Beredning av Klagomål Matriser för kvantifiering Cellular Sammandragning

Summary

I denna video visar vi de experimentella tekniker som används för att tillverka kompatibla, extracellulära matrix (ECM) substrat som lämpar sig för cellodling och som kan bli föremål för dragkraft mikroskopi och observera effekter av ECM stelhet på cellens beteende.

Abstract

Regleringen av cellulära vidhäftning till den extracellulära matrix (ECM) är avgörande för cell migration och ECM ombyggnad. Fokal sammanväxningar är makromolekylära församlingar att koppla kontraktila F-aktin cytoskelettet till ECM. Denna anslutning möjliggör överföring av intracellulära mekaniska krafter genom cellmembranet till underliggande substrat. Senaste arbete har visat att mekaniska egenskaper ECM reglerar fokus vidhäftning och F-aktin morfologi samt ett stort antal fysiologiska processer, inklusive celldifferentiering, division, spridning och migration. Således har användningen av substrat cellodling blivit en allt vanligare metod för att exakt kontrollera och modulera ECM mekaniska egenskaper.

För att kvantifiera dragkrafter i fokus sammanväxningar i en anhängare cell är kompatibla substrat används tillsammans med hög upplösning bildbehandling och beräkningsteknik i en sk metod dragkraft mikroskopi (TFM). Denna teknik bygger på mätningar av det lokala storlek och riktning av substrat deformationer orsakade av cellulära kontraktion. I kombination med hög upplösning fluorescensmikroskopi av fluorescerande taggade proteiner, är det möjligt att korrelera cytoskelettala organisation och ombyggnad med dragkrafter.

Här presenterar vi ett detaljerat försöksprotokoll för beredning av två-dimensionell, kompatibel matriser i syfte att skapa ett substrat cellkultur med en väldefinierad, avstämbara mekanisk styvhet, som är lämplig för att mäta cellulär kontraktion. Dessa protokoll omfattar tillverkning av polyakrylamid hydrogeler, ytbeläggning ECM proteiner på sådana geler, plätering celler geler, och högupplösta konfokalmikroskopi med en perfusion kammare. Dessutom ger vi ett representativt urval av data som visar lokalisering och omfattning av cellulära krafter med hjälp av ovan TFM protokoll.

Protocol

1. Aktivera täckglas ytan

1. Täckglas (# 1.5, 22x40 mm) rengöras med en serie av tvål och etanol tvättar i en tidigare beskrivits protokoll (Waterman-Storer, 1998) att rengöra och ta bort damm.
2. Placera täckglas i en rostfri hållare rack, är sådana att täckglas avstånd från varandra och inte röra.
3. I kemiska dragskåp (nitril och rekommenderas skyddsglasögon), späd full styrka 3-aminopropyltrimethoxysilane i isopropanol för en slutlig koncentration av 2% (2 ml silan / 100 ml isopropanol) för att fylla en fyrkantig glasskål (~ 350 ml volym). På grund av reaktivitet med plast, använd ett glas pasteurpipett att tillämpa 3-aminopropyltrimethoxysilane till isopropanol.
4. Fullt Doppa täckglasen från 1,2 till denna lösning i 10 min under lätt omröring på ett rör plattan i dragskåp.
5. Tvätta täckglas genom att sänka ner i DDH ₂ O (4 utbyte av vatten). Låt 10 min hålltid för den slutliga utbyte, under omrörning. Amino-silan som innehåller lösningar ska hanteras som farligt avfall.
6. Torr täckglas i inkubator vid varm temperatur (~ 37 ° C) i 10 minuter i en dammfri miljö.
7. Svalna till rumstemperatur.
8. I dragskåp, sänk täckglas i 1% glutaraldehyd lösning i DDH ₂ O i ett glas ruta maträtt på rör plattan i 30 minuter.
9. Tvätta med 3 utbyten av DDH ₂ O i 10 minuter per utbyte, under omrörning. Kasta glutaraldehyd som farligt avfall.
10. Torrt i rumstemperatur och täcker med aluminiumfolie för att undvika damm fastnar på täckglas.
11. Förvara på en torr plats, borta från damm, upp till 2 månader.

