Summary
이 비디오에서는, 우리는 세포 배양에 적합 규격, 세포외 매트릭스 (ECM) 코팅 기판을 조작하는 데 사용되는 실험 기법을 설명하고, 견인 힘 현미경 의무가 있으며, 세포 행동 ECM의 강성의 영향을 관찰하는.
Abstract
세포외 매트릭스 (ECM)에 세포 부착의 조절은 세포 마이 그 레이션 및 ECM의 리모델링을 위해 필수적입니다. 초점 adhesions은 macromolecular 어셈블리 그 부부 ECM에 수축성 F - 굴지의 cytoskeleton을하고 있습니다. 이 연결은 세포막에 걸쳐 기본 기판에 세포 기계 병력의 전송을 허용합니다. 최근 작품은 ECM의 기계적 성질은 초점 접착력 및 F - 굴지의 형태뿐만 아니라, 세포 분화, 분열, 증식 및 마이 그 레이션 등 다양한 생리 과정을 조절 표시하고 있습니다. 따라서, 세포 배양 기판의 사용이 정확하게 제어 및 ECM 기계적 특성을 조절하기 위해 점점 더 널리 사용 방법이되었습니다.
자기편 세포에 초점 adhesions의 견인 세력을 계량하기 위해 준수 기판은 고해상도 이미지와 방법 칭했다 견인 힘 현미경 (TFM)에서 전산 기술과 함께 사용됩니다. 이 기술은 세포의 수축에 의해 유도 기판 deformations의 로컬 크기와 방향의 측정에 의존하고 있습니다. 찬란 태그 단백질의 고해상도 형광 현미경와 함께, 그것은 견인 세력과 cytoskeletal 조직 및 개조를 상호 연관시킬 수 있습니다.
여기 우리는 세포 수축 측정에 적합합니다 잘 특징, 조정할 수있는 기계 강성과 세포 배양 기판을 만들 목적으로 2 차원, 호환 매트릭스의 준비에 대한 자세한 실험 프로토콜을 제시한다. 이러한 프로토콜은 polyacrylamide의 hydrogels의 제조 등 젤에서 ECM의 단백질 코팅, 젤에 도금 세포 및 재관류 챔버를 사용하여 고해상도 공촛점 현미경을 포함합니다. 또한, 우리는 인용 TFM 프로토콜을 사용하여 세포 세력의 위치와 크기를 보여주는 데이터의 대표 샘플을 제공합니다.
Protocol
1. coverslip 표면을 활성화
- Coverslips는 (# 1.5, 22x40 ㎜) 먼지를 청소하고 제거하는 이전에 설명한 프로토콜 (워터맨 - 스톨러, 1998)에 비누와 에탄올 세척 일련의를 사용하여 청소합니다.
- 스테인레스 스틸 홀더 랙에 장소 coverslips은 같은 그 coverslips는 분리 간격과 감동을하지 않습니다.
- 화학 펌 후드 (nitrile 장갑 및 권장 고글)에서 정사각형 유리 접시를 (~ 350ml 볼륨) 작성 (2ml 실란 / 100 ML 이소프로판올) 2 %의 최종 농도에 대한 이소프로판올 3 - aminopropyltrimethoxysilane 전체 강도를 희석. 플라스틱과 반응으로 인해, 이소프로판올 3 - aminopropyltrimethoxysilane 적용할 유리 파스퇴르 피펫을 사용합니다.
- 10 분이 솔루션에 1.2에서 완전히 젖어 coverslips 부드럽게 퓸 후드에 저어 접시에 감동하면서.
- ddH 2 O (물 4 교류)에 immersing로 coverslips 씻으십시오. 10 분 교반과 함께 최종 교환 시간을 몸을 담글 수 있습니다. 아미노 실란이 포함된 솔루션은 유해 폐기물로 처리되어야합니다.
- 따뜻한 온도에서 인큐베이터에 드라이 coverslips (~ 37 ° C) 먼지없는 환경에서 10 분.
- 실내 온도 쿨.
- 펌 모자에 유리 사각 접시에 ddH 2 O의 1 % 글루 타 알데히드 용액에 담가의 coverslips 30 분 동안 접시를 저어.
- 감동과 교류 당 10 분 ddH 2 O 3 교환하여 씻으십시오. 유해 폐기물로 글루 타 알데히드의 배출.
- coverslips를 지키는에서 먼지를 피하기 위해 알루미늄 호일로 덮고, 실온에서 건조.
- 최대 2 개월, 떨어져 먼지, 건조한 장소에 보관하십시오.
