Summary
Hemos desarrollado un protocolo simple y reproducible para acceder a la respuesta estomática de bacterias vivas. Este método minimiza las lesiones y la manipulación de la hoja, en comparación con el uso de cáscaras de la epidermis se informó anteriormente.
Abstract
Los estomas son aberturas naturales de la epidermis de la planta responsables del intercambio de gases entre el interior de plantas y el medio ambiente. Están formados por un par de células de guarda, que son capaces de cerrar el poro estomático en respuesta a una serie de factores externos como la intensidad de la luz, la concentración de dióxido de carbono, y la humedad relativa (RH). El poro estomático es también la principal vía de entrada de patógenos en las hojas, un paso crucial para el desarrollo de la enfermedad. Estudios recientes han revelado que el cierre de los poros es eficaz para reducir el desarrollo de enfermedades bacterianas en plantas de Arabidopsis, una parte integral de la inmunidad innata de plantas. Anteriormente, hemos utilizado las cáscaras de la epidermis para evaluar la respuesta de los estomas de bacterias vivas (Melotto et al 2006.), Sin embargo el mantenimiento de las condiciones ambientales favorables para las exfoliaciones de plantas, tanto la epidermis y las células bacterianas ha sido un desafío. Epidermis de la hoja puede ser mantenido con vida y saludable con tampón MES (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6,15) para los experimentos electrofisiológicos de las células de guardia. Sin embargo, este búfer no es adecuado para obtener la suspensión bacteriana. Por otro lado, las células bacterianas pueden mantenerse vivas en el agua que no es adecuada para mantener las cáscaras epidérmica por un largo período de tiempo. Cuando una flota cáscara de la epidermis en el agua, las células de la piel que están expuestas a aire seco en 4 horas el tiempo límite para realizar el experimento. Un método ideal para evaluar el efecto de un estímulo particular en las células de guardia debe presentar un mínimo de interferencia con la fisiología estomática y el medio ambiente natural de la planta tanto como sea posible. Por lo tanto, ha desarrollado un nuevo método para evaluar la respuesta de los estomas de bacterias vivas en el que está muy herida y la manipulación de la hoja de minimizar el objetivo de proporcionar una prueba de estomas fácilmente reproducible y confiable. El protocolo se basa en la tinción de la hoja intacta con yoduro de propidio (PI), la incubación de la coloración de la hoja con la suspensión bacteriana, y la observación de las hojas bajo microscopio confocal de barrido láser. Finalmente, este método permite la observación de la muestra misma hoja vivir durante largos períodos de tiempo con las condiciones que imitan las condiciones naturales en que las plantas son atacadas por patógenos.
Protocol
1. Las plantas que crecen las bacterias y Preparación
- Para iniciar este procedimiento de sembrar las semillas de Arabidopsis en un v 01:01:01: v: v mezcla de medio de cultivo (Redi-plug y mezclar la tierra de plántulas, Sun Gro), vermiculita fina, y perlita.
- Cultivar las plantas en una cámara de crecimiento (22 ° C, 12 horas de luz de 100 mmol / mm 2 / s al día y 65 ± 5% de humedad) y el agua según sea necesario. Las plantas están listas para su uso en 4-6 semanas cuando tienen las hojas jóvenes totalmente expandidas antes de la floración.
- Dos días antes de comenzar el experimento de preparar a la cultura de la bacteria. Racha de Pseudomonas syringae en stock de glicerol en el medio LB modificado (10 g / L de triptona, 5 g / L de extracto de levadura, 5 g / L NaCl pH 7,0, y 1,5% de agar) e incubar durante 24 horas a 28 ° C. Uso de cultivo fresco para preparar el inóculo que comienzan siempre las placas de cultivo de las existencias de glicerol como las bacterias es menos virulenta después de subcultivos.
- Use las bacterias que crecían en la placa para iniciar un cultivo de 10 ml de líquido de P. syringae, en un matraz Erlenmeyer de 50 ml. Incubar el cultivo de una noche a 28 ° C con agitación vigorosa hasta que se alcanza la densidad óptica o la DO a 600 nm entre 0,8 y 1.
- Medir la DO a 600 y la cosecha de las células por centrifugación a 1360 xg durante 10 minutos. Resuspender las células en agua destilada para que el OD final es 0,2. Esta DO se corresponde con 10 8 unidades formadoras de colonias (UFC) / mL. Con la bacteria listo, proceder a la preparación de las hojas y realizar el ensayo.
2. Hoja de tinción e incubación con bacterias
- Con el fin de manchar las primeras hojas preparar 20 M de yoduro de propidio o la solución PI en el agua. 10 ml de solución es suficiente para teñir tres pequeñas hojas a la vez.
- Recuperar las plantas de la cámara de crecimiento y con una pinza separar tres jóvenes, totalmente ampliado hojas. Sumerja las hojas enteras en la solución de PI durante 5 minutos. A continuación, retire las hojas y aclare a fondo con agua destilada.
- Lugar el próximo una hoja con la cara inferior hacia abajo sobre un portaobjetos de microscopio. Cortar la hoja con una cuchilla afilada en cuatro partes con exclusión de la vena media, para que la hoja está plano en la diapositiva.
