Summary
Criação de micro-tecidos utilizando gel de colágeno cilíndricos, chamados módulos, que contêm células embarcados e cuja superfície é revestida com as células endoteliais.
Abstract
Este protocolo descreve a fabricação de um tipo de micro-tecidos chamados de módulos. A abordagem módulo gera uniforme, tecidos escalável e vascularizada. Os módulos podem ser feitas de colágeno, bem como outros materiais gelable ou reticulável. Eles são cerca de 2 mm de comprimento e 0,7 mm de diâmetro sobre a fabricação, mas encolher de tamanho com células incorporado ou quando os módulos são revestidos com células endoteliais. Os módulos individualmente são pequenos o suficiente que as células incorporados estão dentro do limite de difusão de oxigênio e outros nutrientes, mas módulos pode ser embalado para formar tecidos maiores que são perfusable. Estes tecidos são modulares na construção, porque tipos diferentes de células pode ser incorporado em ou revestidos nos módulos antes de serem embalados para formar tecidos complexos. Há três passos principais para fazer os módulos: (1) neutralizar o colágeno e incorporação de células-lo, (2) gelificação do colágeno no tubo e corte os módulos e (3) revestimento dos módulos com células endoteliais.
Protocol
1) Preparação de Tubos
- Corte 2-3 comprimentos m de tubos de polietileno (0,76 mm de diâmetro x 1,22 milímetros OD).
- Um fio de agulha 20 G1 em uma das extremidades do tubo.
- Tubos de bobina e coloque em uma bolsa de conversores auto-vedação (7 1 / 2 "x 13"). As duas extremidades do tubo devem ser colocados no final unsealed do saco e gravado no local com fita de esterilização a gás.
- Saco de vedação e gás esterilizar.
2 Neutralização) de colágeno
Nota: 1 ml de colágeno preenche cerca de 2 m de tubos de polietileno.
- Coloque a quantidade necessária de colágeno necessário para o comprimento desejado de tubo em um tubo cônico de 15 ml e manter em gelo.
- Adicionar 128 uL de 10x α-MEM por mL de colágeno para o tubo e misturar por pipetagens repetidas da solução. Nota: (1) A solução deve girar o amarelo como o α-MEM é misturado na colágeno acidificado e (2) tentar minimizar bolhas, quando a mistura.
- Neutralizar o colágeno, adicionando bicarbonato de sódio 0,8 M até que o colágeno tem um pH de 7,4. Para uma estimativa geral do bicarbonato de sódio pH adicionar até a solução de colágeno amarela vira uma cor rosa claro. Nota: Ele normalmente leva 30-60 mL por cada mL de colágeno.
- Mantenha colágeno neutralizado em gelo até estar pronta para usar como o colágeno neutralizado vai gel se não forem mantidas a 4 ° C.
3) Incorporação de Cells (Opcional)
Nota: Dependendo do tipo de célula que as células podem ser incorporados em uma concentração de entre 1 milhão de células por ml a 20 milhões de células por mL. Use o meio necessário para as células que você deseja incorporar.
- Remova a mídia a partir de células e lavar com 5 mL de PBS.
- Remover PBS e adicionar 3 mL de tripsina-EDTA.
- Incubar as células em tripsina-EDTA por 5 min a 37 ° C.
- Ressuspender as células em 7 mL de mídia.
- Contagem de células.
- Transferir o número necessário de células para a incorporação de um tubo cônico de 15 mL.
- Agregar as células a 300 xg por 5 min.
- Aspirar mídia fora do pellet de células.
- Ressuspender as células do colágeno neutralizada e manter em gelo.
4) gelificação do Colágeno
- Em um armário de segurança biológica corte a extremidade selada do saco que contém o tubo de polietileno.
- Anexar uma seringa de 3 ml para a agulha 20G, no final, um dos tubos, usando uma pinça esterilizada. Manter o tubo no saco.
- Insira a outra extremidade do tubo no colágeno neutralizado até que a ponta está no fundo do tubo cônico, usando uma pinça esterilizada. Manter o tubo cônico no gelo.
- Puxe o colágeno na tubulação de polietileno retraindo o êmbolo da seringa devagar.
Nota: Se o colágeno é puxado para dentro do tubo de forma rápida, em seguida, irá formar bolhas no colágeno. - Depois de puxar o colágeno através do tubo, puxe a agulha 20G de tubulação e colocar ambas as extremidades de volta para o saco. Saco de fita fechada.
- Incubar a bolsa a 37 ° C por 60 min. Se o colágeno contém células, então, virar o saco sobre cada 15 minutos. para que as células não se contentar com um lado do módulo.
5) Corte de Tubos Contendo o colágeno coagulada
- Cabeçalhos autoclave e lâmina para o dispositivo de corte e bandeja para segurar a tubulação.
- Montar o dispositivo de corte.
- Tubulação lugar em uma bandeja estéril na frente do dispositivo de corte e carga do tubo no dispositivo de corte.
- Configurar um tubo cônico de 50 mL contendo 25 mL dos meios de comunicação na saída do dispositivo de corte para recolher os módulos de corte.