2. polyacrylamide의 준비 (PAA) 겔
- 표 1 다음 40 % 아크릴 아미드와 2% 비스 - 아크릴 아미드에서 아크릴 아미드 / 비스 - 아크릴 아미드 믹스 재고 솔루션을 준비합니다. 우리는 서로 다른 강성의 PAA의 젤에 최적화된 여러 주식 솔루션을 유지, 예제 표 1과 2에 나열되어 있습니다. 주식 솔루션들은이 4 C.에 어두운 병에 유지만큼, 몇 년 동안 보관 가능
- 아크릴 아미드 / 비스 - 아크릴 아미드의 마지막 원하는 농도를 포함하는 작업 솔루션은 재고 솔루션에서 얻을 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 2.8kPa PAA의 젤을 만들기위한 ddH 2 O에서 7.5 % acrylamide/0.10 % 비스 - 아크릴 아미드의 작업 솔루션을 준비합니다.
- 20 분위한 진공 챔버에 데가스은 아크릴 아미드 솔루션, PAA의 중합을 방지 솔루션 내에서 산소를 줄일 수 있습니다.
- 10 % 암모늄 persulfate (APS) 솔루션 (0.5g/5mL)를 준비합니다. 3 일 이내에 새로운 작업을 주식을 사용합니다. 또는, 주식은 나중에 날짜에 사용되는 냉동 수 있습니다.
- 아크릴 아미드는 degassing이지만, 유리 슬라이드 표면 소수성를 만들기 위해 적극적으로 비 - X 잎사귀와 1x3 "현미경 유리 슬라이드를 닦아냅니다. 덮인, 옆으로 젖은 Kimwipe와 함께 유리 슬라이드를 닦아냅니다., 설정 유리 슬라이드를 초과하는 비 - X를 제거하려면 다음과 같이하십시오.
- 진공 챔버에서 아크릴 아미드의 솔루션을 제거하고 (볼륨을 1 %, 표 1에 나열된 작업 솔루션을 5 μl) 형광 구슬을 추가합니다. 0.75μl가 TEMED 추가 겔 중합을 시작합니다 2.5 μl 10 % APS. 거품의 도입을 최소화하기 위해, ~ 5 초에 대한 pipetting으로 잘 섞어서
- 비말 위에 22x40mm coverslip을 활성화 소수성 현미경 슬라이드 (단계 2.4 준비)과 장소에 아크릴 아미드 솔루션의 10-12 μl을 적용합니다. 젤 솔루션은 외투 전체 coverslip해야합니다. 솔루션 내에 나타날 수있는 거품을 부드럽게. ~ 10 분 상온에서 중합에 겔 솔루션을 허용합니다.
- 중합의 완성은 microcentrifuge 관에서 반전 나머지 작업 솔루션 평가하실 수 있습니다. 또한, polymerized 젤 멀리 coverslip의 가장자리에서 끌어 수 있습니다. 매크로 중합이 지켜지는 즉시, 유리 슬라이드로부터 coverslip를 구분한다. 족집게 한 켤레 또는 면도날 가장자리의 좋은 팁을 사용하면, 신중하게 수화를 유지하기 위해, ddH 2 O의 현미경 슬라이드 표면 담가 겔에서 젤 첨부와 coverslip을 제거하십시오.
3. PAA 젤로 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질 커플링
세 개의 서로 다른 방법은 가기 PAA 젤의 표면 (3.1 및 3.2) 또는 겔 볼륨 (3.3) 내에서 ECM 단백질을 포함하는 하나 ECM 단백질을 첨부하는 데 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 1 시간에 10 μg / ML의 fibronectin 솔루션 부화 후 유리에 adsorbed 금액에 해당되는 표면 리간드 밀도 결과 PAA의 젤에 fibronectin의 결합에 대해 설명합니다. 방법을 선택을위한 고려 사항은 토론에 상세한 있습니다.
- 가교 단백질에 Sulfo - SANPAH 대응 아민의 PAA의 겔 표면에 ECM 단백질 것은 covalently heterobifunctional 가교제 Sulfo - SANPAH하여 PAA의 겔 표면에 부착
- S를 용해하여 Sulfo - SANPAH 40 μl aliquots 작업 준비 무수 디메틸 sulfoxide에 ulfo - SANPAH 파우더 (DMSO) (Sulfo - SANPAH의 MG 당 20 μl). -80에서 액체 질소와 저장소에 플래시 동결 주식 ° C 나중에 사용하기 위해.
- coverslip 회전자를 (<2sec)를 사용하여 겔 표면에서 ddH 2 O를 제거합니다. 겔 건조하지 마십시오.
- 즉시 사용할 수와 코트 겔 표면 (~ 200 μl) 전에 ddH 2 O (2mg/ml, 산도 7)에 Sulfo - SANPAH - DMSO의 aliquots을 희석. Sulfo - SANPAH의 반응 반감기가 물에 실온에서 (~ 5 분) 짧은됩니다, 따라서 다음 단계는 빠른 속도로 수행되어야합니다.