2. Beredning av polyakrylamid (PAA) gel

1. Bered stamlösningar av akrylamid / BIS-akrylamid mix från 40% akrylamid och 2% bis-akrylamid, enligt tabell 1. Vi upprätthåller flera lager lösningar som är optimerade för PAA geler av olika styvhet, exempel visas i tabell 1 och 2. Stamlösningar kan hållas i flera år, så länge de hålls i ett mörklagt flaska vid 4 C.
2. Fungerande lösningar som innehåller den slutliga önskade halter av akrylamid / BIS-akrylamid erhålls från stamlösningar. Till exempel, förbereder vi en fungerande lösning av 7,5% acrylamide/0.10% bis-akrylamid i DDH ₂ O för att 2.8kPa PAA geler.
3. Degas akrylamid lösning i en vakuumkammare i 20 minuter, för att minska syret i lösningen som förhindrar PAA polymerisation.
4. Förbered 10% ammonium persulfate (APS) lösning (0.5g/5mL). Använd färska arbetar lager inom 3 dagar. Alternativt kan lager frysas för att användas vid senare tidpunkter.
5. Medan akrylamid är avgasning, torka en 1x3 "slide mikroskop glas med Rain-X våtservetter kraftfullt för att göra glas hydrofoba bilden yta. Att avlägsna överskott av Rain-X, torka glasskiva med fuktiga Kimwipe. Bildspelsgrupp glas åt sidan, täckt.
6. Ta bort akrylamid lösning från vakuumkammare och lägga fluorescerande pärlor (1% av volymen, 5 l för arbetsmiljön lösning som anges i tabell 1). Lägg 0.75μl TEMED och 2,5 l 10% APS, vilket kommer att inleda gel polymerisation. Blanda väl genom att pipettera för ~ 5 sekunder, för att minimera införandet av bubblor,
7. Applicera 10-12 ìl av akrylamid lösningen hydrofoba objektglas (utarbetad i steg 2.4) och placera aktiveras 22x40mm täckglas ovanpå droppen. Gel lösning bör pälsen hela täckglas. Släta ut eventuella bubblor som kan finnas i lösningen. Låt gelen lösningen polymerisera vid rumstemperatur i ~ 10 min.
8. Slutförandet av polymerisation kan bedömas genom att vända återstående lösning i mikrocentrifugrör. Dessutom kan polymeriserade gelen dra bort från täckglas kanter. Omedelbart efter makroskopiska polymerisation observeras separera täckglaset från glaset bilden. Använda den fina spetsen på en pincett eller ett rakblad kant, försiktigt bort täckglas, med gel bifogas, från objektglas yta och fördjupa gel i DDH ₂ O, för att upprätthålla vätskebalansen.

3. Koppling extracellulär matrix (ECM) proteiner till PAA gelen

Tre olika metoder kan användas för att fästa ECM protein antingen till toppen ytan av PAA gel (3,1 och 3,2) eller som innehåller ECM protein i gelen volym (3,3). Här diskuterar vi koppling av fibronektin till PAA geler att resultera i en yta ligand densitet som motsvarar den mängd adsorberade på glas efter inkubering med 10 mikrogram / ml fibronektin lösning i 1 timme. Överväganden för att välja en metod som beskrivs i diskussionen.

