Summary
Creazione di micro-tessuti con gel di collagene cilindriche, chiamati moduli, che contengono cellule embedded e la cui superficie è rivestita con le cellule endoteliali.
Abstract
Questo protocollo descrive la fabbricazione di un tipo di micro-tessuti chiamate moduli. L'approccio modulo genera uniforme, scalabile e tessuti vascolarizzati. I moduli possono essere fatte di collagene così come altri materiali gelable o reticolabile. Sono circa 2 mm di lunghezza e 0,7 mm di diametro sulla fabbricazione, ma ridursi in dimensione con le cellule incorporato o quando i moduli sono rivestite di cellule endoteliali. I moduli singolarmente sono abbastanza piccoli che le celle sono incorporate nel limitare la diffusione di ossigeno e altre sostanze nutritive, ma i moduli possono essere imballate insieme per formare tessuti che sono più grandi perfusable. Questi tessuti sono modulari in costruzione a causa diversi tipi di cellule possono essere incorporati in o rivestiti sui moduli prima di essere imballate insieme per formare tessuti complessi. Ci sono tre passi principali per rendere i moduli: (1) neutralizzare il collagene e l'incorporamento di cellule in esso, (2) gelificazione il collagene nel tubo e tagliare i moduli e (3) rivestimento dei moduli con le cellule endoteliali.
Protocol
1) Preparazione dei tubi
- Tagliare 2-3 m di lunghezza di tubo in polietilene (0,76 mm ID x 1,22 mm di diametro).
- Infilare un ago 20 G1 in una delle estremità del tubo.
- Bobina il tubo e posto in un self-sigillo sacchetto convertitori (7 1 / 2 "x 13"). Le due estremità del tubo deve essere collocato alla fine non sigillata della borsa e registrato sul posto con nastro a gas sterilizzazione.
- Borsa di tenuta e di gas sterilizzare.
2) Neutralizzazione di Collagene
Nota: 1 ml di collagene riempie circa 2 metri di tubo in polietilene.
- Mettere la quantità necessaria di collagene necessario per la lunghezza desiderata del tubo in un tubo da 15 ml e continuare su ghiaccio.
- Aggiungere 128 uL di 10x α-MEM per mL di collagene per il tubo e mescolare pipettare ripetutamente la soluzione. Nota: (1) La soluzione dovrebbe diventare giallo come la α-MEM è mescolato nel collagene acidificato e (2) cercare di minimizzare le bolle in fase di missaggio.
- Neutralizzare il collagene con l'aggiunta di bicarbonato di sodio 0,8 M fino a quando il collagene, ha un pH di 7,4. Per una stima generale del bicarbonato di sodio pH aggiungere fino a quando la soluzione di collagene giallo diventa di colore rosa chiaro. Nota: Si richiede in genere 30-60 microlitri per ogni ml di collagene.
- Tenere collagene neutralizzato sul ghiaccio fino al momento dell'uso, come il collagene viene neutralizzata gel se non mantenuto a 4 ° C.
3) Integrazione delle celle (opzionale)
Nota: a seconda del tipo di cellula le cellule possono essere incorporati ad una concentrazione compresa tra 1 milione di cellule per ml a 20 milioni di cellule per ml. Utilizzare il supporto necessario per le celle che si desidera incorporare.
- Rimuovere i supporti dalle cellule e lavare con 5 ml di PBS.
- Rimuovere PBS e aggiungere 3 mL tripsina-EDTA.
- Incubare le cellule in tripsina-EDTA per 5 min a 37 ° C.
- Risospendere le cellule in 7 dei media ml.
- Contare le celle.
- Trasferire il numero necessario di cellule per l'incorporamento di un tubo da 15 ml.
- Agglomerare le cellule a 300 xg per 5 min.
- Aspirare i media fuori il pellet cellulare.
- Risospendere le cellule del collagene neutralizzato e tenere in ghiaccio.
4) gelificanti di Collagene
- In una cappa di sicurezza biologica tagliare la fine della busta sigillata contenente il tubo in polietilene.