- UV 크로스 링커 오븐 (1.5 분, 2-3 인치의 거리에서 8W, 254 nm의 파장)에 자외선에 겔 표면을 쉽게받을 수 있습니다. Sulfo - SANPAH 오렌지에서 갈색으로 색상이 변화됩니다.
- 딥 UV - 대우 신선한 ddH 2 O와 비커에 coverslips하고 coverslip 회전자를 (<2sec)를 사용하여 겔 표면에서 초과 물을 제거합니다.
- 피펫 ~ 페트리 접시 컨테이너에 Parafilm에 차가운 1mg/ml의 Fibronectin (FN) (PBS, pH를 7.4에서) 50 μL. FN 드롭 위에 coverslip 반전, 젤 사이드 FN에 노출.
- 1-2시간 또는 4 ° C에서 하룻밤 실온에서 반응.
- PBS를 (산도 7.4)이 포함된 6cm 조직 문화 요리 플레이스 coverslips는 충분한 조직 문화 후드에서 무균 조건 하에서, coverslip을 커버합니다.
- 무균 조건 하에서 PBS (산도 7.4) 여러 세척 (3-5)와 함께 광범위하게 씻으십시오.
- 30 분 조직 문화 후드에 살균 램프를 이용하여 coverslips를 소독.
- 도금 세포 전에 30-45 분 셀 미디어 coverslips을 품어.
- 가교 단백질에 히드 라진 수화물의 탄수화물 그룹에 의해 PAA의 겔 표면에 ECM하면 산화 및 히드 라진 수화물을 사용하여 겔로 결합됩니다.
- 로 제 2의 설명에 polyacrylamide의 젤을 준비합니다.
- 펌 모자 플라스틱 페트리 접시 및 사용 장갑에 넣어 PAA 겔 coverslips 적어도 두 시간 동안 각 PAA 젤과 부화의 표면에 undiluted 히드 라진 수화물의 약 1 ML을 피펫 없지만, 24시간보다 더 이상
- 페트리 접시에 ddH 2 O를 추가, 히드 라진 수화물 솔루션을 제거하고 유해 폐기물로 폐기.
- coverslip 젖어에 페트리 접시 5 % 초산을 추가합니다. 커버 한 시간 동안 부화.
- 초산를 제거하고 ddH 2 O.로 세척 한 시간 만이라도 ddH 2 O에서 알을 품다. coverslips는 현재 활성화되고 상호 연결 Fibronectin (FN)를 산화 준비가 된 것입니다.
- 10 μg / ML의 최종 농도를하고, 어두운 마이크로 원심 분리기 튜브 50 MM의 아세트산 나트륨 버퍼 (산도 4.5)의 940 μl 1 MG / ML FN 솔루션 10 μl를 희석.
- 50 MM의 아세트산 나트륨 버퍼 (산도 4.5) 1 ML에 나트륨 메타 periodate의 80 밀리그램을 추가하여 20X 나트륨 메타 periodate의 재고를 확인하십시오.
- 3.2.6에서 준비한 FN 솔루션에 메타 periodate 주식 20X 나트륨의 50 μl를 추가, 그러한 것을 최종 작업 농도는 10 μg / ML FN 4 μg / ML 나트륨 메타 periodate 있습니다. 30 분 상온에서 어두운 튜브에 품어.
- coverslip 회전자를 (<2 초)를 사용하여 3.2.5의 준비가 활성화 겔 표면에서 초과 ddH 2 O를 제거합니다. 겔 건조하지 마십시오.
- Pipet ~ 실온에서 1 시간에 대한 활성화 겔 표면에 품어 FN 솔루션 500 μl.
- PBS를 (산도 7.4)이있는 요리 플레이스 coverslips 충분한 coverslip을 커버합니다.
- PBS 여러 세척 (3-5) (산도 7.4)에 광범위하게 씻으십시오.
- 30 분 조직 문화 후드에 살균 램프를 이용하여 coverslips를 소독.
- 도금 세포 전에 30-45 분 셀 미디어 coverslips을 품어.
- Acryloyl - X로 PAA 겔에서 ECM 단백질의 대량 활용은 succinimidyl 에스테르이 프로토콜은 2.5 이전에 이루어집니다. 단백질에 대한 반응 아민은 NHS 에스테르 화학있는 아크릴 아미드의 단량체로 결합된 다음 PAA 젤의 대량으로 공동 polymerized 있습니다.
- 제조 업체의 지침에 따라 Acryloyl - X로 선택의 공액 ECM 단백질. 복합 단백질의 주식 솔루션은 4 보관해야 ° C.
- 겔 제조 (coverslip 당 예 : 10 UL)에 필요한 PAA 작업 솔루션의 볼륨을 계산합니다.