1. Bryggbindningen ECM protein PAA gel yta genom Sulfo-SANPAH Reaktiv aminer på proteiner är kovalent bifogas PAA gelen ytan av heterobifunctional över länkare Sulfo-SANPAH
   1. Förbered 40 l arbetar alikvoter av Sulfo-SANPAH genom att lösa S ulfo-SANPAH pulver i vattenfri dimetylsulfoxid (DMSO) (20 l per mg Sulfo-SANPAH). Flash frysa lager i flytande kväve och förvaras vid -80 ° C för senare användning.
   2. Ta bort DDH ₂ O från gel ytan med ett täckglas spinnare (<2 sek). Undvik att torka gelen.
   3. Späd Sulfo-SANPAH-DMSO alikvoter i DDH ₂ O (2mg/ml, pH 7) omedelbart före användning och päls gel yta (~ 200 l). Observera att reaktivitet halveringstiden för Sulfo-SANPAH är kort (~ 5 min) i rumstemperatur i vatten, och därför bör dessa moment utföras i snabb takt.
   4. Exponera gel yta för UV-ljus i en UV-cross-linker ugn (8W, 254 nm våglängd på ett avstånd av 2-3 inches för 1,5 min). Sulfo-SANPAH kommer att ändra färg från orange till brunt.
   5. Doppa UV-behandlade täckglas i en bägare med färska DDH ₂ O och ta bort överflödigt vatten från gel ytan med ett täckglas spinnare (<2 sek).
   6. Pipettera ~ 50 mikroliter av kall 1mg/ml Fibronectin (FN) (i PBS, pH 7,4) på ​​Parafilm i petriskål behållare. Invertera täckglas ovanpå FN droppe, gel sida som exponeras för FN.
   7. Reagera i rumstemperatur i 1-2 timmar eller vid 4 ° C över natten.
   8. Placera täckglas i 6 kultur cm vävnad rätter som innehåller PBS (pH 7,4), tillräckligt för att täcka täckglas, under sterila förhållanden i vävnadskultur huva.
   9. Tvätta omfattande med flera tvättar (3-5) i PBS (pH 7,4), under sterila förhållanden.
   10. Sterilisera täckglasen genom användning av bakteriedödande lampor i vävnadsodling huva i 30 min.
   11. Inkubera täckglas i cell media för 30-45 min före plätering celler.
2. Bryggbindningen ECM till PAA gelen ytan genom Kolhydrater hydrazinhydrat grupper på proteiner oxideras och kopplade till gelen med hjälp av hydrazinhydrat.
   1. Förbered polyakrylamidgeler som beskrivs i avsnitt 2.
   2. Placera PAA gel täckglas i plast petriskål i ett dragskåp och använder handskar pipett ca 1 ml outspädd hydrazinhydrat på ytan av varje PAA gel och inkubera i minst två timmar, men inte längre än 24 timmar
   3. Lägg DDH ₂ O till petriskål, Ta bort hydrazinhydrat lösning och omhänderta som farligt avfall.
   4. Tillsätt 5% ättiksyra till petriskål att fördjupa täckglas. Täck och inkubera under en timme.
   5. Ta bort ättiksyra och tvätta med DDH ₂ O. Inkubera i DDH ₂ O för en timme. Den täckglas är nu aktiverat och redo att länka oxiderat Fibronectin (FN).
   6. Späd 10 l av 1 mg / ml FN lösning i 940 l av 50 mM natriumacetat buffert (pH 4,5) i ett mörkt mikro centrifugrör, vilket gör en slutlig koncentration på 10 mikrogram / ml.
   7. Gör en bedömning av 20X natrium meta-periodate genom att lägga till 80 mg natrium meta-periodate till 1 ml 50 mM natriumacetat buffert (pH 4,5).
   8. Tillsätt 50 ìl 20X natrium meta-periodate lager till FN-lösning som upprättats i 3.2.6, så att sista arbetar koncentration är 10 mikrogram / ml FN och 4 mikrogram / ml natrium meta-periodate. Inkubera i mörker röret i rumstemperatur i 30 minuter.
   9. Ta bort överflödig DDH ₂ O från aktiveras gel ytan upprättats i 3.2.5 med hjälp av ett täckglas spinnare (<2 sek). Undvik att torka gelen.
   10. Pipettera ~ 500 ìl av FN lösning på aktiverade gel yta och inkubera i 1 timme i rumstemperatur.
   11. Placera täckglas i rätter som innehåller PBS (pH 7,4), tillräckligt för att täcka täckglas.
   12. Tvätta omfattande med flera tvättar (3-5) i PBS (pH 7,4).
   13. Sterilisera täckglasen genom användning av bakteriedödande lampor i vävnadsodling huva i 30 min.
   14. Inkubera täckglas i cell media för 30-45 min före plätering celler.
3. Bulk konjugering av ECM protein i PAA gel med acryloyl-X, protokollet succinimidyl ester görs före 2,5. Reaktiv aminer på proteiner är kopplade till en akrylamid monomer med NHS ester kemi och sedan sampolymeriserad in den största delen av PAA gel.
   1. Konjugat ECM protein valfrihet acryloyl-X enligt tillverkarens anvisningar. Stamlösningar av konjugerade protein skall lagras vid 4 ° C.
   2. Beräkna volymen av PAA fungerande lösning krävs för gel tillverkning (t.ex. 10 uL per täckglas).
   3. Subtrahera 50 mikroliter (t.ex. 10% volym) av vatten från summan som anges i brukslösning receptet i tabell 1 och initiera polymerisation.
   4. Ta bort volym beräknas i 3.3.2 och lägga till ECM / acryloyl-X-lösning till 10% volym. (T.ex. 1 mikroliter av ECM / acryloyl-X till 9 mikroliter av PAA-lösning). Detta steg bör utföras snabbt, eftersom gelen är polymerisation.
   5. Utför steg 2,6 och 2,7 beskrivits som tidigare.
   6. Tvätta omfattande med flera tvättar (3-5) i PBS (pH 7,4), under sterila förhållanden.
   7. Sterilisera täckglasen genom användning av bakteriedödande lampor i vävnadsodling huva i 30 min.
   8. Inkubera täckglas i cell media för 30-45 min före plätering celler.