Nota: Use mídia contendo FBS mesmo para colágeno somente módulos como os módulos não se separam da tubulação sem FBS na mídia. Se os módulos contêm células usam os meios de comunicação necessários para as células incorporado. Se não houver células incorporados nos módulos usar a mídia para as células endoteliais. - Definir o dispositivo de corte para cortar 2 mm de comprimento tubos e cortar a tubulação.
- Incubar módulos corte a 37 ° C por 60 min no tubo cônico de 50 mL.
6) A remoção do colágeno Módulos de Tubulação
- Vortex tubo cônico de 50 mL contendo módulos na tubulação por 10 seg.
Nota: Seja gentil quando separar módulos integrados com alta densidade de células para evitar a ruptura. - Deixe módulos para liquidar o fundo do tubo. Leva cerca de 5 min.
- Usando uma boca larga pipeta 10 mL sorológicos transferir os módulos resolvido a um tubo de 15 mL cônico.
- Repita os passos 6,1-6,3 duas vezes.
- Vá para a etapa 7 para módulos de revestimento com células endoteliais ou módulos de transferência para uma placa de cultura não-tecido tratado.
7) Revestimento os módulos com células endoteliais
- Settle módulos no fundo de um tubo cônico com 15 mL 5 mL dos meios de comunicação para poe incorporados células.
- Remova a mídia a partir de células endoteliais e lavar com 5 mL de PBS.
- Remover PBS e adicionar 3 mL de tripsina-EDTA.
- Incubar as células em tripsina-EDTA por 5 min a 37 ° C.
- Ressuspender as células em 7 mL de mídia.
- Contagem de células. Precisa de 5x10 6 células endoteliais por mL de módulos embalado na parte inferior do tubo cônico.
- Agregar as células a 300 xg por 5 min e ressuspender em 5 mL de mídia das células endoteliais.
- Adicione o de 5 mL da mídia contendo células endoteliais para os módulos.
Nota: Isto dá uma proporção de 50:50 de dois tipos de mídia que nós encontramos para trabalhar para a sobrevivência ea função de ambos os tipos de células. Testar o uso de um meio de co-cultura formulada para garantir a manutenção adequada dos fenótipos dos dois tipos de células antes de usá-lo. - Incubar os módulos com as células endoteliais tanto estática e dinamicamente.
- Para os módulos de incubação estática misturar com células endoteliais por inversão e definir o tubo na posição vertical a 37 ° C por 15 min. Repetir.
- Dinamicamente a semente células endoteliais-o suavemente o tubo a 37 ° C por 60 min.
- Repita duas vezes de incubação estática.
- Coloque os módulos em uma placa de cultura de tecidos não-tratados e incubar durante a 37 ° C.
- O lugar no dia seguinte os módulos em uma placa nova cultura não-tecido tratado com meios frescos (mistura 50:50, se usar o sistema de co-cultura) para remover unattached células endoteliais.
- Incubar módulos que são revestidos com células endoteliais até cobrir 100% da superfície dos módulos. Isso geralmente leva cerca de 7 dias.
8) Resultados Representante:
Os módulos vão olhar cilíndrica quando eles são removidos do tubo. Se os módulos contêm células incorporados e / ou são revestidos com células endoteliais que podem contratar até 50% em volume e desenvolver uma forma oval (Figura 1). Os módulos também se tornará mais densa e mais opaco quando vistos por microscopia de luz (Figura 1). Além disso, quando as células endoteliais são confluentes na superfície dos módulos há uma formação de tight junctions que pode ser visto por imunofluorescência da VE-caderina (Figura 2). Análise de transferência de massa demonstrou que os módulos são capazes de suportar altas densidades celulares (8x10 7 células / cm 3), sem desenvolver um núcleo necrótico devido ao transporte de oxigênio inadequada, o que muitas vezes é problemático em tecidos maiores (por exemplo, módulos de grande diâmetro, D = 1,4 mm) (Figura 3).
Figura 1: Módulo de fabricação e contração. Contração módulo ocorreu durante os três dias seguintes HUVEC-C (linhagem de células endoteliais) semeadura resultados diâmetro módulo significativamente menor e comprimento (p <0,001) (A). Incorporados células HepG2 foram distribuídos uniformemente dentro dos módulos no momento da fabricação e manteve alta viabilidade (B). [Live células verdes; células mortas red] [adaptado de Corstorphine 2010]
Figura 2: VE-caderina coloração de imunofluorescência de junções celulares CE apertado 10 dias após RAEC onde revestidas na superfície de um módulo. Barra de escala = 50 mm.
Figura 3: coloração tricrômico de Masson de módulos típicos (0,76 mm de diâmetro inicial) e grandes módulos (1,4 mm de diâmetro inicial) demonstrar o efeito das limitações de difusão de oxigênio. Sete dias após a fabricação, um grande número de células mortas tinham formado dentro do núcleo das grandes módulos (painel inferior direito), deixando apenas uma fina borda (~ 200μm de espessura) de células viáveis. Por outro lado, os módulos pequenos retida uma distribuição uniforme e elevado de células vivas. [Módulos incorporado com células HepG2 e revestidos com células endoteliais.] [Extraído de Corstorphine 2010]
Figura 4: (A) HMEC-1 semeado em poloxamine - módulos de colágeno. Após o dia 1 de semear os módulos poloxamine colágeno mantêm a sua forma cilíndrica e não há propriedades apego limitado de células do colágeno em comparação com os módulos apenas. Barra de escala = 200 mM. (B) imagem do microscópio de luz de um módulo de colágeno contendo PLGA baseado em microesferas biodegradáveis. Barra de escala = 500 mm.
