Summary
قمنا بتطوير بروتوكول بسيطة وقابلة للتكرار للوصول إلى استجابة فوهي للبكتيريا حية. هذا الأسلوب يقلل من اصابة والتلاعب في أوراق بالمقارنة مع استخدام قشور البشرة ذكرت سابقا.
Abstract
الثغور هي الفتحات الطبيعية في البشرة النباتية المسؤولة عن تبادل الغازات بين النبات والبيئة الداخلية. تتشكل من قبل زوج من خلايا الحرس ، والتي هي قادرة على إغلاق المسام فوهي ردا على عدد من العوامل الخارجية بما في ذلك شدة الضوء ، تركيز ثاني أكسيد الكربون ، والرطوبة النسبية (RH). المسام فوهي هو أيضا الطريق الرئيسي لدخول العامل الممرض في الأوراق ، وخطوة حاسمة بالنسبة لتطور المرض. وقد كشفت الدراسات الحديثة أن إغلاق المسام فعال في الحد من تطور المرض الجرثومي في النباتات Arabidopsis ، جزءا لا يتجزأ من مناعة النبات الفطرية. سابقا ، وقد استخدمنا قشور البشرة لتقييم الاستجابة للعيش فوهي البكتيريا (Melotto وآخرون 2006) ؛ الحفاظ على الظروف البيئية غير المواتية لقشور النبات على حد سواء البشرة والخلايا البكتيرية قد التحدي. يمكن أن تبقى على قيد الحياة ورقة البشرة وصحية مع العازلة زارة التربية والعلم (10 ملي بوكل ، 25 مم ، MES كوه ، ودرجة الحموضة 6.15) للتجارب الكهربية للخلايا الحراسة. ومع ذلك ، هذا المخزن ليس من المناسب للحصول على تعليق البكتيرية. من ناحية أخرى ، يمكن أن تبقى على قيد الحياة في الخلايا البكتيرية الماء الذي ليس من المناسب للحفاظ على القشور البشرة لفترة طويلة من الوقت. عندما يطفو على الماء قشر البشرة ، والخلايا في القشرة التي تتعرض لجفاف الهواء في غضون 4 ساعات الحد من توقيت لإجراء التجربة. يجب على الأسلوب الأمثل لتقييم تأثير حافز خاص على خلايا الحرس الحاضر إلى الحد الأدنى من التدخل الفيزيولوجيا فوهي وعلى البيئة الطبيعية من النبات قدر الإمكان. نحن ، بالتالي ، وضعت طريقة جديدة لتقييم الاستجابة للعيش فوهي البكتيريا التي يتم تصغير كثيرا اصابة الأوراق والتلاعب التي تهدف إلى توفير مقايسة استنساخه بسهولة وموثوق بها فوهي. يستند هذا البروتوكول على تلوين أوراق سليمة مع يوديد propidium (PI) ، حضانة تلوين نبات مع تعليق البكتيرية ، والمراقبة من أوراق تحت مجهر المسح الضوئي ليزر متحد البؤر. أخيرا ، وهذا الأسلوب يسمح للمراقبة من العينة نبات يعيش نفسه على مدى فترات طويلة من الوقت باستخدام الظروف التي تحاكي بشكل وثيق في ظل الظروف الطبيعية التي تتعرض للهجوم من قبل النباتات مسببات الأمراض.
Protocol
1. زراعة النباتات والبكتيريا إعداد
- لبدء هذا الإجراء زرع بذور Arabidopsis على ت 01:01:01 : V : V خليط من متوسط النمو (ريدي الأرض وتخلط المكونات الشتلات ، أحد غرو) ، الفيرميكوليت غرامة ، والبيرلايت.
- تنمو النباتات في غرفة النمو (22 درجة مئوية ، 12 ساعة من الضوء μmol / مم 2 / ثانية 100 يوميا و 65 ± 5 ٪ رطوبة) والماء حسب الحاجة. محطات جاهزة للاستخدام في 4-6 أسابيع عندما يكون لديهم أوراق الشباب توسعت بشكل كامل قبل انشقاقه.
- قبل يومين من بدء التجربة تعد ثقافة بكتيريا. خط الزائفة syringae من المخزون الجلسرين على تعديل المتوسطة LB (10 جم / لتر تريبتون ، 5 ز / لتر خلاصة الخميرة ، 5 ز / لتر كلوريد الصوديوم الهيدروجيني 7.0 ، وأجار 1.5 ٪) ، واحتضان لمدة 24 ساعة عند 28 درجة مئوية. استخدام ثقافة جديدة لإعداد اللقاح والثقافة لوحات تبدأ دائما من المخزونات الجلسرين والبكتيريا يصبح أقل ضراوة بعد الفرعي زراعة.