- Allegare una siringa da 3 ml l'ago 20G, alla fine, uno dei tubi con delle pinzette sterilizzate. Tenere il tubo nella borsa.
- Inserire l'altra estremità del tubo nel collagene neutralizzato fino a quando la punta si trova al fondo della provetta conica con una pinzetta sterilizzata. Tenere il tubo conico sul ghiaccio.
- Tirare il collagene nel tubo in polietilene da ritraendo lo stantuffo della siringa lentamente.
Nota: Se il collagene è tirato nel tubo per poi rapidamente bolle si formano nel collagene. - Dopo aver estratto il collagene attraverso il tubo, estrarre l'ago 20G di tubi e mettere entrambe le estremità indietro nel sacco. Nastro la borsa chiusa.
- Incubare il sacchetto a 37 ° C per 60 min. Se il collagene contiene cellule poi capovolgere il sacchetto sopra ogni 15 min. in modo che le cellule non accontentarsi di una parte del modulo.
5) Taglio di tubi contenenti il collagene gelificati
- Intestazioni autoclave e la lama per il dispositivo di taglio e il vassoio per contenere tubo.
- Montare il dispositivo di taglio.
- Tubo posto in un vassoio sterile di fronte a taglio dispositivo e caricare il tubo nel dispositivo di taglio.
- Impostare un tubo da 50 ml conica contenente 25 mL di mezzi in uscita del dispositivo di taglio per raccogliere i moduli di taglio.
Nota: i media Usa contenente FBS, anche per il collagene, solo i moduli come i moduli non separato dal tubo senza FBS nei media. Se i moduli contengono cellule utilizzano il supporto richiesto per le cellule embedded. Se non ci sono cellule incorporati nei moduli di usare i media per le cellule endoteliali. - Impostare il dispositivo di taglio per taglio 2 mm di lunghezza di tubo e tagliare il tubo.
- Incubare tagliare i moduli a 37 ° C per 60 min nel tubo da 50 ml.
6) Rimozione dei moduli collagene da tubi
- Vortex tubo 50 ml conica contenente moduli nel tubo per 10 secondi.
Nota: Sii gentile quando separazione moduli integrati con celle ad alta densità per evitare la rottura. - Lasciate che i moduli depositano sul fondo della provetta. Dura circa 5 minuti.
- Utilizzando un ampio bocca pipetta sierologica 10 ml trasferire i moduli si stabilirono in una provetta da 15 ml.
- Ripetere i passaggi 6,1-6,3 due volte.
- Passare al punto 7 per moduli cappotto con le cellule endoteliali o moduli di trasferimento a un non-tessuto piastra di coltura trattata.
7) rivestimento dei moduli con le cellule endoteliali
- Risolvere i moduli sul fondo di un tubo da 15 ml coniche con 5 ml di media per °e incorporati cellule.
- Rimuovere i supporti dalle cellule endoteliali e lavare con 5 ml di PBS.
- Rimuovere PBS e aggiungere 3 mL tripsina-EDTA.
- Incubare le cellule in tripsina-EDTA per 5 min a 37 ° C.
- Risospendere le cellule in 7 dei media ml.
- Contare le celle. Hai bisogno di 5x10 6 cellule endoteliali per ml di moduli imballato nella parte inferiore del tubo conico.
- Agglomerare le cellule a 300 xg per 5 minuti e risospendere in 5 ml di mezzi di comunicazione delle cellule endoteliali.
- Aggiungere i 5 ml di supporti contenenti cellule endoteliali ai moduli.
Nota: Questo dà un rapporto di 50:50 dei due tipi di supporto che abbiamo trovato a lavorare per la sopravvivenza e la funzione dei due tipi di cellule. Testare l'utilizzo di co-cultura medio formulato per garantire una corretta manutenzione dei fenotipi dei due tipi di cellule prima di utilizzarlo. - Incubare i moduli con le cellule endoteliali sia staticamente e dinamicamente.
- Per i moduli statici mix di incubazione con cellule endoteliali per inversione e la camera d'aria in posizione verticale a 37 ° C per 15 min. Ripeti.
