Summary
Мы разработали простой и воспроизводимый протокол для доступа к устьичного ответ на живые бактерии. Этот метод минимизирует ранения и манипуляции листа по сравнению с использованием пилинга эпидермиса сообщалось ранее.
Abstract
Устьица естественные отверстия в эпидермисе завода отвечает за газовый обмен между интерьером растений и окружающей среды. Они образуются пары замыкающих клеток, которые способны закрыть устьичного пор в ответ на ряд внешних факторов, включая интенсивность света, концентрация углекислого газа, а относительная влажность (RH). Устьичного пор является основным маршрутом для возбудителя вступления в листьях, важнейшим шагом для развития болезни. Недавние исследования обнародовал, что закрытие пор является эффективным в минимизации бактериальной развития заболевания в Arabidopsis растений; неотъемлемой частью завода врожденного иммунитета. Ранее мы использовали эпидермальный пилинг для оценки устьичного ответ на живые бактерии (Melotto и др. 2006.), Однако сохранение благоприятных экологических условий для завода эпидермального пилинги и бактериальных клеток было сложной задачей. Лист эпидермиса могут быть сохранены живыми и здоровыми с MES-буфера (10 мМ KCl, 25 мМ MES-KOH, рН 6,15) для электрофизиологических экспериментов охраны клеток. Тем не менее, этот буфер не подходит для получения бактериальной суспензии. С другой стороны, бактериальные клетки могут быть поддержана в воде, которая не является правильной для поддержания эпидермальный пилинг в течение длительного времени. При эпидермальной плавает кожуры на воде, клетки в кожуре, которые подвергаются воздействию воздуха сухим в течение 4 часов предельные сроки для проведения эксперимента. Идеальный метод для оценки влияния конкретного раздражителя на страже клетки должны представить минимальные помехи устьичного физиологии и окружающей природной среде завода как можно больше. Поэтому мы разработали новый метод оценки устьичного ответ на живые бактерии, в которых ранены листьев и манипуляции существенно минимизировать с целью оказания легко воспроизводимые и надежные устьичного анализа. Протокол основан на окрашивании интактных лист с пропидий йодида (PI), инкубации окрашивание листьев с бактериальной суспензии и осмотр листьев при лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Наконец, этот метод позволяет для наблюдения же жить образец листа в течение длительного периода времени, используя условия, которые точно имитировать природные условия, при которых растения подвергаются нападению болезнетворных микроорганизмов.
Protocol
1. Выращивание растений и подготовка бактерии
- Чтобы начать эту процедуру сеять семена арабидопсиса на 1:01:01 V: V: смесь питательная среда (Реди-земля плагин и рассады смесь, ВС Гру), декоративные вермикулит, перлит и.
- Рост растений в ростовой камере (22 ° С, 12 часов 100 мкмоль / мм 2 / сек дневного света и 65 ± 5% влажности) и воду по мере необходимости. Растения готовы к использованию через 4-6 недели, когда у них есть молодые листья полностью расширена до болтов.
- За два дня до начала эксперимента подготовить бактерии культуры. Pseudomonas syringae подряд из глицерина акций на изменение LB среде (10 г / л триптон, 5 г / л дрожжевого экстракта, 5 г / л NaCl, рН 7,0, и 1,5% агара) и выдержать в течение 24 часов при температуре 28 ° C. Используйте свежие культуры подготовить посевной и всегда начинаются культуры плит из глицерина запасов как бактерии становятся менее вирулентным после высеве.
- Использование бактерий, которые росли на пластину, чтобы начать 10 мл жидкости культуры P. syringae в 50 мл колбу Эрленмейера. Инкубируйте культуру в течение ночи при 28 ° C с энергичного встряхивания, пока не достигнет оптической плотности или ОП при 600 нм от 0,8 до 1.
- Измерьте оптическую плотность при 600 и урожай клетки центрифугированием при 1360 мкг в течение 10 минут. Ресуспендируют клеток в дистиллированной воде, так что окончательный диаметр составляет 0,2. Это OD соответствует 10 8 колониеобразующих единиц (КОЕ) / мл. С бактериями готов, приступить к подготовке листья и началу анализа.
2. Окрашивание листьев и инкубации с бактериями
- Для того, чтобы пятно листьев сначала подготовить 20 мкМ иодида пропидий или PI раствора в воде. 10 мл раствора достаточно для окрашивания 3 маленьких листьев за один раз.
- Получить растений от роста камеры и щипцами отделить 3 молодых, полностью расширена листьев. Погрузите все листья в решение PI течение 5 минут. Затем удалите листья и промыть их кратко дистиллированной водой.
- Следующее место листа с нижней поверхностью вниз на предметное стекло микроскопа. Вырезать лист с острым лезвием бритвы на четыре части исключения середине вены, так что лист лежит плашмя на слайде.
- Для инкубации бактерий с листьями, добавить 300 мкл бактериальной суспензии под листом штук на слайде. Убедитесь, что нижняя поверхность листьев находится в контакте с посевной.
- Инкубируйте образцы на тех же условиях окружающей среды, которые используются для выращивания растений. В то время для наблюдения листья под микроскопом, передача листа части, чтобы новый слайд с нижней поверхностью вверх. Обратите внимание, что покровное стекло не используется при монтаже слайдов. Же образец листа могут быть отображены несколько раз во время инкубации и время курс может быть настроена в соответствии с целями исследования.
3. Микроскопии, измерения и анализа данных
- Здесь лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (LSM 510 Мета, Carl Zeiss, Inc) используется для проверки листьев. Обратите внимание на нижнюю поверхность листьев для обнаружения флуоресценции PI (возбуждение 453 нм, излучение 543 и 620 нм).
