त्र में प्रयोग किया जाता है. इस युग्मन के एक और लाभ यह है कि यह युग्मन चरण में काफी कम (100x) ECM ligand की सांद्रता की आवश्यकता है एक इसी तरह की सतह के घनत्व में परिणाम है, तो कम ECM प्रोटीन की आवश्यकता होती है. इस तकनीक का नुकसान शामिल समय और उचित कार्बोहाइड्रेट कुछ प्रोटीन के ऑक्सीकरण के लिए आवश्यक समूहों की कमी कर रहे हैं.
sulfo - SANPAH साथ Paa जेल सतह युग्मन की विधि मजबूत है और हम इसे जोड़े को इस्तेमाल किया है Paa जेल सतहों के लिए प्रोटीन की कई रेंज. सबसे महत्वपूर्ण नुकसान है कि ECM प्रोटीन की एक बहुत ही उच्च एकाग्रता संयुग्मन कदम (1 मिलीग्राम / एमएल) और सतह उपलब्ध ligand के एक उदार राशि में परिणाम के दौरान आवश्यक है. इस प्रकार, इस पद्धति ECM प्रोटीन की एक बहुत ही उच्च मात्रा की खपत में परिणाम कर सकते हैं. एक अन्य ख़तरा गरीब sulfo - SANPAH की जेट के नुकसान के कारण गरीबों को युग्मन कारण किया जा सकता हैतैयारी के दौरान भंडारण या समय देरी. हालांकि, इन विसंगतियों यहाँ वर्णित विधि के साथ कम कर रहे हैं.
भूतल उपलब्ध Ligand की पुष्टि और मात्रा:
जेल की सतह पर प्रोटीन ligand के घनत्व की पुष्टि करने के लिए, हम (चित्रा 2B) fibronectin या कोलेजन के खिलाफ immunofluorescence का इस्तेमाल किया है और (fibronectin सांद्रता के एक श्रृंखला के कांच adsorbed पर कैलिब्रेटेड मानकों की एक श्रृंखला के खिलाफ जेल सतह की छवियों की तीव्रता की तुलना में ). अधिक मात्रात्मक उपायों रेडियोधर्मी लेबलिंग (राजगोपालन एट अल., 2004) द्वारा किया जा सकता है . ECM यहाँ प्रोटोकॉल का वर्णन तरीकों बनाना जैल है कि लगभग एक के रूप में fibronectin की एक ही सतह घनत्व है कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एक इलाज गिलास coverslip पर 10 μg / एमएल fibronectin adsorbing द्वारा प्राप्त होगा. यह सबसे कोशिकाओं के लिए पर्याप्त अच्छी तरह से पालन और प्रसार हो रहा है. यह अधिक से अधिक सतह घनत्व हम sulfo SANPAH या AcryoylX तरीकों का उपयोग कर प्राप्त किया है, उच्च सतह घनत्व hydrazine हाइड्रेट विधि के साथ प्राप्त किया जा सकता है.
गरीब युग्मन अनुचित हैंडलिंग और sulfo SANPAH और Acryloyl एक्स जेट के बाद नुकसान से परिणाम सकता है. इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन का पीएच 7.0 के आसपास बनाए रखने के जब पार से जोड़ने के एजेंट के रूप में sulfo SANPAH या Acryloyl एक्स का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें Paa जेल के लिए उचित पार से जोड़ने की. इसके अलावा, hydrazine हाइड्रेट प्रोटोकॉल की oxidization चरण में, हमने पाया है कि राशि से अधिक सोडियम metaperiodate की सांद्रता यहाँ प्रोटीन की एक बड़ी समुच्चय है कि कुछ समान जेल सतह नहीं उपज की सिफारिश की.
कृपया ध्यान दें कि कोशिकाओं को अब लेने के लिए फैल सकता है और नरम जेल सतहों पर की तुलना में एक टिशू कल्चर प्लास्टिक या कांच coverslips के साथ काम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पालन.
जेल कठोरता के reproducibility:
जेल व्यंजनों यहाँ वर्णित कई प्रयोगशालाओं और कई हाथ, जो स्वतंत्र रूप से जेल कठोरता की पुष्टि की है कि थोक rheology का उपयोग में कई वर्षों के पाठ्यक्रम पर एक बेहद प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कठोरता के साथ जैल उपज. फिर भी, यह सलाह दी जाती है rheology विधियों द्वारा जेल कठोरता की पुष्टि करने के लिए. ध्यान दें कि यहाँ रिपोर्ट कठोरता अपरुपण मापांक, यंग मापांक नहीं है. दो मानों ई से संबंधित हैं = 2G (1 + υ), जहां ई यंग मापांक है, जी अपरुपण मापांक है, और υ सामग्री के पॉसों के अनुपात है.
ऑक्सीजन और buffers या प्रयोगशाला पानी जैसे धातुओं और गैर बफर आयनों, के भीतर contaminants की उपस्थिति acrylamide polymerization को बाधित कर सकते हैं, असंगत परिणामों के लिए अग्रणी. इसके अलावा, 5 एमएल शेयर समाधान के प्रयोग के पाठ्यक्रम पर जैल के हजारों के निर्माण की सुविधा है और इस तरह, कम से कम विसंगतियों के लिए पर्याप्त होना चाहिए. फिर भी, यह सलाह दी जाती है rheology विधियों द्वारा जेल कठोरता की पुष्टि करने के लिए.