- Dinamicamente seme le cellule endoteliali a dondolo con delicatezza il tubo a 37 ° C per 60 min.
- Ripetere l'incubazione statica due volte.
- Riposizionare i moduli in un piatto non tessuto coltura trattata e di incubare una notte a 37 ° C.
- Il luogo giorno dopo, i moduli in una nuova non-tessuto piastra di coltura trattata con mezzi freschi (miscela 50:50 se si usa co-coltura di sistema) per rimuovere unattached cellule endoteliali.
- Incubare i moduli che sono rivestite con le cellule endoteliali fino a che non coprono il 100% della superficie dei moduli. Questo richiede di solito circa 7 giorni.
8) Risultati Rappresentante:
I moduli cilindrici sarà la prima volta che vengono rimossi dal tubo. Se i moduli contengono cellule embedded e / o sono rivestite di cellule endoteliali possono contratto fino al 50% in volume e sviluppare una forma ovale (Figura 1). I moduli diventerà anche più denso e più opaco se visti al microscopio ottico (figura 1). Anche quando le cellule endoteliali sono confluenti sulla superficie dei moduli vi è una formazione di giunzioni strette, che può essere visto da immunofluorescenza di VE-caderina (Figura 2). Trasferimento di massa analisi ha dimostrato che i moduli sono in grado di supportare celle ad alta densità (8x10 7 cellule / cm 3) senza lo sviluppo di un core necrotico a causa di trasportare l'ossigeno inadeguato, che è spesso problematico in più tessuti (ad esempio moduli di grande diametro, D = 1,4 mm) (Figura 3).
Figura 1: Modulo di fabbricazione e contrazione. Contrazione del modulo si sono verificati durante i tre giorni successivi HUVEC-C (linea di cellule endoteliali) semina risultati significativamente più piccola di diametro modulo e la lunghezza (p <0,001) (A). Incorporato cellule HepG2 sono stati uniformemente distribuiti all'interno di moduli al momento della fabbricazione e mantenuto alta la vitalità (B). [Live cellule verdi, le cellule morte red] [adattato da Corstorphine 2010]
Figura 2: VE-caderina colorazione di immunofluorescenza di giunzioni cellulari CE strette 10 giorni dopo RAEC dove rivestito sulla superficie di un modulo. Barra di scala = 50 micron.
Figura 3: colorazione tricromica di Masson di moduli tipici (0,76 mm di diametro iniziale) e moduli di grandi dimensioni (1,4 mm di diametro iniziale) dimostrare l'effetto delle limitazioni di diffusione dell'ossigeno. Sette giorni dopo la fabbricazione, un gran numero di cellule morte si era formata all'interno del nucleo dei moduli di grandi dimensioni (pannello in basso a destra), lasciando solo un bordo sottile (~ 200μm di spessore) di cellule vitali. Al contrario, i piccoli moduli mantenuto una distribuzione uniforme ed elevato di cellule vive. [Moduli embedded con cellule HepG2 e rivestite con le cellule endoteliali.] [Tratto da Corstorphine 2010]
Figura 4: (A) HMEC-1 seminati su poloxamine - moduli di collagene. Dopo Giorno 1 del seeding del poloxamine-collagene moduli mantengono la loro forma cilindrica e non vi è limitata proprietà attaccamento delle cellule rispetto ai moduli collagene solo. Barra di scala = 200 micron. (B) Immagine al microscopio a luce di un modulo di collagene contenenti microsfere a base di PLGA biodegradabile. Barra di scala = 500 micron.
Figura 5: Esempi di test in vitro. (A) saggio Angiogenesi: capillare come formazioni sul modulo seminati con cellule endoteliali possono essere facilmente individuati e quantificati dopo 5 giorni di incubazione con derivate da tessuto adiposo cellule staminali. (B) immagini di microscopia confocale di un saggio dal vivo / morto sui moduli in cui la snenti di cellule vive è verde e per le cellule morte è rosso.