le "> 4. Loading täckglas i konfokala imaging kammare

Dessa steg görs efter att cellerna har tillåtits att spridas på ECM-belagd gel substrat (~ 6-12 timmar). Att montera konfokala imaging kammaren (RC-30WA), är det bra att samråda med Warner Instrument webbplats för vägledning.

1. Varm cell media och 0,5% eller 0,25% trypsin och last i en 5 ml eller 10 ml spruta.
2. Ladda en 22x30mm täckglas ovanpå Täck innehavaren av en Warner Instrument konfokala imaging kammare (RC-30WA) med vakuum fett för att hålla täckglaset på plats.
3. Placera en kammare bildas gummipackning ovanpå täckglaset, som ger tillgång till både inlopp och utlopp polyeten slang. Detta gör att ett avstånd på 150-1000 ìm mellan toppen täckglas och gel-coated 22x40mm täckglas, beroende på storlek som används packning.
4. Ladda sprutor på inloppsslang, via kontakt kit, och kontrollera att media flyter genom slangen och in på Top Täck och inga bubblor är synliga i flödet linjer.
5. Applicera vakuum fett på basen av kammare och last gel-coated 22x40mm täckglas, cell-sidan upp. Applicera varm media till celler.
6. Placera Top Täck hållaren på kammaren bas, med avdelningen packning som avskiljer den från gel-coated täckglas. Se till att styrstiften i kammaren basen sitter i Söka hål i toppen täckglas.
7. Applicera tryckplattan till kammaren basen och använda Wrench Tryckplatta att skruva i och säkra tryckplattan.
8. Kontrollera flödet av media genom slangen och kammaren att övervaka eventuella läckage i kammaren och att eliminera alla medier zoner på cellytan. Obs: med en liten nål för att dra en lätt undertryck samtidigt infusion med media kan bidra till att undanröja media-fria zoner.
9. Applicera konfokala imaging kammaren till scenen Adapter belägen inom ett mikroskop hållare för avbildning.
10. Bild fluorescerande-märkta proteinet och fluorescerande kulor inbäddade i gelen underlaget på en konfokala fluorescensmikroskop.
11. För att få en bild av unstrained pärla befattningar inom gel, BEGJUTA Trypsin att lösgöra cellulära sammanväxningar från gelen och ta en bild av fluorescerande pärlor i samma avbildning fält där cellen anslutit sig till. Jämförelse av ansträngda och unstrained pärla positioner möjliggör kvantifiering av gelen substrat förskjutning i kontraktion.