- Используя те же образцы листьев захвата изображений устьиц с течением времени. Сохранить изображение для измерения ширины устьичных диафрагмы.
- Мера устьичного ширина отверстия не менее 60 устьиц для каждой обработки в каждый момент времени с помощью браузера LSM изображения.
- Подсчитать средние и стандартные ошибки для устьичного ширину диафрагмы. Статистическая значимость результатов можно вычислить с помощью 2-хвост, соединенные мудрым Стьюдента-тест.
4. Представитель Изображения устьичного Ответ на Инкубация с бактериями
- Вот типичные микроскопические изображения (с использованием 20-кратным цель) Arabidopsis поверхности листа при лазерной сканирующей конфокальной микроскопии при ярком поле зрения (рис. 1).
- Пропидий йодида пятна клеточной стенки жизнеспособных клеток увеличения видимости охранника клеток в дополнение к возможности для идентификации неповрежденных клеток для сбора данных (рис. 2). Диапазон устьичных отверстий пор можно увидеть в этих снимках, с полностью закрытым устьиц на широко открытые устьица.
- Полностью закрыты устьица идентифицируются по форме охранника клетки (рис. 3). Отверстие шириной считается 0 мкм.
- Для открытых устьиц (рис. 4) отверстие шириной показано измеряется с помощью прямой линии, проведенной через самую широкую область устьичного поры.
- Это типичные экспериментальные результаты этого устьичного анализа. Arabidopis листьев инкубировали в темноте с тремя различными штаммами Pseudomonas syringae. Только бактерии Pst DC3000 смог открыть темно-замкнутых устьиц, измеряемое отверстие шириной 60 случайно выбранных устьиц на штамм бактерий (рис. 5).
Рисунок 1. Микрофотография поверхности листьев Arabidopsis. Один в поле зрения листовой поверхности при лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (LSCM) с помощью 20-кратного объектива. Обратите внимание, что устьичного диафрагма не является столь очевидным, когда по сравнению с люминесцентными зрения помогали пропидий окрашивания йодида (рис. 2).
Рисунок 2. Микрофотография поверхности пропидий йодо-окрашенных листьев Arabidopsis. Один в поле зрения листовой поверхности при лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (LSCM) с помощью 20-кратного объектива. Обратите внимание, диапазон устьичного открытия поры. Желтыми стрелками указаны полностью закрыть устьица и зеленые стрелки указывают на широко открытые устьица.
Рисунок 3. Полностью закройте устьиц, определенные формы и отверстие между замыкающих клеток. Отверстие шириной считается 0 мкм.
Рисунок 4. Открытое устьиц показывает диафрагму шириной в мкм. Измерения проводились с помощью LSCM браузер, основанный на прямой линии, проведенной через широкую область устьичного поры.
Рисунок 5. Устьичного отверстие Arabidopsis листьев инкубировали с трех штаммов Pseudomonas syringae ру помидор:.. DC3118, DB29, а DC3000 растения находились в темноте во время экспериментов времени. Результаты представлены как среднее (п = 50-70) ± стандартная ошибка. Статистическая значимость была обнаружена с двумя хвостами Стьюдента-тест. Эксперимент был повторен три раза с аналогичными результатами.
Discussion
Мы представили прямо вперед процедура измерения устьичного отверстие в неповрежденной ткани листа позволяет легко оценку устьичного ответ на различные виды лечения.
Хотя мы представили результаты, используя Arabidopsis модель системы / Pseudomonas syringae, нетронутой листа устьичного анализа потенциально может быть выполнена с любого завода-бактерия комбинации. Протокол может быть легко изменена, чтобы соответствовать требованиям роста других растений и бактериальных патогенов. Общие принципы и процедуры остаются теми же. Кроме того, этот метод может быть полезным для исследователей, которые желают учиться функциональных выход замыкающих клеток не только жить микробы, но и на другие стимулы и химических агентов в условиях, сохранить природную среду листа.
Всего листьев может быть трудно изображения за счет его толщины и неравномерным рельефом. Эта проблема может быть смягчена путем удаления вен середине листа так он лежит плашмя на слайд и с помощью конфокальной микроскопии. Тем не менее, другие виды флуоресцентный микроскоп может быть использован для получения снимков высокого разрешения поверхности листьев.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантом Национального института здоровья и Университета штата Техас в Арлингтоне созданы средства для ММ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-1 | |
| Yeast Extract | Difco Laboratories | 0127-01-7 | |
| Sodium Chloride | VWR international | 7647-14-5 | |
| Agar | Bio Express | J637-2500G | |
| Plant growth chamber | |||
| Shaker incubator | |||
| Laser scanning confocal microscope |
References
- Brooks, D. M., Hernandez-Guzman, G., Kloek, A. P., Alarcon-Chaidez, F., Sreedharan, A., Rangaswamy, V., Penaloza-Vazquez, A., Bender, C. L., Kunkel, B. N. Identification and characterization of a well-defined series of coronatine biosynthetic mutants of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Mol Plant-Microbe Interact. 17, 162-174 (2004).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis Book. Somerville, C. R., Meyerowitz, E. M. , American Society of Plant Biologists. Rockville, MD. (2002).
- Ma, S. W., Morris, V. L., Cuppels, D. A. Characterization of a DNA region required for production of the phytotoxin coronatine by Pseudomonas syringae pv. tomato. Mol Plant-Microbe Interact. 4, 69-74 (1991).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126, 969-980 (2006).