Figura 6: i moduli di collagene contenenti incorporato cellule staminali mesenchimali e di uno strato superficiale di cellule endoteliali. I moduli sono stati esposti a sollecitazioni di taglio (~ 0,64 dyn / cm 2) per 7 giorni in una camera di microfluidica e cominciano a mostrare la fusione nei punti di contatto. Le cellule endoteliali sono colorati con vWF (marrone) e nuclei di cellule staminali mesenchimali appaiono blu (H & E). Barra di scala = 100μm.
Figura 7: Centinaia di moduli di collagene contenenti derivate da tessuto adiposo cellule staminali (ASC) e rivestito con cellule endoteliali microvascolari (HMEC) vengono impiantate sotto la pelle del topo per studiare ASC / HMEC interazione in vivo per le applicazioni di rigenerazione grasso.
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Discussion
Abbiamo fabbricato diversi diversi micro-tessuti con moduli integrati con diversi tipi di cellule 1-11. Abbiamo incorporato con successo cardiomiociti primari, isolotti, le cellule staminali adipose e cellule stromali mesenchimali così come diverse linee cellulari tra cui HepG2, NIH 3T3 e clonare 9 cellule del fegato. Abbiamo ricoperto i moduli con vari tipi di cellule endoteliali, comprese le cellule endoteliali aortiche ratto, cellule endoteliali della vena ombelicale e le cellule endoteliali microvascolari. I moduli sono stati realizzati con una miscela di collagene e di un polimero poloxamine o contenenti microsfere a rilascio di farmaco (Figura 4). Numerose prove in vitro hanno dimostrato di essere compatibili con i moduli inclusi immunofluorescenza, Western Blot, l'angiogenesi, Alamar blu proliferazione e test dal vivo / morto (Figura 5). Essi sono stati utilizzati anche in camere di microfluidica (Figura 6) e impiantati in topi e ratti (Figura 7) per studiare l'interazione tra diversi tipi di cellule e come le micro-tessuti sono rimodellata dalla risposta dell'ospite. I moduli sono molte applicazioni e può essere utilizzato per lo studio degli effetti della cultura del tessuto 3D sulle cellule, l'interazione di diverse cellule in una conformazione 3D, rimodellamento di micro-tessuti in una camera microfluidica e nel rimodellamento vivo di micro-tessuti da un host di risposta.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Il finanziamento è stato fornito dal National Institutes of Health (EB 001013), scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada e Canadian Institutes of Health Research. Ringraziamo il Dott. AP McGuigan per la sua esperienza e aiutare nello sviluppo di moduli.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intramedic tubing PE60 | BD Biosciences | 427416 | Different diameter of tubing can be used to change the diameter of the modules |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO, by Life Technologies | 20012-027 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25200-072 | |
| Purcol acidificed collagen, 3 mg/mL | Cedarlane Labs | 5005-B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| 20G needle | BD Biosciences | 305175 | Diameter of the needle needs to be similar to the diameter of the tubing |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | 309585 | |
| 15 mL tube | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 mL tube | BD Biosciences | 352070 | |
| Convertors Self-Seal Pouch 7 1/2” x 13” | Cardinal Health | 92713 | |
| 10 ml Wide Tip serological pipet | BD Biosciences | 357504 | |
| 10 ml serological pipet | BD Biosciences | 357551 | |
| 5 ml serological pipet | BD Biosciences | 357543 |
References
- Chamberlain, M. D., Gupta, R., Sefton, M. V. Chimeric vessel tissue engineering driven by endothelialized modules. , (2010).
- Corstorphine, L. E., Sefton, M. V. Effectiveness factor and diffusion limitations in collagen gel modules containing HepG2 cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2010).
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- McGuigan, A. P., Leung, B., Sefton, M. V. Fabrication of cell-containing gel modules to assemble modular tissue-engineered constructs [corrected]. Nat Protoc. 1, 2963-2969 (2006).
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- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Design criteria for a modular tissue-engineered construct. Tissue Eng. 13, 1079-1089 (2007).
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- Sosnik, A., Leung, B., McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Collagen/poloxamine hydrogels: cytocompatibility of embedded HepG2 cells and surface-attached endothelial cells. Tissue Eng. 11, 1807-1816 (2005).