- 표 1에서 작업 솔루션 조리법에 나와있는 금액의 물 50 μL (예 : 10 % 볼륨) 빼기와 중합을 시작합니다.
- 3.3.2 계산 볼륨을 제거하고 10 % 볼륨 ECM / Acryloyl - X 솔루션을 추가합니다. (예 : PAA 솔루션 9 μL에 ECM / Acryloyl - X 1 μL). 젤 polymerizing므로이 단계는 신속하게 수행하여야한다.
- 작성 단계 2.6 및 2.7과 같은 이전에 설명했다.
- 무균 조건 하에서 PBS (산도 7.4) 여러 세척 (3-5)와 함께 광범위하게 씻으십시오.
- 30 분 조직 문화 후드에 살균 램프를 이용하여 coverslips를 소독.
- 도금 세포 전에 30-45 분 셀 미디어 coverslips을 품어.
세포가 ECM - 코팅 겔 기판 (~ 6-12시)에 확산 수 후에이 단계를 실시하고 있습니다. 공촛점 이미징 챔버 (RC - 30WA)를 조립하기 위해서는지도를위한 워너 인스 트루먼 트의 웹 사이트를 참조하는 데 유용합니다.
- 따뜻한 세포 미디어와 0.5 % 또는 0.25 %의 5ml 또는 10ml의 주사기에 트립신 및로드합니다.
- 장소에 coverslip을 유지하기 위해 진공 그리스를 사용하여 워너먼트 공촛점 이미징 챔버 (RC - 30WA)의 상위 Coverslip 홀더에 22x30mm coverslip을로드합니다.
- 입구와 출구의 폴리에틸렌 튜브에 모두 접근을 허용함으로써, coverslip 위에 고무 가스켓을 형성 챔버를 놓습니다. 이것은 최고 coverslip 및 사용 가스켓의 크기에 따라 겔 - 코팅 22x40mm coverslip 사이 150-1000 μm의의 간격을 수 있습니다.
- 커넥터 키트, 그리고 미디어가 튜브를 통해과 최고 Coverslip에 흐름과 전혀 거품이 흐름 라인에서 뚜렷한 없습니다 있는지 확인하십시오를 통해 유입 튜브에로드 주사기.
- 챔버의 기지와 셀 사이드 실어 젤 - 코팅 22x40mm coverslip,에 진공 그리스를 적용합니다. 세포에 따뜻한 미디어를 적용합니다.
- 상공 회의소 데려간이 젤 - 코팅 coverslip에서 분리와 챔버베이스에 플레이스 톱 Coverslip 홀더. 챔버베이스 내에서 찾기 핀이 위로 Coverslip에서 찾기 구멍 안에 앉아 있는지 확인합니다.
- 챔버베이스에 압력 플레이트를 적용 및 나사와 압력 플레이트를 확보하기 위해 압력 플레이트 렌치를 사용합니다.
- 챔버 내의 잠재적인 누수를 모니터링하는 튜브와 챔버를 통해 미디어의 흐름을 확인하고 세포 표면에있는 모든 미디어에없는 영역을 제거합니다. 참고 : 미디어 일으키는 동안 약간의 진공을 그릴 수있는 작은 게이지 바늘을 사용하면 미디어가없는 영역을 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다.
- 이미지에 대한 현미경 홀더 내에 위치한 무대 어댑터에 공촛점 이미징 챔버를 적용합니다.
- 이미지 찬란 - 라벨 단백질과 공촛점 형광 현미경에서 젤 기판 내에 포함된 형광 구슬.
- 겔 내에서 거르지 않은 비드 위치의 이미지를 얻으려면, 겔에서 세포 adhesions를 분리 트립신을 perfuse하고, 세포가 준수 같은 이미징 분야에서 형광 구슬의 이미지를 가져가라. 긴장과 거르지 않은 비드 위치의 비교 수축에 따라 겔 기판 변위의 부량 수 있도록합니다.
대표 결과 :
위의 프로토콜은 세포 수축성을 공부에 대한 준수 PAA의 젤 준비를위한 실험 절차를 설명하고 그림 1에서 그림입니다. 이 프로토콜과 함께 얻은 겔 표면 전체에 골고루 포함된 형광 구슬 (그림 2A)와, 비교적 평평하고 부드럽게합니다.
초점 adhesions의 위치, 세포의 이미징 (그림 3A)와 겔 표면 (그림 3B)에서 겔 수축을 측정하는 것은 초점 adhesions의 공촛점 광학 비행기에서 수행되어야하는 경우. 세포 (거르지 않은) 자기편 (긴장) 대 떨어뜨려 때 젤의 수축은 겔 표면에서 임베디드 형광 구슬의 변위 (그림 3B)에 의해 시각하실 수 있습니다. 전산 알고리즘의 사용은 젤의 비드 변위 및 해당 탄성 계수 (그림 3C 및 3D) (Sabass 외., 2008)과 관련된 견인 스트레스를 얻을 수 있습니다. 영상은 겔 안에 깊이 이루어진다면, 비드 변위는 초점 adhesions에서 끼쳤다 견인 세력의 대표 작아 및되지 않습니다.
