Summary
וידאו זה מראה כיצד לגרום hypophysitis אוטואימוניות בעכברים SJL וכיצד להעריך חומרתה ידי histopathology.
Abstract
Hypophysitis אוטואימוניות ניתן לשחזר בניסוי ידי הזרקה של חלבונים יותרת המוח מעורב עם adjuvant לעכברים רגישים 1. מודלים עכבר מאפשרים לנו ללמוד כיצד להתפתח מחלות, לעתים קרובות מתן העתק טוב של אותם תהליכים המתרחשים בבני אדם. עבור כמה מחלות אוטואימוניות, כמו סוכרת מסוג 1A, יש מודלים (העכבר NOD) כי באופן ספונטני לפתח מחלה דומה מקבילו האנושי. עבור רבים מחלות אוטואימוניות אחרות, לעומת זאת, המודל צריך להיות המושרה בניסוי. הגישה הנפוצה בהקשר זה היא להזריק את העכבר עם אנטיגן דומיננטי נגזר איבר הנלמד. לדוגמה, החוקרים מעוניינים השימוטו אוטואימוניות להזריק עכברים עם thyroglobulin 2, למעוניינים מיאסטניה גרביס להזריק אותם עם קולטן האצטילכולין 3. אם autoantigen למחלה אוטואימונית מסוימת אינה ידועה, החוקרים להזריק תמצית חלבון גולמי של איבר המטרה מהתגובה אוטואימוניות. עבור hypophysitis אוטואימוניות, autoantigen פתוגניים (ים) להישאר להיות מזוהה 4, ובכך הכנה גולמי חלבון יותרת המוח משמש. במאמר זה אנו וידאו להדגים כיצד לגרום hypophysitis אוטואימוניות הניסוי בעכברים SJL.
Protocol
ניסיוני פרוטוקול
לאחר immunogen יותרת המוח מוכן (ראה מאמר נלווה), הוא מוזרק תת עורי לעכברים SJL (מעבדות ג'קסון, 000,686 מניות). הזרקת זהה השני הוא חזר 7 ימים לאחר מכן. עכברים משמשים כדי לאסוף in vivo ו שלאחר המוות התוצאות.
שלב 1. תת עורי הזרקת immunogen יותרת המוח לעכברים SJL
עכברים מורדמים לראשונה על ידי הזרקת 0.5 מ"ל של 20 Tribromoethanol-2,2,2 מ"ג / מ"ל (Avertin, TCI אמריקה, T-1420) intraperitoneally. עכברים מוזרקים תת עורית אז עם 100 μl של אמולסיה יותרת המוח כי, כפי שצוין המלווה יופיטר 2181 מאמר זה, מכיל 1 מ"ג של תמצית בלוטת יותרת המוח ו 0.25 מ"ג של פרוינד משלים של שלמה. התחליב מוזרק באזור הגב רגל שמאל האחורית ((50 μL) ובאזור המפשעה ימין (50 μL). אמולסיה יותרת המוח מוזרק שוב אל מול אתרי (50 μl באזור הגב רגל ימין האחוריות וביום 7 50 μl באזור מפשעתי משמאל). עכברים מנוטרים יומי במשך 3 הימים הראשונים בשבוע אז עד יום של הקרבה, שהוא בדרך כלל 28 ימים לאחר החיסון הראשון.
שלב 2. איסוף בתוצאות vivo: מבחני דם
הרקמה הנפוצה ביותר להעריך את תוצאות הניסוי תוך העכברים עדיין בחיים הוא דם. הדם הוא נמשך באופן שגרתי 14 ימים לאחר החיסון הראשון כדי למדוד את רמות נוגדנים יותרת המוח או סמנים אחרים כמו ציטוקינים chemokines.
הדם נאסף עכברים חיים כדלקמן. עכברים מוחזקים היטב בעורפו של הצוואר והחלק האחורי של עצם הלסת ממוקמת. לאחר האחורי של עצם הלסת ממוקמת, 4 אזמלי מ"מ המשמשים לנקב את צרור וסקולרית submandibular. אחרי הדם נאסף, לחץ על מקום באזור באמצעות ספוגית אלכוהול כדי למנוע שטף דם. הדם שנאסף centrifuged ב 2000 גרם במשך 20 דקות, ומאוחסנים ב -80 ° C עד בשימוש.
שלב 3. איסוף שלאחר המוות התוצאות: יותרת המוח histopathology
עכברים הם הקריבו בדרך כלל 28 ימים לאחר החיסון הראשון. התכונה הקרדינל צורך לקבוע את האבחנה של EAH היא חדירה של בלוטת יותרת המוח על ידי תאים mononuclear hematopoietic.