Representativa resultat:

Ovannämnda protokoll beskriver den experimentella procedur för att förbereda kompatibel PAA geler för att studera celler kontraktilitet och illustreras i figur 1. Gelen ytan erhålls med detta protokoll är relativt platt och smidig, med fluorescerande kulor inbäddade jämnt (Figur 2A).

Om mäta gel kontraktion på platsen fokus sammanväxningar, avbildning av cellen (Figur 3A) och gel yta (Figur 3B) bör göras vid konfokala optiska planet av fokala sammanväxningar. Sammandragning av en gel kan visualiseras genom förskjutning av inbäddade fluorescerande kulor (Figur 3B) på gelen ytan när celler anhängare (ansträngda) jämfört med fristående (unstrained). Användningen av beräkningsalgoritmerna kan ge dragkraft betonar i samband med pärla deplacement och motsvarande elasticitetsmodul av gelen (Figur 3C och 3D) (Sabass et al., 2008). Om avbildning sker djupare i gel, sedan pärla förskjutningar kommer att bli mindre och inte representativa för dragkraft krafter som utövas i fokus sammanväxningar.

Figur 1. Schematisk illustration av experiment. Det övergripande målet med detta förfarande är att skapa kompatibla matriser för att studera cellulära kontraktion. Det första steget i den experimentella proceduren är att aktivera täckglas av amino-silane/glutaraldehyde behandling i syfte att förankra polymeriserat geler. Det andra steget är att polymeriseras en polyakrylamidgel innehållande fluorescerande pärlor, på aktiverade täckglas. Det tredje steget innebär att den kemiska bryggbindningen av extracellulär ligand till ytan av polyakrylamidgel, med en av de tre kopplingen teknikerna anges i steg 3. Cellerna är sedan pläterade på gelen och får fäste och sprida sig. Under aktiv cellulära kontraktion, pärlor inbäddade i gelen tränga undan.

Figur 2. Optisk konfokala bit av ovansidan av PAA gel, visualiseras genom (A.) fluorescerande 40nm kulor inbäddade i gel och (B.) fibronektin immunofluorescens.

Figur 3. Representativt resultat för en dragkraft experiment. (A.) Fokal sammanväxningar i en mänsklig osteosarkom U2OS cell är marked av GFP-paxillin och (B.) positioner fluorescerande kulor inbäddade i PAA gelen underliggande fokus sammanväxningar i ansträngda (grön) och unstrained (röd) stater. Pilarna anger exempel på pärla deplacement. (C.) Traction stressen vektorer och (D) motsvarande värme skala karta över dragkraft betonar härrör från sammandragning av gelen, med beräkningsalgoritmerna (Sabass et al., 2008). Skalningsfält = 5 ìm.

Tabell 1:

Exempel Lager-och arbetsvillkor PAA Solutions (Data i tabell 1 var först från Yeung et. Al. Och oberoende bekräftas i vårt laboratorium.)

Stock PAA-lösning
Skjuvmodulen av PAA Gel (Pa)	230	2833	8640	16.344
40% akrylamid (ml)	1,25	3,12	2,34	2,50
2% Bis-Akrylamid (ml)	0,50	0,83	1,88	0,60
Vatten (ml)	3,25	1,04	0,78	1. 90
Total volym (ml):	5	5	5	5

Arbeta PAA-lösning
Stock lösning som används (Pa)	230	2833	8640	16.344
Stamlösning Volym (mikroliter)	150	150	200	300
Vatten (mikroliter)	341,75	341,75	291,75	191,75
Pärlor (mikroliter)	5	5	5	5
TEMED (mikroliter)	0,75	0,75	0,75	0,75
10% APS (mikroliter)	2,5	2,5	2,5	2,5
Totala volymen (mikroliter):	500	500	500	500
Final Akrylamid%	3	7,5	7,5	12
Slutlig Bis-Akrylamid%	0,06	0,1	0,3	0,15