그림 1. 실험 설정의 도식 그림. 이 절차의 전반적인 목표는 세포 수축을 공부하기위한 목적으로 호환 매트릭스를 만드는 것입니다. 실험 절차의 첫 단계는 polymerized 젤을 고정하기위한 목적으로 amino-silane/glutaraldehyde 치료에 의해 coverslips를 활성화하는 것입니다. 두 번째 단계는 활성화 coverslip에, 형광 구슬을 포함, polyacrylamide 젤을 중합하는 것입니다. 세 번째 단계는 화학 물질을 포함 가교 3 단계에 나열된 세 커플링 기법 중 하나를 사용하여 polyacrylamide 젤의 표면에 세포 리간드니다. 세포는 다음 겔에 도금 및 준수하고 확산하기 위해 사용할 수 있습니다. 활성화된 세포 수축에서 젤에 포함된 구슬이 치환.
그림 2. PAA 젤 상단 표면의 광학 공촛점 슬라이스가로 (A.) 형광 40nm 겔 내에 내장된 구슬과 (B.) fibronectin의 immunofluorescence에 의해 시각.
그림 3. 견인 강제 실험 결과 대표. (A.) 인간 osteosarcoma의 U2OS 세포에 초점 adhesions는 M 아르GFP - paxillin 및 긴장 (녹색) 및 거르지 않은 (빨간색) 상태에 초점 adhesions을 기본 PAA 젤에 포함된 형광 구슬 (B.) 위치로 arked. 화살표는 구슬 변위의 예를 나타냅니다. (C.) 트랙션 스트레스 벡터와 견인의 (D.) 해당 열 규모의지도 (Sabass 외., 2008) 계산 알고리즘을 사용하여 젤의 수축에서 파생된 강조합니다. 스케일 바 = 5 μm의.
표 1 :
예를 들어 주식과 PAA 솔루션 작업은 (표 1의 데이터 첫번째 Yeung 동부 표준시. 알로부터 얻은. 독립적으로 우리 연구실에 확인되었습니다.)
| 주식 PAA 솔루션 | ||||
| PAA 젤의 전단 계수 (PA) | 230 | 2833 | 8640 | 16,344 |
| 40 % 아크릴 아미드 (ML) | 1.25 | 3.12 | 2.34 | 2.50 |
| 2퍼센트 비스 - 아크릴 아미드 (ML) | 0.50 | 0.83 | 1.88 | 0.60 |
| 워터 (ML) | 3.25 | 1.04 | 0.78 | 1. 90 |
| 총 볼륨 (ML) : | 5 | 5 | 5 | 5 |
| 작업 PAA 솔루션 | ||||
| 증권 솔루션 사용 (PA) | 230 | 2833 | 8640 | 16,344 |
| 주식 솔루션 볼륨 (μL) | 150 | 150 | 200 | 300 |
| 워터 (μL) | 341.75 | 341.75 | 291.75 | 191.75 |
| 비즈 (μL) | 5 | 5 | 5 | 5 |
| TEMED (μL) | 0.75 | 0.75 | 0.75 | 0.75 |
| 10 % APS (μL) | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
| 총 볼륨 (μL) | 500 | 500 | 500 | 500 |
| 최종 아크릴 아미드의 % | 3 | 7.5 | 7.5 | 12 |
| 최종 비스 - 아크릴 아미드의 % | 0.06 | 0.1 | 0.3 | 0.15 |
표 2 :
다양한 최종 아크릴 아미드와 비스 - 아크릴 아미드 비율의 PAA 기판의 전단 계수
| 12 % 아크릴 아미드 | 7.5 % 아크릴 아미드 | |||
| % 비스 - 아크릴 아미드 | 전단 계수 (PA) | % 비스 - 아크릴 아미드 | 전단 계수 (PA) | |
| 0.145 | 16,344 | 0.01 | 689 | |
| 0.28 | 30,067 | 0.03 | 1535 | |
| 0.45 | 34,263 | 0.05 | 2286 | |
| 0.55 | 42,375 | 0.075 | 2833 | |
| 0.575 | 50,873 | 0.1 | 4069 | |
| 0.6 | 55,293 | 0.2 | 5356 | |
| 0.3 | 8640 | |||
| 5 % 아크릴 아미드 | 3 % 아크릴 아미드 | |||
| % 비스 - 아크릴 아미드 | 전단 계수 (PA) | % 비스 - 아크릴 아미드 | 전단 계수 (PA) | |
| 0.05 | 430 | 0.02 | 1.3 | |
| 0.075 | 600 | 0.04 | 54 | |
| 0.1 | 1431 | |||
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
