Summary
Bu video otoimmün hipofizitis SJL fareler ve histopatoloji ile şiddetini değerlendirmek için nasıl ikna etmek için nasıl gösterir.
Abstract
Otoimmün hipofizitis, duyarlı farelere 1 içine bir adjuvan ile karışık hipofiz proteinlerin enjeksiyonu ile deneysel olarak üretilebilir . Fare modelleri genellikle insanlarda meydana gelen aynı süreçler iyi bir kopyası sağlayarak, bize hastalıkları nasıl açılmak çalışma izin verir. Tip 1A diyabet gibi bazı otoimmün hastalıklar için, insan meslektaşı benzer bir hastalık kendiliğinden geliştirmek modelleri (NOD fare) vardır. Ancak, diğer pek çok otoimmün hastalıklar için model deneysel olarak ihtiyacı var. Bu konuda ortak bir yaklaşım, çalışılan organ türetilen baskın bir antijen ile fare enjekte edilmesidir. Örneğin, otoimmun tiroidit ilgilenen araştırmacılar tiroglobulin 2 farelere enjekte ve myastenia gravis ilgilenenler asetilkolin reseptörü 3 enjekte. Belirli bir otoimmün hastalık için otoantijen bilinen değilse, araştırmacılar otoimmün reaksiyonu ile hedef organ ham protein ekstresi enjekte. Otoimmün hipofizitis, patojen otoantijen (ler) 4 tanımlanabilir kalır ve böylece ham hipofiz protein hazırlanmasında kullanılır . Bu video makalede SJL farelerde deneysel otoimmün hipofizitis nasıl ikna göstermektedir.
Protocol
Deneysel Protokolü
Hipofiz immünojen (arkadaşı makalesine bakın) hazırlandıktan sonra, subkutan SJL fareler (Jackson Laboratuvarları, stok 000.686) içine enjekte edilir. 7 gün sonra ikinci bir aynı enjeksiyon tekrarlanır. Fare sonra in vivo ve post-mortem sonuçlarını toplamak için kullanılır.
1. Adım. Hipofiz immünojen SJL farelere subkutan enjeksiyon
Fare ilk kez, 20 mg / ml 2,2,2-Tribromoethanol 0,5 ml (Avertin, TCI Amerika, T-1420) intraperitoneal olarak enjekte edilerek anestezi. Fareler, 2181 makale vallahi arkadaşı belirtildiği gibi, hipofiz emülsiyon 100 ul sonra subkutan enjekte hipofiz özü ve tam Freund adjuvan 0.25 mg, 1 mg. Emülsiyon sol dorsal arka bacak bölgesi ((50 mcL) ve sağ inguinal bölge (50 mcL) enjekte edilir. Hipofiz emülsiyon ters siteleri (50 ul ve sağ dorsal arka bacak bölgede 7 gün tekrar enjekte edilir. sol inguinal bölgede 50 ul). Fareler ilk 3 gün için günlük olarak izlenmekte ve gün kurban, genellikle ilk aşıdan sonra 28 gün kadar sonra haftalık.
2. Adım. In vivo sonuçlarının toplanması: Kan testleri
Fareler hala hayatta iken en yaygın deneysel sonuçlarını değerlendirmek için kullanılan doku kan. Kan hipofiz antikorları veya sitokinler ve kemokinler gibi diğer belirteçlerin serum düzeyleri ölçmek için ilk aşıdan sonra 14 gün rutin olarak çizilir.
Kan, aşağıdaki gibi canlı fareler toplanır. Fare boynun ense tarafından güvenli bir şekilde tutulur ve çene kemiğinin arkasında yer alır. Çene kemiğinin arkasında yer alır sonra, 4 mm lancets delmek için submandibular vasküler paket kullanılır. Kan toplandıktan sonra, alanda yer basıncı hematom önlemek için bir alkollü bez kullanarak. Toplanan kan 20 dakika boyunca 2.000 g santrifüj ve -80 ° C'ye kadar saklanır.
Adım 3. Post-mortem sonuçlarının toplanması: Hipofiz histopatoloji
Fareler genellikle ilk aşıdan sonra 28 gün kurban. EAH tanısı kurmak için gerekli kardinal özellik hipofiz bezi hematopoetik mononükleer hücreler tarafından infiltrasyonu.