Tabell 2:

Skjuvmodulen av PAA substrat av olika slutgiltiga akrylamid och bis-akrylamid procentsatser

12% akrylamid			7,5% akrylamid
% Bis-Akrylamid	Skjuvmodulen (Pa)		% Bis-Akrylamid	Skjuvmodulen (Pa)
0,145	16.344		0,01	689
0,28	30.067		0,03	1535
0,45	34.263		0,05	2286
0,55	42.375		0,075	2833
0,575	50.873		0,1	4069
0,6	55.293		0,2	5356
			0,3	8640
5% akrylamid			3% akrylamid
% Bis-Akrylamid	Skjuvmodulen (Pa)		% Bis-Akrylamid	Skjuvmodulen (Pa)
0,05	430		0,02	1,3
0,075	600		0,04	54
0,1	1431

Discussion

Det förfarande som beskrivs här för konfigurering av en dragkraft mikroskopi (TFM) experiment, tillsammans med genomförandet av datoriserad spårning rutiner (Sabass et al., 2008), möjliggör kvantifiering av cellulära krafter med micron skala rumslig upplösning. För att optimera experimentella protokoll, är det viktigt att bilda en ren och enhetlig gel substrat med jämn beläggning av ECM-ligand. Vi diskuterar potentiella fallgropar nedan:

Icke-enhetlig Gel Surface eller tårar:

Enligt vår erfarenhet finns det flera steg som verkar kritiska till att skapa en fin uniform gel. Om din gel ytan verkar ha mörkt hål i den, är det troligt att överskottet Rain-X droppar inte helt togs bort från glasskiva, som bildar en ojämn hydrofob yta för gel till polymerisera mot. Vi har också funnit att för extremt mjuk gel (<100 Pa), blir gelen ytan mycket ojämn på grund av begränsad svullnad av fastsittande PAA gel på täckglas ytan, ett sätt att minimera denna effekt är att ersätta vatten med en lämplig buffert så att osmotiska trycket upprätthålls från gel polymerisation till avbildning.

Revor eller tårar i gelen ytan kan uppstå av flera faktorer. Om gel polymerisation inte är avslutad före demontering av täckglas-slide sandwich, kan detta leda till stora bristningar eller tårar. För mycket vidhäftning till glasskiva (det vill säga eliminering av Rain-X beläggning) eller för svag vidhäftning till täckglas ytan (dvs problem med aktivering steg täckglas yta eller behålla aktiveras täckglas i en dammig miljö) kan också leda till stora tårar eller sliter på ytan. Slutligen, om PAA gelen blir uttorkad medan i täckglas / bilden smörgås, tårar är mer sannolikt att uppstå och sprickor kan visualiseras över gelen ytan. Dessa problem blir vanligare när man arbetar med geler med <1 kPa styvhet. Revor kan ofta identifieras med låg förstoring (10-20x) faskontrast avbildning av gelen (dvs på en vävnadsodling mikroskop) före ECM koppling.

Val av ECM koppling Metod:

Bulk inkorporering av ECM-konjugerad till acryloyl-X är i särklass den enklaste metoden att utföra (Reinhart-King et al., 2005). Vi har bekräftat att införlivandet ECM / Acryoyl-X på 10% volymfraktion påverkar inte PAA gel styvhet. Två fördelar med denna teknik är: (1) som beskrivs här används den minsta ECM protein så det är optimalt för situationer där ECM protein är dyrt och (2) den största delen konjugation underlättar också tillverkning av geler med mycket stora yta, som vi har använt för att belägga stora glasskivor med en PAA gel för Western blotting eller RT-PCR experiment. Två begränsningar med denna teknik är att förändringar i totala ytan tillgänglig ligand (vi har hittat ytors liganden för att mätta vid 10% volymandel) och att vissa proteiner, som kollagen, inte införliva gelen i en homogen sätt på grund av deras tendens att spontant polymerisera.