- استخدام البكتيريا التي تنمو على لوحة لبدء ثقافة 10 مل من السائل P. syringae في دورق مخروطي 50 مل. احتضان الثقافة بين عشية وضحاها حتى 28 درجة مئوية مع قوي يهز حتى تصل الكثافة البصرية أو OD في 600 نانومتر بين 0.8 و 1.
- قياس OD في 600 وحصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 1360 x ج لمدة 10 دقائق. Resuspend الخلايا في الماء المقطر بحيث OD النهائي هو 0.2. OD هذا يتوافق مع 10 وحدات تشكيل مستعمرة 8 (CFU) / مليلتر. مع استعداد البكتيريا ، والمضي قدما لإعداد أوراق وأداء الفحص.
2. يلطخ الأوراق والحضانة مع البكتيريا
- من أجل إعداد أوراق صمة أول 20 ميكرومتر أو يوديد propidium PI حل في الماء. 10 مل من محلول يكفي لصبغ 3 يترك صغيرة في وقت واحد.
- استرداد النباتات من النمو وغرفة مع ملقط فصل 3 الشباب يترك بالكامل الموسع. تزج يترك كله في حل بي لمدة 5 دقائق. ثم إزالة يترك لهم فترة وجيزة وشطف مع الماء المقطر.
- المكان التالي ورقة مع السطح السفلي لأسفل على شريحة المجهر. قطع ورقة بشفرة حلاقة حادة في أربعة قطع الوريد باستثناء منتصف بحيث يضع ورقة مسطحة على الشريحة.
- لاحتضان هذه البكتيريا مع الأوراق ، وإضافة 300 ميكرولتر من تعليق الجرثومي تحت قطعة ورق على الشريحة. تأكد من أن السطح السفلي للورقة على اتصال مع اللقاح.
- احتضان العينات تحت نفس الظروف البيئية التي كانت تستخدم لزراعة النباتات. في ذلك الوقت لمراقبة يترك تحت المجهر ، ونقل القطع ورقة لشريحة جديدة مع انخفاض سطح مواجهة. لاحظ أن لا يتم استخدام زلة تغطية عندما تصاعد الشرائح. ولا يمكن تصوير نموذج ورقة نفسه عدة مرات خلال الحضانة ، ويمكن تحديد مسار الزمن حتى وفقا لأهداف البحث.
3. المجهري والقياس وتحليل البيانات
- هنا يستخدم ليزر المسح المجهر مبائر (LSM 510 ميتا ، وشركة كارل زايس) لفحص الأوراق. مراقبة السطح السفلي من الأوراق للكشف عن ومضان من PI (الإثارة 453 نانومتر ، وانبعاث 543 نانومتر 620).
- باستخدام عينات من أوراق نفس التقاط الصور من الثغور على مر الزمن. حفظ الصور لقياس عرض الفتحة فوهي.
- قياس فوهي عرض فتحة لا يقل عن 60 الثغور لكل معاملة في كل نقطة زمنية باستخدام متصفح LSM الصورة.
- حساب المتوسط ومعيار الخطأ لعرض الفتحة فوهي. ويمكن حساب الدلالة الإحصائية للنتائج باستخدام 2 الذيل ، طالبة الحكمة المقترنة لاختبار t.
4. ممثل صور الاستجابة لفوهي الحضانة مع البكتيريا
- هنا صورة نموذجية المجهرية (باستخدام هدفا 20X) من سطح الورقة Arabidopsis تحت مجهر المسح الضوئي ليزر متحد البؤر في مجال عرض مشرق (الشكل 1).
- البقع يوديد Propidium جدار الخلية من الخلايا قادرة على البقاء وزيادة وضوح من خلايا الحرس بالإضافة إلى السماح لتحديد الخلايا غير التالفة لجمع البيانات (الشكل 2). ويمكن رؤية مجموعة من فتحات المسام فوهي في هذه micrographs ، من الثغور مغلقة تماما لالثغور مفتوحة على مصراعيها.
- ويتم تحديد الثغور مغلقة تماما من شكل خلايا الحرس (الشكل 3). ويعتبر عرض الفتحة لتكون 0 ميكرون.
- لالثغور المفتوحة (الشكل 4) ويقاس عرض الفتحة أظهرت باستخدام خط مستقيم عبر رسمها على أوسع نطاق منطقة فوهي المسام.
- هذه هي النتائج التجريبية نموذجية من هذا الاختبار فوهي. Arabidopis يترك وحضنت في الظلام مع ثلاث سلالات مختلفة من syringae الزائفة. فقط للبكتيريا وكان توقيت المحيط الهادي DC3000 قادرا على فتح الثغور المغلقة المظلمة ، وتقاس على النحو الذي عرض فتحة الثغور 60 تم اختيارها عشوائيا في سلالة بكتيرية (الشكل 5).
