全葉のイメージングを使用して細菌細胞をライブに気孔反応を評価する

Summary

我々は、生菌に対する気孔の応答にアクセスするためのシンプルで再現性のプロトコルを開発しました。表皮皮の使用と比較して、この方法では、葉の傷や操作を最小限に抑えることが以前に報告した。

Abstract

気孔は、植物のインテリアと環境の間でガス交換を担当し、植物の表皮の自然な開口部です。彼らは光強度、二酸化炭素濃度、および相対湿度（RH）などの外部要因の数に応じて気孔気孔を閉じたりしている孔辺細胞、のペアによって形成される。気孔の孔は、また、病気の開発のための重要なステップの葉への病原体のエントリのための主要な経路である。最近の研究では、細孔の閉鎖は、 シロイヌナズナ植物に細菌性疾患の開発を最小限に抑えるのに有効であることを明らかにした。植物自然免疫の重要な部分を。以前は、我々は細菌を（。Melottoら、2006）生きて気孔の応答を評価するために表皮の皮を使用しているが、植物表皮のピーリングと細菌の細胞の両方のために有利な環境条件を維持するには挑戦されています。葉の表皮は、孔辺細胞の電気生理学的実験のためのMES緩衝液（10mMのKCl、25mMのMES - KOH、pHは6.15）との生存と健康的に保つことができます。しかし、このバッファは、細菌懸濁液を得るためには適切ではありません。一方、細菌細胞は、倍の長時間表皮皮を維持するために、適切ではない水に保つ事が可能。水で表皮剥離フロートは、4時間以内に空気乾燥にさらされている皮の細胞は、実験を実施するタイミングを制限するとき。孔辺細胞の特定の刺激の効果を評価するための理想的な方法は、気孔生理学にし、できるだけ多くの植物の自然環境への干渉を最小限に提示する必要があります。我々は、したがって、葉の傷や操作が大幅に容易に再現性と信頼性の高い気孔アッセイを提供することを目指して最小化されている細菌を生きて気孔の応答を評価する新しい方法を開発した。プロトコルは、ヨウ化プロピジウム（PI）、細菌懸濁液を葉の染色のインキュベーション、および共焦点顕微鏡を走査型レーザーの下での葉の観察と生葉の染色に基づいています。最後に、このメソッドは、密接に、植物が病原体によって攻撃される際の自然条件を模倣する条件を使用して、長時間にわたって同じライブ葉の試料の観察が可能になります。

Protocol

1。成長する植物と準備細菌

1. V：：Vの生育培地の混合物（熱地-地球のプラグと苗ミックス、サングロ）、細かいバーミキュライト、パーライトおよびこの手順を開始するには、午前1時01分01秒Vのシロイヌナズナの種子をまく。
2. 成長チャンバー（22℃、100μモル/ mm ^2の /秒毎日の光と65の12時間± 5％湿度）及び必要に応じて水で植物を育てる。植物は、彼らが前にボルトに若い完全に展開された葉を持っている場合4-6週間で使用する準備が整いました。
3. 実験を始める前に二日は、細菌の培養を準備。修正されたLB培地（10g / Lのトリプトン、5g / Lの酵母エキス、5g / lの塩化ナトリウム液（pH7.0）、および1.5％寒天）と28で24時間インキュベート℃の上にグ ​​リセロールストックからストリークシュードモナスシリン接種を準備し、常に細菌が継代培養後の弱毒になるとグリセロールストックから培養プレートを開始するために新鮮な培養を使用してください。
4. P. 10 mLの液体培養を開始するためにプレート上に成長した細菌を使用してください50 mLの三角フラスコにシリン 。 28で一晩培養液を振とうしながら精力的で、Cをそれが0.8と1の間の600 nmにおける光学密度またはODに達するまで。
5. 600 ODを測定し、10分間1360 × gで遠心分離により細胞を収穫。最後のODが0.2になるように蒸留水で細胞を再懸濁します。このODは10 ⁸コロニー形成単位（CFU）/ mLに相当する。準備が細菌で、葉を準備し、アッセイを行うために進んでください。

2。バクテリアと葉の染色とインキュベーション

1. 染色するために、葉はまず水に20μMのヨウ化プロピジウムまたはPI溶液を調製。溶液10 mL、一度に3つの小さな葉を染色するのに十分です。
2. 成長チャンバーから植物を取得し、鉗子で3若い、完全に展開した葉を切り離します。 5分間のPI溶液中で全体の葉を浸し。その後、葉を取り除き、蒸留水で簡単にそれらを洗い流してください。
3. 次の場所下面は、顕微鏡スライド上に下向きに持つ葉。葉がスライド上に平らになるようにミッド静脈を除く4つの部分に鋭いカミソリの刃を持つ葉を切り取ります。
4. 葉で細菌を培養するために、スライド上の葉の部分の下に細菌懸濁液300μLを加える。葉の下面は、接種に接触していることを確認してください。
5. 植物を育てるために使用されたのと同じ環境条件でサンプルをインキュベートする。顕微鏡下で葉を観察する時に、上を向く下面との新しいスライドに葉の部分を転送する。スライドをマウントするときに、カバースリップが使用されていないことに注意してください。同じ葉の試料はインキュベーションの間に複数回撮像することができ、時間の経過は、研究目的に応じて設定することができる。