절차는 전산 추적 루틴 (Sabass 외., 2008)의 구현과 함께, 견인 힘 현미경 (TFM) 실험의 설정을 위해 여기에서 설명한, 마이크론 규모의 공간 해상도 세포 세력의 부량 수 있도록합니다. 실험 프로토콜을 최적화하기 위해서는 ECM의 리간드의 균일한 코팅을 가진 순수하고 균일한 겔 기판을 형성하는 것이 중요합니다. 우리는 아래의 잠재적인 함정을 논의 :
비 균일한 겔 표면 또는 눈물 :
우리의 경험에서, 멋진 유니폼 젤을 형성하는 중요한 나타나는 몇 가지 단계가 있습니다. 귀하의 겔 표면 안에 어두운 구멍을 가지고 나타나는 경우에 대한 중합에 젤에 대한 고르지 소수성 표면을 형성 초과 비 - X의 방울이 완전히 유리 슬라이드에서 제거되지 않은 가능성이 높습니다. 또한, 우리는 매우 부드러운 젤에 대한 (<100 PA), 겔 표면으로 인해 제약 coverslip 표면에 점착 성의 PAA 젤의 팽창에 매우 고르지되는 것으로 나타났습니다,이 효과를 최소화하는 방법으로하는 것은 적절한 버퍼로 물을 교체하는 것입니다 이러한 것을 삼투압은 겔 중합에서 영상으로 유지됩니다.
립스 또는 겔 표면에 눈물이 여러 가지 요인에서 발생할 수 있습니다. 겔 중합이 coverslip - 슬라이드 샌드위치의 분해 이전에 완료되지 않으면이 큰 파열이나 눈물을 초래할 수 있습니다. coverslip 표면에 유리 슬라이드에 너무 많은 부착 (비 - X 코팅의 예 제거) 또는 너무 약한 접착 (활성화 coverslip 표면의 단계 또는 먼지가 환경에서 활성 coverslips 유지와 즉 문제)도 또는 대형 눈물을 초래할 수 표면에 립스. 마지막으로, PAA 젤은 coverslip / 슬라이드 샌드위치에 탈수하면서된다면, 눈물이 발생할 가능성이 높습니다 그리고 균열은 겔 표면에 걸쳐 시각하실 수 있습니다. <1 kPa의 강성과 젤과 함께 작업할 때 이러한 문제가 더 만연되고 있습니다. 눈물이나 립스는 종종 낮은 배율 (10 - 20x) 이전 ECM 커플링에 젤의 위상 콘트라스트 이미징 (조직 문화 현미경의 IE)에서 확인할 수 있습니다.
ECM 커플링 방법의 선택 :
Acryloyl - X에 ECM - 복합 대량의 결합은 훨씬하여 실행하는 가장 쉬운 방법 (라인 하트 - 킹 외., 2005)입니다. 우리는 10 %의 부피 분율에 설립 ECM / Acryoyl - X는 영향을 PAA 젤 강성을하지 않는 것으로 확인되었습니다. 이 기법의 두 가지 장점은 다음과 같습니다 그것이 ECM 단백질이 비싸 상황에 최적이며 (2) 대량 활용에도 매우 큰로 젤의 제조를 용이하게하므로 (1) 여기에 설명한 바와 같이, 그것은 ECM 단백질의 최소 금액을 사용 우리는 모래 바닥 서양이나 RT - PCR 실험을위한 PAA 젤로 코트 대형 유리 슬라이드에 사용한 표면 지역. 이 기술을 두 가지 제한이 표면 가능한 리간드의 총액의 변경 사항이 (우리가 10 % 부피 분율의 포화에 리간드의 표면 밀도를 발견)을 일부 단백질은 콜라겐 같은 단일의 겔에 통합하지 아르 자발적 중합 자신의 성향에 의한 방식.
히드 라진 수화물을 사용하여 PAA의 겔 표면에 단백질을 결합하는 리간드 밀도에서 가장 큰 범위를 제공뿐 아니라 실행하는 가장 복잡합니다. 우리는 fibronectin의 표면 밀도가 가능한 리간드가 정확하게 조정할 수 있습니다 이러한 산화 fibronectin 단백질의 농도를 (1-50 μg / ML에서) 변화에 의해 크게 변경될 수 있습니다 나타났습니다. 산화 반응에 fibronectin과 나트륨 메타 periodate의 충분히 높은 농도에서 fibronectin는 집계하고 강력하게 단백질의 균일한 코팅의 증착을 방해하실 수 있습니다. 로 다음 섹션에서 표시된주의 테스트는 단백질의 원하는 수량과 품질의 증착을 보장하기 위해 필요합니다. 우리는 또한 리간드의 공간적 분포 (스트 리커 외., 2010)을 제어하는 ECM 단백질의 마이크로 접촉 인쇄와 함께이 화학을 사용했습니다. 이 커플링의 또 다른 장점은 너무 적은 ECM 단백질이 필요합니다, 유사한 표면 밀도 결과에 커플링 단계에서 ECM의 리간드의 크게 (100x) 낮은 농도를 필요로한다는 것입니다. 이 기법의 단점은 참여 시간과 일부 단백질의 산화에 필요한 적절한 탄수화물 그룹의 부족입니다.