الشكل 1. صورة مجهرية من السطح من نبات Arabidopsis. حقل واحد من عرض من سطح ورقة تحت المجهر متحد البؤر المسح بالليزر (LSCM) باستخدام الهدف 20X. علما بأن الفتحة فوهي ليس كما يتضح عند مقارنة عرض الفلورسنت بمساعدة من تلطيخ يوديد propidium (الشكل 2).
الشكل 2. صورة مجهرية من سطح ورقة propidium Arabidopsis يوديد الملطخة. حقل واحد من عرض من سطح ورقة تحت المجهر متحد البؤر المسح بالليزر (LSCM) باستخدام الهدف 20X. لاحظ مجموعة من فتح المسام فوهي. وأشار إلى إغلاق الأسهم الصفراء تماما الثغور وأشار السهام الاخضر لالثغور مفتوحة على مصراعيها.
الشكل 3. تماما الثغور التي حددتها وثيقة على شكل وفتح بين الحرس الخلايا ويعتبر العرض لتكون الفتحة 0 ميكرون.
الشكل 4. الثغور المفتوحة يظهر عرض الفتحة في ميكرون. أخذت قياسات باستخدام متصفح LSCM على أساس خط مستقيم عبر رسمها على أوسع مساحة فوهي المسام.
الشكل 5. بقيت DC3118 ، DB29 ، وDC3000 النباتات في الظلام خلال فترة التجريب : الفتحة فوهي من أوراق Arabidopsis المحتضنة مع ثلاث سلالات البندورة الكهروضوئية syringae الزائفة... وتظهر النتائج على النحو يعني (ن = 50-70) ± الخطأ القياسي. تم الكشف عن دلالة إحصائية مع تجارب ر ثنائي الطرف الطالب. وتكررت التجربة ثلاث مرات مع نتائج مماثلة.
Discussion
قدمنا إجراء مستقيم إلى الأمام لقياس الفتحة فوهي في أنسجة نبات سليمة تسمح بتقييم سهولة استجابة فوهي للعلاجات المختلفة.
على الرغم من أننا قد قدمت النتائج باستخدام نظام نموذجي Arabidopsis / syringae الزائفة ، يمكن فحص أوراق سليمة فوهي تنفيذ محتملة مع أي مزيج من النباتات بكتيريا. ويمكن بسهولة البروتوكول يمكن تعديلها لتناسب متطلبات نمو النباتات الأخرى ، ومسببات الأمراض البكتيرية. والمبدأ العام والإجراءات لا تزال هي نفسها. بالإضافة إلى ذلك ، هذا الأسلوب قد تكون مفيدة للباحثين الذين يرغبون في الدراسة الفنية للانتاج خلايا الحرس ليس فقط للعيش الميكروبات ، ولكن أيضا لمنبهات أخرى ، والعوامل الكيميائية في ظل الظروف التي تحافظ على البيئة الطبيعية لنبات.
يمكن نبات كله يكون من الصعب الصورة بسبب سماكة والتضاريس متفاوتة. ويمكن التخفيف من حدة هذه المشكلة عن طريق إزالة الوريد منتصف الورقة بحيث يضع مسطح على الشريحة وباستخدام المجهر مبائر. ومع ذلك ، يمكن استخدام أنواع أخرى من مضان المجهر للحصول على صور عالية الدقة لسطح الورقة.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث من خلال منحة من المعهد الوطني للصحة وجامعة تكساس في أرلينغتون إنشاء صناديق لMM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-1 | |
| Yeast Extract | Difco Laboratories | 0127-01-7 | |
| Sodium Chloride | VWR international | 7647-14-5 | |
| Agar | Bio Express | J637-2500G | |
| Plant growth chamber | |||
| Shaker incubator | |||
| Laser scanning confocal microscope |
References
- Brooks, D. M., Hernandez-Guzman, G., Kloek, A. P., Alarcon-Chaidez, F., Sreedharan, A., Rangaswamy, V., Penaloza-Vazquez, A., Bender, C. L., Kunkel, B. N. Identification and characterization of a well-defined series of coronatine biosynthetic mutants of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Mol Plant-Microbe Interact. 17, 162-174 (2004).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis Book. Somerville, C. R., Meyerowitz, E. M. , American Society of Plant Biologists. Rockville, MD. (2002).
- Ma, S. W., Morris, V. L., Cuppels, D. A. Characterization of a DNA region required for production of the phytotoxin coronatine by Pseudomonas syringae pv. tomato. Mol Plant-Microbe Interact. 4, 69-74 (1991).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126, 969-980 (2006).