עכברים מומתים על ידי הצבת אותם בתא פלסטיק אטום כי הוא perfused עם CO 2. עכברים מוחזקים בחדר עבור סכום כולל של 8 דקות. לאחר המתת חסד, בלוטת יותרת המוח נאסף כמתואר במאמר נלווה. בלוטת יותרת המוח הפגוע נראה נפוח יותר חסיד היטב מאטר הדורה שמסביב. מלקחיים שארפ משמשים כדי לשחרר את קרומי המוח המקיף את המוח. לאחר מהלכים יותרת המוח בחופשיות על העצם יתדי, קצה אחד של בלוטת יותרת המוח נתפסת עם מלקחיים את בלוטת יותרת המוח הוא הרים בזהירות. הבלוטה ממוקמת אז צינור microcentrifuge המכיל 5 מקבע של Beckstead. בלוטת יותרת המוח היא קבועה לילה, עטוף בנייר העדשה, והושמו קלטת. בלוטות מעובדים מכן באמצעות פרוטוקול הבאים:
| תחנה מספר | מגיב | הזמן בדקות | טמפרטורה (צלזיוס) |
| 1 | 70% אלכוהול | 5 | 25 |
| 2 | 70% אלכוהול | 15 | 25 |
| 3 | 95% אלכוהול | 15 | 25 |
| 4 | 95% אלכוהול | 15 | 25 |
| 5 | 100% אלכוהול | 15 | 25 |
| 6 | 100% אלכוהול | 7.5 | 25 |
| 7 | 100% אלכוהול | 7.5 | 25 |
| 8 | קסילן | 20 | 25 |
| 9 | קסילן | 20 | 25 |
| 10 | קסילן | 25 | |
| 11 | פרפין | 30 | 58 |
| 12 | פרפין | 5 | 58 |
| 13 | פרפין | 5 | 58 |
לאחר עיבוד, בלוטות יותרת המוח המוטבעים פרפין לפחות 5 סעיפים nonconsecutive (5-מיקרומטר עבה) נחתכים מבלוטת כל אחד. לאחר חתך, בלוטות הם מוכתמים hematoxylin ו eosin, וניתח לכמת את חדירת mononuclear. קטע עם חדירה החמור ביותר נבחרה מניה. חומרת הוא הבקיע מבוסס על אומדן סובייקטיבית של מידת החלפת הרס בלוטת יותרת המוח הקדמית או על ידי תאים חיסוניים: ציון 0, לא מחלה, כיתה 1, 2% -20% מעורבות, כיתה 2, 20% -30%; בדרגה 3, 30% -50%; כיתה 4, 50% -90%; ציון 5, יותר מ 90%. סעיפים כל הבקיע על ידי שני אנשים מסונוורים למקור הסעיפים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ארבע טכניקות דווחו לגרום hypophysitis בחיות מעבדה. השיטה המתוארת במאמר זה, כי הוא הזרקה של חלבונים יותרת המוח מעורב עם משלים של פרוינד, הוא אחד העתיקים, שראשיתה 1967 6, שופרה לאחרונה 1. טכניקות אחרות הן הזרקה של גליקופרוטאינים וירוס מסיסים אדמת בשנת 1992 7, הזרקת stereotactic של adenovirus ישירות לתוך בלוטת יותרת המוח בשנת 2002 8, ואת השתלת בלוטות יותרת המוח מהלחץ עכברוש אחד תחת הקפסולה כליות של זן אחר חולדה בשנת 2010 9 . היתרון העיקרי של גישה adjuvant של פרוינד היא שזה פחות פולשנית, עקבית יותר, ומעל לכל, מדויק יותר וגורם למחלה הדומה המקבילה האנושית. השיטה המתוארת במאמר זה וידאו תשואות מודל לשחזור של hypophysitis, אשר ניתן להשתמש בהם על ידי החוקרים כדי לשפר את ההבנה שלנו של מחלה זו מרתק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק DK080351 למחשב, ועל ידי מתנה נדיבה של טרי משפחה קריסטין גור.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SJL mice (The Jackson Laboratories) | stock 000686 | ||
| 2,2,2-Tribrom–thanol (Avertin) | TCI America | T-1420 | |
| Beckstead’s fixative |
References
- Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model. Endocrinology. , (2008).
- Twarog, F. J., Rose, N. R. The production of thyroid autoantibodies in mice. J Immunol. 101, 242-2450 (1968).
- Patrick, J., Lindstrom, J. Autoimmune response to acetylcholine receptor. Science. 180, 871-872 (1973).
- Caturegli, P. Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s). J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).
- Beckstead, J. H. A simple technique for preservation of fixation-sensitive antigens in paraffin-embedded tissues: addendum. J Histochem Cytochem. 43, 345-345 (1995).
- Levine, S. Allergic adenophypophysitis: new experimental disease of the pituitary gland. Science. 158, 1190-1191 (1967).
- Yoon, J. W., Choi, D. S., Liang, H. C., Baek, H. S., Ko, I. Y., Jun, H. S., Gillam, S. Induction of an organ-specific autoimmune disease, lymphocytic hypophysitis, in hamsters by recombinant rubella virus glycoprotein and prevention of disease by neonatal thymectomy. Journal of Virology. 66, 1210-1214 (1992).
- Davis, J. R., McMahon, R. F., Lowenstein, P. R., Castro, M. G., Lincoln, G. A., McNeilly, A. S. Adenovirus-mediated gene transfer in the ovine pituitary gland is associated with hypophysitis. J Endocrinol. 173, 265-271 (2002).
- Rotondo, F., Quintanar-Stephano, A., Asa, S. L., Lombardero, M., Berczi, I., Scheithauer, B. W., Horvath, E., Kovacs, K. Adenohypophysitis in rat pituitary allografts. Int J Exp Pathol. , (2010).