ECM युग्मन पर जेल कठोरता पर प्रभाव:
हम पुष्टि की है कि ईसीएम Acroyl - एक्स का उपयोग प्रोटीन की थोक संयुग्मन Paa जैल की कठोरता परिवर्तन नहीं करता है. दूसरों की पुष्टि की है कि sulfo - SANPAH साथ संयुग्मन स्थानीय कठोरता (Engler एट अल., 2004) को प्रभावित नहीं करता.
मोती आकार के विकल्प:
हम 40 एनएम मोती मिल गया है एक इष्टतम मनका मोतियों की उच्च घनत्व के उपयोग को सुविधाजनक बनाने के आकार का हो सकता है, के रूप में हमारे प्रतिनिधि छवि में दिखाया गया है. ये मोती काफी उज्ज्वल दोनों व्यापक क्षेत्र और confocal माइक्रोस्कोपी के साथ इमेजिंग की सुविधा है, लेकिन बड़े भी नहीं हमारे polyacrylamide जेल की कठोरता पर किसी भी औसत दर्जे का प्रभाव है. इमेजिंग की सुविधा के लिए, बड़े मोती का इस्तेमाल किया जा सकता है.
कर्षण शक्ति माइक्रोस्कोपी (TFM) की उपयोगी अनुप्रयोगों:
TFM के अनुरूप hydrogels और अनुप्रयोगों के व्यापक हैं. हम, और दूसरों को, इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है करने के लिए सेलुलर भेदभाव, प्रसार, प्रवास, और संकुचन, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से फोकल आसंजन विधानसभा, रखरखाव, और disassembly के कई पहलुओं का अध्ययन. भेषज एजेंट है कि या तो रोकना या प्रोटीन गतिविधि को सक्रिय TFM के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया गया है सेलुलर कर्षण बलों पर विशिष्ट प्रोटीन की भूमिका की जांच है. इसके अलावा, प्रोटीन की गतिज गुण फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी धब्बा (Gardel एट अल., 2008) का उपयोग या photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली (FRAP) के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है है और कर्षण बलों के लिए सहसंबद्ध. इसके अलावा, कर्षण बल परिश्रम पर प्रोटीन पछाड़ना के असर के लिए जांच करने के लिए siRNA के आवेदन भी सेलुलर biophysical गुणों फेरबदल में विशिष्ट प्रोटीन की भूमिका का आकलन करने के लिए एक उपयोगी तरीका है. कुल मिलाकर, उच्च संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ TFM के संयोजन सेल के गतिशील और यांत्रिक गुणों सहसंबंधी करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण पैदावार.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम कम्प्यूटेशनल ट्रैकिंग सेलुलर कर्षण बल (Sabass एट अल., 2008) की मात्रा का ठहराव में इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर के लिए Ulrich Schwarz की प्रयोगशाला धन्यवाद . यह काम एक Burroughs Wellcome कैरियर पुरस्कार और NIH निदेशक एमएल Gardel और चिकित्सा वैज्ञानिक राष्ट्रीय अनुसंधान सेवा (GM07281 T32 5) पुरस्कार सपा शीतकालीन के लिए पायनियर पुरस्कार (DP10D00354) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-aminopropyltrimethyoxysilane | Aldrich | 28, 177-8 | |
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% Bis-acrylamide | Fisher Scientific | BP1404 | |
| TEMED | Fisher Scientific | BP 150-20 | |
| Ammonium persulfate | Fisher Scientific | BP179 | |
| 40nm fluorescent micro-spheres | Invitrogen | F8789 | |
| Sulfo-SANPAH | Pierce, Thermo Scientific | 22589 | |
| Confocal imaging chamber (RC-30) | Warner Instruments | 64-0320 | |
| Coverslip spinner | Home made | NA | |
| Ultraviolet lamp CL1000 | UVP Inc. | 95-0228-01 | |
| Stainless steel rack | Electron Microscopy Sciences | 72239-04 | |
| acryloyl-X, SE (6-((acryloyl)amino)hexanoic acid) | Invitrogen | A-20770 | |
| Hydrazine hydrate | Sigma-Aldrich | 225819 | |
| Sodium meta-periodate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20504 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416-4 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Coverslips (#1.5) | Corning | 2940‐224 | |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16120 | |
| Rain-X | SOPUS Products | www.rainx.com | |
| Acetic Acid | Acros Organics | 64-19-7 |
References
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- Engler, A., Bacakova, L. N. ewman, Hategan, C., Griffin, A., M, D. D. ischer Substrate compliance versus ligand in cell on gel responses. Biophys J. 86 ((1 Pt 1)), 617-628 (2004).
- Gardel, M. L., Sabass, B., Ji, L., Danuser, G., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. Traction stress in focal adhesions correlates biphasically with actin retrograde flow speed. J Cell Biol. 183, 999-1005 (2008).
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