Figura 5: Exemplos de ensaios in vitro. (A) A angiogênese ensaio: capilar, como formações no módulo semeadas com células endoteliais podem ser facilmente detectados e quantificados após 5 dias de incubação com células-tronco derivadas de tecido adiposo. (B) imagens de microscopia confocal de um ensaio ao vivo / morto em módulos, onde o sFORMAÇÃO PARA células vivas é verde e de células mortas é vermelho.
Figura 6: Módulos de colágeno contendo embutidos células-tronco mesenquimais e uma camada superficial de células endoteliais. Módulos foram expostos a tensão de cisalhamento (~ 0,64 dyn / cm 2) por 7 dias em uma câmara microfluídicos e começar a mostrar a fusão em pontos de contato. Células endoteliais estão manchadas com vWF (marrom) e núcleos de células mesenquimais aparecem em azul (H & E). Barra de escala = 100μm.
Figura 7: Centenas de módulos de colágeno contendo células-tronco derivadas de tecido adiposo (ASC) e revestidos com células endoteliais microvasculares Humanos (HMEC) são implantados sob a pele do rato para estudar ASC / HMEC interação in vivo para aplicações de regeneração de gordura.
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Discussion
Nós fabricamos diversas micro-tecidos usando módulos integrados com diferentes tipos de células 1-11. Conseguimos incorporados cardiomiócitos primária, ilhotas, células-tronco adiposas e células mesenquimais do estroma, bem como várias linhagens de células incluindo HepG2, NIH 3T3 e clone 9 células do fígado. Temos os módulos revestidos com vários tipos de células endoteliais de aorta de ratos, incluindo células endoteliais, células endoteliais da veia umbilical humana e humanos células endoteliais microvasculares. Módulos também foram produzidas com uma mistura de colágeno e um polímero poloxamine ou contendo microesferas farmacológico (Figura 4). Vários ensaios in vitro foram mostrados para ser compatível com os módulos, incluindo imunofluorescência, Western Blot, a angiogênese, azul alamar proliferação e ensaios ao vivo / morto (Figura 5). Eles também têm sido utilizados em microfluídica câmaras (Figura 6) e implantados em camundongos e ratos (Figura 7) para estudar a interação entre diferentes tipos de células e tecidos como o micro-são remodeladas pela resposta do hospedeiro. Módulos têm muitas aplicações e pode ser usado para o estudo do efeito da cultura de tecidos em 3D sobre as células, a interação de diferentes células em uma conformação 3D, remodelação de micro-tecidos em uma câmara microfluídicos e na remodelação vivo de micro-tecidos por um host resposta.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
O financiamento foi fornecido pelo National Institutes of Health (EB 001.013), Ciências Naturais e Pesquisa de Engenharia Council of Canada e Canadian Institutes of Health Research. Agradecemos ao Dr. AP McGuigan por sua experiência e ajudar no desenvolvimento de módulos.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intramedic tubing PE60 | BD Biosciences | 427416 | Different diameter of tubing can be used to change the diameter of the modules |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO, by Life Technologies | 20012-027 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25200-072 | |
| Purcol acidificed collagen, 3 mg/mL | Cedarlane Labs | 5005-B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| 20G needle | BD Biosciences | 305175 | Diameter of the needle needs to be similar to the diameter of the tubing |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | 309585 | |
| 15 mL tube | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 mL tube | BD Biosciences | 352070 | |
| Convertors Self-Seal Pouch 7 1/2” x 13” | Cardinal Health | 92713 | |
| 10 ml Wide Tip serological pipet | BD Biosciences | 357504 | |
| 10 ml serological pipet | BD Biosciences | 357551 | |
| 5 ml serological pipet | BD Biosciences | 357543 |
References
- Chamberlain, M. D., Gupta, R., Sefton, M. V. Chimeric vessel tissue engineering driven by endothelialized modules. , (2010).
- Corstorphine, L. E., Sefton, M. V. Effectiveness factor and diffusion limitations in collagen gel modules containing HepG2 cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2010).
- Gupta, R., Van Rooijen, N., Sefton, M. V. Fate of endothelialized modular constructs implanted in an omental pouch in nude rats. Tissue Eng. Part A 15, 2875-2887 (2009).
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- McGuigan, A. P., Leung, B., Sefton, M. V. Fabrication of cell-containing gel modules to assemble modular tissue-engineered constructs [corrected]. Nat Protoc. 1, 2963-2969 (2006).
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- Sosnik, A., Leung, B., McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Collagen/poloxamine hydrogels: cytocompatibility of embedded HepG2 cells and surface-attached endothelial cells. Tissue Eng. 11, 1807-1816 (2005).