sulfo - SANPAH와 PAA의 겔 표면을 결합하는 방법은 강력하고 우리는 PAA 겔 표면에 부부 단백질의 다양한 범위를 사용합니다. 가장 중요한 단점은 ECM 단백질의 매우 높은 농도가 활용 단계 (1 MG / ML)과 표면 가능한 리간드의 적당한 양의 결과 중에 필요하다는 것입니다. 따라서이 방법은 ECM 단백질의 매우 높은 금액의 소비가 발생할 수 있습니다. 또 다른 함정은 가난으로 인해 sulfo - SANPAH의 반응의 상실로 인해 가난 커플링 수 있습니다준비하는 동안 저장하거나 시간이 지연. 그러나 이러한 불일치는 여기에 설명된 방법으로 최소한의 수 있습니다.
확인 및 표면 가능한 리간드의 부량 :
겔 표면에 단백질 리간드의 밀도를 확인하려면, 우리는 fibronectin (그림 2B) 또는 콜라겐에 대한 immunofluorescence 사용하고 보정 표준의 범위 (fibronectin 농도의 범위가 유리 adsorbed에 대한 겔 표면의 이미지의 강도를 비교해야 ). 더 많은 양적 조치 방사성 레이블링 (Rajagopalan 외., 2004)에서 할 수 있습니다. 여기에 ECM 프로토콜은 하나로 fibronectin의 약 같은 표면 밀도를 가지고 젤류를 조작하는 방법은 실온에서 1 시간에 대한 치료 유리 coverslip 10 μg / ML fibronectin을 adsorbing하여 얻을 것입니다 설명합니다. 이것은 잘 준수하고 확산되는 대부분의 세포가 충분합니다. 이것은 우리가 sulfo - SANPAH 또는 AcryoylX 방법을 사용하여 얻을있는 최대한의 표면 밀도이며 높은 표면 밀도는 히드 라진 수화물 방법과 얻을 수 있습니다.
나쁨 커플링 부적 절한 취급 및 sulfo - SANPAH 및 Acryloyl - X의 반응의 후속 손실로 인한 수 있습니다. 또한, 그것은 PAA 젤로 적절한 상호 연결하기 위해 상호 연결 요원으로 sulfo - SANPAH 또는 Acryloyl - X를 사용하는 경우 7.0 주변에서 세포외 기질 단백질의 산도를 유지하는 것이 중요합니다. 또한, 히드 라진 수화물 프로토콜의 산화 단계에서, 우리는 금액보다 나트륨 metaperiodate 높은 농도 여기서 겔 표면에 균일하게 몇 가지 않는 단백질의 큰 집계를 얻을 추천 것으로 나타났습니다.
한 조직 문화 플라스틱이나 유리 coverslips 작업하는 데 사용할 수 있습니다보다 세포가 소프트 겔 표면에 확산 오래 걸릴 부착하 수 있습니다.
젤 강성의 재현성 :
겔 요리법 독립적으로 대량 레올로지를 사용하여 겔 강성을 확인 여러 실험실 여러 손에에서 오랜 세월에 걸쳐 매우 재현성 강성과 젤류를 얻을 여기에서 설명한. 그럼에도 불구하고, 그것은 레올로지 방법에 의해 겔 강성을 확인하는 것이 좋습니다. 여기보고 강성은 전단 계수, 아니 영 계수입니다. 두 값이 E에 의해 관련되어 = 2G (1 + υ), E는의 영 계수이고, G는 전단 계수이며, υ는 소재의 포이슨의 비율입니다.
산소와 같은 금속 및 비 버퍼 이온과 같은 버퍼 또는 실험실 물, 이내 오염 물질의 존재가 일치 결과로 이어지는, 아크릴 아미드의 중합을 억제하실 수 있습니다. 또한, 5 ML 주식 솔루션은 실험 과정 동안 젤 수천의 제조를 용이하게하고, 따라서, 불일치를 최소화하기 위해 충분해야합니다. 그럼에도 불구하고, 그것은 레올로지 방법에 의해 겔 강성을 확인하는 것이 좋습니다.