Fare, CO 2 ile perfüze mühürlü bir plastik odasında yerleştirerek ötenazi . Fareler 8 dakika olmak üzere toplam oda tutulur. Ötenazi sonra, hipofiz bezinin arkadaşı makalede açıklandığı gibi toplanır. Hastalıklı bir hipofiz bezi şişmiş ve çevreleyen dura mater daha sıkıca yapışmış görünüyor. Keskin forseps hipofiz çevreleyen meninksler gevşetmek için kullanılır. Bir kez sfenoid kemik serbestçe hipofiz hamle, hipofiz bezinin bir ucunu forseps ile kavradı ve hipofiz bezinin dikkatli bir şekilde kaldırdı. Bezinin sonra Beckstead fiksatif 5 içeren bir mikrosantrifüj tüp yerleştirilir. Hipofiz bezi, bir gecede sabit mercek kağıdı ile sarılmış ve bir kaset yerleştirilir. Bezleri sonra aşağıdaki protokolü kullanılarak işlenir:
| İstasyon Numarası | Reaktif | Time Dakika | Sıcaklık (Celsius) |
| 1 | % 70 alkol | 5 | 25 |
| 2 | % 70 alkol | 15 | 25 |
| 3 | % 95 alkol | 15 | 25 |
| 4 | % 95 alkol | 15 | 25 |
| 5 | % 100 alkol | 15 | 25 |
| 6 | % 100 alkol | 7,5 | 25 |
| 7 | % 100 alkol | 7,5 | 25 |
| 8 | ksilen | 20 | 25 |
| 9 | ksilen | 20 | 25 |
| 10 | ksilen | 25 | |
| 11 | parafin | 30 | 58 |
| 12 | parafin | 5 | 58 |
| 13 | parafin | 5 | 58 |
Işledikten sonra, hipofiz bezi parafine ve her bezinden en az 5 ardışık olmayan bölümler (5 mikron kalınlığında) kesilir. Bezleri, kesit sonra hematoksilen ve eozin ile boyanmış, ve mononükleer infiltrasyon ölçmek için analiz. En şiddetli infiltrasyon bölümünde puanlama için seçilir. Şiddeti bağışıklık hücreleri tarafından ön hipofiz değiştirme veya imha ölçüde öznel bir tahmine göre atılırsa: derece 0, herhangi bir hastalığı; grade 1,% 2 -20% katılımı; evre 2, 20% -30%; grade 3, 30% -50%; grade 4, 50% -90%; grade 5,% 90 daha fazla. Tüm bölümler bölümleri kaynak kör iki kişi tarafından puanlanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dört teknikleri, deney hayvanlarında hipofizitis ikna etmek için bildirilmiştir. Freund s adjuvan ile karışık enjeksiyon hipofiz proteinlerin bu makalede anlatılan tekniği, 1967 6 kadar uzanan en eski ve daha yakın zamanda 1 geliştirilmiştir. Diğer teknikler, 1992 7 çözünür kızamıkçık virüsü glikoproteinler enjeksiyon, 2002 8'de doğrudan hipofiz bezine bir adenovirüs stereotaktik enjeksiyon, ve 2010 9, başka bir sıçan suşu böbrek kapsülü altında bir sıçan suşu hipofiz bezlerinin nakli . Freund adjuvan yaklaşımın ana avantajı, insan meslektaşı yakından benzer bir hastalıklara neden daha doğru, daha tutarlı ve daha az invazif, her şeyden önce, olmasıdır. Bu video makalede açıklanan teknik hipofizitis tekrarlanabilir bir model, bu büyüleyici bir hastalık anlayışımızı geliştirmek için araştırmacılar tarafından kullanılabilir verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibe DK080351 PC ve Terry ve Kristine Gore ailesi cömert bir hediye tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SJL mice (The Jackson Laboratories) | stock 000686 | ||
| 2,2,2-Tribrom–thanol (Avertin) | TCI America | T-1420 | |
| Beckstead’s fixative |
References
- Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model. Endocrinology. , (2008).
- Twarog, F. J., Rose, N. R. The production of thyroid autoantibodies in mice. J Immunol. 101, 242-2450 (1968).
- Patrick, J., Lindstrom, J. Autoimmune response to acetylcholine receptor. Science. 180, 871-872 (1973).
- Caturegli, P. Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s). J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).
- Beckstead, J. H. A simple technique for preservation of fixation-sensitive antigens in paraffin-embedded tissues: addendum. J Histochem Cytochem. 43, 345-345 (1995).
- Levine, S. Allergic adenophypophysitis: new experimental disease of the pituitary gland. Science. 158, 1190-1191 (1967).
- Yoon, J. W., Choi, D. S., Liang, H. C., Baek, H. S., Ko, I. Y., Jun, H. S., Gillam, S. Induction of an organ-specific autoimmune disease, lymphocytic hypophysitis, in hamsters by recombinant rubella virus glycoprotein and prevention of disease by neonatal thymectomy. Journal of Virology. 66, 1210-1214 (1992).
- Davis, J. R., McMahon, R. F., Lowenstein, P. R., Castro, M. G., Lincoln, G. A., McNeilly, A. S. Adenovirus-mediated gene transfer in the ovine pituitary gland is associated with hypophysitis. J Endocrinol. 173, 265-271 (2002).
- Rotondo, F., Quintanar-Stephano, A., Asa, S. L., Lombardero, M., Berczi, I., Scheithauer, B. W., Horvath, E., Kovacs, K. Adenohypophysitis in rat pituitary allografts. Int J Exp Pathol. , (2010).