3。顕微鏡、測定とデータ解析

1. ここでは共焦点顕微鏡（LSM 510メタ、カールツァイス社）をスキャンするレーザーは、葉を調べるために使用されます。 PI（励起453 nmの発光543および620nm）の蛍光を検出するために、葉の下面を観察。
2. 同じ葉のサンプルを使用すると、時間の経過とともに気孔の画像をキャプチャ。気孔開口部の幅を測定するために画像を保存します。
3. LSMの画像のブラウザを使用して、各時点における各治療のために少なくとも60気孔の気孔開口部の幅を測定します。
4. 気孔開口部の幅の平均と標準誤差を計算する。結果の統計的有意性は、2尾、ペアワイズスチューデントのt検定を用いて計算することができます。

4。細菌とのインキュベーションに気孔応答の代表的な画像

1. ここで明視野のビュー（図1）におけるレーザー走査型共焦点顕微鏡下でシロイヌナズナの葉の表面の典型的な顕微鏡画像は、（20倍対物レンズを用いて）です。
2. ヨウ化プロピジウム染色生細胞の細胞壁は、データの収集（図2）のための無傷の細胞の同定を可能に加えて、孔辺細胞の可視性を高める。気孔孔開口部の範囲が広く開いている気孔に完全に閉じた気孔から、これらの顕微鏡写真で見ることができます。
3. 完全に閉じた気孔は孔辺細胞の形状（図3）によって識別されます。開口幅は、0μmと考えられている。
4. オープン気孔（図4）で示した開口幅は、気孔孔の広い領域にわたって描かれた直線を用いて測定されます。
5. これらは、この気孔アッセイの代表的な実験結果です。Arabidopisの葉は、 シュードモナスシリンの3つの異なる株で、暗所でインキュベートした。唯一の細菌は、PST DC3000は、菌株ごとにランダムに選ばれた60気孔（図5）の開口幅で測定された暗閉じた気孔を、開くことができました。

図1。 シロイヌナズナの葉の表面の顕微鏡写真。20倍の対物レンズを用いてレーザー走査型共焦点顕微鏡（LSCM）下葉の表面のビューの1つのフィールドを変更します。気孔の開口は、ヨウ化プロピジウム染色（図2）によって支援蛍光ビューと比較して明らかなようにではないことに注意してください。


図2。ヨウ化プロピジウム染色シロイヌナズナの葉の表面の顕微鏡写真。20倍の対物レンズを用いてレーザー走査型共焦点顕微鏡（LSCM）下葉の表面のビューの1つのフィールド。気孔の孔の開口部の範囲に注意してください。黄色の矢印は、完全に気孔を閉じるために指摘されていると緑色の矢印が広く開いた気孔を指摘されています。


図3。の形状と孔辺細胞の間の開口部で識別される、完全に近い気孔。開口幅は、0μmと考えられている。


図4。ミクロンの開口幅を示す開いた気孔測定は、気孔の孔の広い領域にわたって引かれた直線に基づいてLSCMブラウザを使用して撮影した。


図5。 シュードモナスシリン PVの3株とインキュベートしたシロイヌナズナの葉の気孔開口トマト ：。。DC3118、DB29、およびDC3000植物は、実験時に暗闇に格納されていました。結果は平均値（N = 50から70まで）±標準誤差として示されています。統計学的有意性は、両側スチューデントt -テストで検出した。実験は、同様の結果を3回繰り返した。

Discussion

我々は異なる治療に気孔応答の簡単な評価を可能に無傷の葉組織に気孔開口部を測定するためにまっすぐ進むの手順を提示している。

私たちはモデルシステムのシロイヌナズナ / シュードモナスシリンを使用して結果を提示されているが、無傷の葉気孔のアッセイは、潜在的に任意の植物-細菌の組み合わせで行うことができます。プロトコルは、簡単に他の植物や細菌の病原体の成長の必要条件に合わせて変更することができます。全体的な原則と手順は同じです。さらに、このメソッドは機能的な孔辺細胞の出力だけでなく、微生物を生きるために勉強したい研究者に有益なだけでなく、葉の自然環境を維持する条件下で、他の刺激と化学物質への可能性があります。

全体の葉は、その厚さや不均一な地形のため、画像に困難になる可能性があります。この問題は、スライド上に平らように葉の中央静脈を除去し、共焦点顕微鏡を使用することによって軽減することができます。しかし、蛍光顕微鏡の他のタイプは、葉の表面の高解像度の画像を取得するために使用することができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4864
Tryptone	Fisher Scientific	BP1421-1
Yeast Extract	Difco Laboratories	0127-01-7
Sodium Chloride	VWR international	7647-14-5
Agar	Bio Express	J637-2500G
Plant growth chamber
Shaker incubator
Laser scanning confocal microscope