겔 강성에 ECM 커플링에 대한 영향 :
우리는 Acroyl - X를 사용하여 ECM 단백질의 대량 활용은 PAA의 젤의 강성을 변경하지 않는 것으로 확인되었습니다. 기타 sulfo - SANPAH과 활용은 지역의 강성 (잉글러 외., 2004)에 영향을주지 않는 것으로 확인되었습니다.
비드 크기 선택 :
우리는 우리의 대표 이미지에 표시됩니다, 구슬 높은 밀도의 사용을 촉진하는 최적의 구슬 크기가 40 nm의 비즈를 발견했습니다. 이 구슬은 우리의 polyacrylamide 젤의 강성에 대한 영향을 측정하기 위해 다양한 분야 공촛점 현미경 모두 이미징을 촉진하기 위하여 충분히 밝은, 그러나 너무 큰되지 않습니다. 이미징을 촉진하기 위하여, 큰 구슬을 사용할 수 있습니다.
견인 힘 현미경 (TFM)의 유용한 애플 리케이션 :
준수 hydrogels과 TFM의 응용 프로그램은 광범하고 있습니다. 우리와 다른, 세포 분화, 증식, 이주 및 수축뿐만 아니라 초점 접착 조립, 유지 보수 및 해체의 여러 측면을 연구하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 중 억제하거나 단백질의 활동을 활성화 약리 요원들은 셀룰러 견인 세력의 특정 단백질의 역할을 조사하기 위해 TFM와 함께 사용되었습니다. 또한, 단백질의 운동 특성은 형광 현미경 작은 반점의 사용 (Gardel 외., 2008) 또는 photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)로 평가 수 있으며, 견인 세력에 상호. 또한, 견인 힘 노력에 단백질 분해의 영향을 조사하기위한 siRNA의 응용 프로그램은 또한 세포 biophysical 속성을 변경에서 특정 단백질의 역할을 평가하는 유용한 방법입니다. 모두, 고해상도 형광 현미경과 TFM의 조합은 조직의 역동적이고 기계적 특성을 연관시키는 강력한 접근 방식을 산출.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 셀룰러 견인 세력 (Sabass 외., 2008)의 부량에 사용되는 전산 추적 소프트웨어 울리히 슈바르츠의 실험실을 감사드립니다. 이 작품은 버로우즈 웰컴 경력 수상과 ML Gardel 의료 과학 국립 연구소 서비스 어워드 (5 T32 GM07281) SP 겨울에하는 NIH 원장의 파이 오니아 수상 (DP10D00354)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-aminopropyltrimethyoxysilane | Aldrich | 28, 177-8 | |
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% Bis-acrylamide | Fisher Scientific | BP1404 | |
| TEMED | Fisher Scientific | BP 150-20 | |
| Ammonium persulfate | Fisher Scientific | BP179 | |
| 40nm fluorescent micro-spheres | Invitrogen | F8789 | |
| Sulfo-SANPAH | Pierce, Thermo Scientific | 22589 | |
| Confocal imaging chamber (RC-30) | Warner Instruments | 64-0320 | |
| Coverslip spinner | Home made | NA | |
| Ultraviolet lamp CL1000 | UVP Inc. | 95-0228-01 | |
| Stainless steel rack | Electron Microscopy Sciences | 72239-04 | |
| acryloyl-X, SE (6-((acryloyl)amino)hexanoic acid) | Invitrogen | A-20770 | |
| Hydrazine hydrate | Sigma-Aldrich | 225819 | |
| Sodium meta-periodate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20504 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416-4 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Coverslips (#1.5) | Corning | 2940‐224 | |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16120 | |
| Rain-X | SOPUS Products | www.rainx.com | |
| Acetic Acid | Acros Organics | 64-19-7 |
References
- Damljanovic, V., Lajerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamid substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Engler, A., Bacakova, L. N. ewman, Hategan, C., Griffin, A., M, D. D. ischer Substrate compliance versus ligand in cell on gel responses. Biophys J. 86 ((1 Pt 1)), 617-628 (2004).
- Gardel, M. L., Sabass, B., Ji, L., Danuser, G., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. Traction stress in focal adhesions correlates biphasically with actin retrograde flow speed. J Cell Biol. 183, 999-1005 (2008).
- Rajagopalan, P., Marganski, W. A., Brown, X. Q., Wong, J. Y. Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata. Biophys J. 87 (4), 2818-2827 (2004).
- Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. The dynamics and mechanics of endothelial cell spreading. Biophys J. 89, 676-689 (2005).
- Stricker, J., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. Optimization of traction force microscopy for micron-sized focal adhesions. J. Phys: Condensed Matter. 22, 194104-194114 (2010).
- Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances. Biophys J. 94, 207-220 (2008).
- Yeung, T. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Waterman-Storer, C. M. Microtubule/organelle motility assays. Curr Protoc Cell Biol. , 13.1.1-13.1.21 (1998).