Koppling protein på PAA gelen ytan med hydrazinhydrat tillhandahåller det största utbudet i ligand densitet, men är också den mest komplicerade att utföra. Vi har funnit att ytan densitet fibronektin kan ändras väsentligt genom att ändra koncentrationen av oxiderat fibronektin protein (från 1 till 50 mikrogram / ml), så att ligand tillgänglig i exakt den kan vara trimmad. Vid tillräckligt höga koncentrationer av fibronektin och natrium meta-periodate i oxidationsreaktionen, den fibronektin kan aggregera och starkt hindrar nedfall av ett jämnt skikt av protein. Noggrann provning som anges i nästa avsnitt behövs för att garantera avsättning av önskad mängd och kvalitet av protein. Vi har också använt denna kemi i kombination med mikro-kontakt utskrift av ECM-proteiner för att styra den geografiska fördelningen av ligander (Stricker et al., 2010). En annan fördel med denna koppling är att den kräver betydligt (100x) lägre koncentrationer av ECM-ligand i kopplingen steget att resultera i ett liknande underlag täthet, så mindre ECM protein krävs. Nackdelar med denna teknik är den tid det tar och bristen på lämpliga kolhydrater grupper som behövs för oxidation av vissa proteiner.

Metoden för koppling av PAA gelen ytan med sulfo-SANPAH är robust och vi har använt den för att koppla en mängd olika proteiner för att PAA gel ytor. Den viktigaste nackdelen är att en mycket hög koncentration av ECM-proteinet krävs under konjugering steg (1 mg / ml) och resulterar i en måttlig mängd yt-tillgänglig ligand. Därför kan denna metod medföra konsumtion av en mycket hög mängd ECM protein. En annan fallgrop kan vara dålig koppling grund av förlust av reaktiviteten sulfo-SANPAH på grund av dåliglagring eller tid förseningar under beredning. Men dessa inkonsekvenser är minimal med den metod som beskrivs här.

Bekräftelse och kvantifiering av Surface Tillgängligt Ligand:

För att bekräfta tätheten av protein ligand på gelen ytan, har vi använt immunofluorescens mot fibronektin (Figur 2B) eller kollagen och har jämfört intensiteten av bilder av gelen ytan mot ett spektrum av kalibrerad standarder (ett urval av fibronektin koncentrationer adsorberas på glas ). Mer kvantitativa åtgärder kan göras genom att radioaktiva märkning (Rajagopalan et al., 2004). ECM protokollen beskriver metoder för att tillverka geler som har ungefär samma yta täthet fibronektin som man skulle få genom att adsorbera 10 mikrogram / ml fibronektin på ett obehandlat glas täckglas för 1 timme i rumstemperatur. Detta är tillräckligt för de flesta celler att bli väl följas och spridas. Detta är den maximala ytan täthet vi har fått hjälp av sulfo-SANPAH eller AcryoylX metoder, högre yta densitet kan uppnås med hydrazinhydrat metoden.

Dålig koppling kan bero på felaktig hantering och efterföljande förlust av reaktivitet sulfo-SANPAH och acryloyl-X. Dessutom är det viktigt att behålla pH extracellulärt matrix protein runt 7,0 när man använder sulfo-SANPAH eller acryloyl-X som bryggbindningen agenten för att säkerställa korrekt tvärbindande till PAA gelen. Även i oxidering steg i hydrazinhydrat protokollet, har vi funnit att högre halter av natrium metaperiodate än det belopp som här rekommenderas ge stora aggregat av proteiner som inte några enhetligt på gelen ytan.

Observera att cellerna kan ta längre tid att sprida och hålla på mjuka gel ytor än en kan användas för att arbeta med vävnadsodling plast eller täckglas glas.

Reproducerbarhet av Gel Styvhet:

Gelen recept som beskrivs här ger gel med extremt reproducerbara styvhet under loppet av många år i flera laboratorier och flera händer som självständigt har bekräftat gel styvhet med hjälp av bulk reologi. Ändå är det lämpligt att bekräfta gel stelhet av reologi metoder. Notera att styvheten redovisas här är skjuvmodulen, inte Youngs modul. De två värdena är relaterade genom E = 2G (1 + υ), där E är elasticitetsmodulen, är G skjuvmodulen och υ är Poissons tal av materialet.

Närvaro av syre och föroreningar inom buffertar eller laboratorium vatten, såsom metaller och icke-buffert joner kan hämma akrylamid polymerisation, vilket leder till inkonsekventa resultat. Vidare bör 5 ml stamlösning vara tillräcklig för att underlätta tillverkning av tusentals gel under loppet av försöket och därmed minimera inkonsekvenser. Ändå är det lämpligt att bekräfta gel stelhet av reologi metoder.

Påverkan på ECM koppling på gel styvhet:

Vi har bekräftat att huvuddelen konjugering av ECM-proteiner med Acroyl-X inte ändrar styvhet PAA geler. Andra har bekräftat att konjugering med sulfo-SANPAH inte påverkar lokala styvhet (Engler et al., 2004).

Val av pärla storlek:

Vi har funnit 40 nm pärlor att vara en optimal pärla storlek för att underlätta användningen av hög täthet av pärlor, vilket framgår av vår representant bild. Dessa pärlor är tillräckligt ljusstark för att underlätta avbildning med både brett och konfokalmikroskopi, men inte för stor för att ha någon mätbar effekt på styvheten i vår polyakrylamidgel. För att underlätta bildbehandling, kan större pärlor användas.

Användbara tillämpningar av dragkraft mikroskopi (TFM):

Ansökningarna från kompatibla hydrogeler och TFM är omfattande. Vi, och andra, har använt detta protokoll för att studera många aspekter av cellulär differentiering, proliferation, migration och kontraktion, samt fokus vidhäftning tillverkning samt underhåll och demontering. Farmakologiska agenter som antingen hämmar eller aktivera protein aktiviteten har använts i samband med TFM för att undersöka rollen av specifika proteiner på cellulär dragkrafter. Dessutom kan den kinetiska egenskaper proteiner bedömas med hjälp av fluorescerande speckle mikroskopi (Gardel et al., 2008) eller fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) och korrelerade till dragkrafter. Dessutom kan tillämpningen av siRNA att söka efter effekten av proteinet ÖVERVÄLDIGANDE på dragkraft ansträngning också en användbar metod för att bedöma betydelsen av specifika proteiner i att ändra cellulära biofysiska egenskaper. Sammantaget ger kombinationen av TFM med hög upplösning fluorescensmikroskopi en kraftfull metod för att korrelera dynamiska och mekaniska egenskaper i cellen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-aminopropyltrimethyoxysilane	Aldrich	28, 177-8
40% Acrylamide	Bio-Rad	161-0140
2% Bis-acrylamide	Fisher Scientific	BP1404
TEMED	Fisher Scientific	BP 150-20
Ammonium persulfate	Fisher Scientific	BP179
40nm fluorescent micro-spheres	Invitrogen	F8789
Sulfo-SANPAH	Pierce, Thermo Scientific	22589
Confocal imaging chamber (RC-30)	Warner Instruments	64-0320
Coverslip spinner	Home made	NA
Ultraviolet lamp CL1000	UVP Inc.	95-0228-01
Stainless steel rack	Electron Microscopy Sciences	72239-04
acryloyl-X, SE (6-((acryloyl)amino)hexanoic acid)	Invitrogen	A-20770
Hydrazine hydrate	Sigma-Aldrich	225819
Sodium meta-periodate	Thermo Fisher Scientific, Inc.	20504
Isopropanol	Fisher Scientific	A416-4
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F2006
Collagen	BD Biosciences	354236
Coverslips (#1.5)	Corning	2940‐224
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16120
Rain-X	SOPUS Products	www.rainx.com
Acetic Acid	Acros Organics	64-19-7