- Para la incubación de las bacterias con las hojas, añadir 300 l de la suspensión bacteriana en las piezas de la hoja en la diapositiva. Asegúrese de que la superficie inferior de la hoja está en contacto con el inóculo.
- Incubar las muestras en las mismas condiciones ambientales que fueron utilizados para cultivar las plantas. En el momento de observar las hojas bajo el microscopio, la transferencia de las piezas de la hoja de una nueva diapositiva con la superficie inferior hacia arriba. Tenga en cuenta que cubreobjetos no se utiliza en el montaje de las diapositivas. La muestra misma hoja se pueden visualizar varias veces durante la incubación y un curso de tiempo puede ser configurado de acuerdo con los objetivos de investigación.
3. Microscopía, Medición y Análisis de Datos
- Aquí un microscopio confocal de barrido láser (LSM 510 Meta, Carl Zeiss Inc.) se utiliza para examinar las hojas. Observar la superficie inferior de las hojas para detectar la fluorescencia de la PI (excitación 453 nm, emisión 543 y 620 nm).
- Usando las muestras de hoja misma capturar imágenes de los estomas en el tiempo. Guardar las imágenes para medir la anchura de la apertura de los estomas.
- Mida el ancho de la apertura de los estomas de al menos 60 estomas para cada tratamiento en cada momento mediante el navegador de LSM imagen.
- Calcular el error promedio y estándar para el ancho de la abertura estomática. La significación estadística de los resultados se puede calcular utilizando dos colas, Student para datos apareados sabio t-test.
4. Imágenes representativas de la respuesta de los estomas de la incubación con bacterias
- Esta es una imagen típica microscópica (usando un objetivo 20x) de una superficie de la hoja de Arabidopsis bajo microscopio confocal de barrido láser de la vista de campo claro (Figura 1).
- Propidio yoduro de manchas de la pared celular de las células viables aumentar la visibilidad de las células de guardia, además de permitir la identificación de las células en buen estado para la recolección de datos (Figura 2). Una serie de aberturas de los poros de estomas se puede ver en estas micrografías, de estomas completamente cerrado a los estomas abiertos.
- Estomas totalmente cerrados se identifican por la forma de las células de guarda (Figura 3). El ancho de la abertura se considera 0 micras.
- De estomas abiertos (Figura 4) la luz de malla que se muestra es medido mediante una línea recta trazada a través de la más amplia área del poro estomático.
- Estos son típicos los resultados experimentales de este ensayo los estomas. Arabidopis hojas se incubaron en la oscuridad con tres cepas diferentes de Pseudomonas syringae. Sólo la bacteria Pst DC3000 fue capaz de abrir los estomas cerrados oscuro, medida por el ancho de la abertura de seleccionados al azar 60 estomas por la cepa bacteriana (Figura 5).
Figura 1. Micrografía de la superficie de una hoja de Arabidopsis. Un campo de visión de la superficie de las hojas bajo microscopio confocal de barrido láser (LSCM) con el objetivo de 20x. Tenga en cuenta que la apertura de estomas no es tan evidente cuando se compara con el punto de vista fluorescentes con la ayuda de tinción con yoduro de propidio (Figura 2).
Figura 2. Micrografía de la superficie de una hoja de Arabidopsis de yoduro de propidio manchado. Un campo de visión de la superficie de las hojas bajo microscopio confocal de barrido láser (LSCM) con el objetivo de 20x. Tenga en cuenta una serie de apertura del poro estomático. Las flechas amarillas se señaló para cerrar completamente los estomas y flechas verdes apuntan a los estomas abiertos.
Figura 3. Estomas se cierran completamente identificados por la forma de la abertura entre las células de guarda. El ancho de la abertura se considera 0 micras.
Figura 4. Estomas se abren mostrando la luz de malla en micras. Las mediciones se realizaron utilizando el navegador LSCM sobre la base de una línea recta trazada a través de la amplia área del poro estomático.
Figura 5. Apertura de los estomas de las hojas de Arabidopsis se incubaron con tres cepas de Pseudomonas syringae pv tomate:.. DC3118, DB29, y DC3000 Las plantas se mantuvieron en la oscuridad durante el tiempo de experimentación. Los resultados se muestran como la media (n = 50-70) ± error estándar. La significación estadística fue detectado con dos colas de la t-test. El experimento se repitió tres veces con resultados similares.
Discussion
Hemos presentado un procedimiento sencillo para medir la abertura de los estomas en el tejido foliar intacto lo que permite una fácil evaluación de la respuesta de los estomas a diferentes tratamientos.
A pesar de que han presentado los resultados utilizando el sistema de modelo Arabidopsis / Pseudomonas syringae, el ensayo de la hoja intacta estomas pueden ser potencialmente a cabo con cualquier combinación planta-bacteria. El protocolo se puede modificar fácilmente para adaptarse a las necesidades de crecimiento de otras plantas y bacterias patógenas. El principio general y el procedimiento son los mismos. Además, este método puede ser beneficioso para los investigadores que deseen estudiar la producción funcional de las células de guardia no sólo a vivir los microbios, sino también a otros estímulos y agentes químicos bajo condiciones que mantienen entorno natural de la hoja.
Hoja entera puede ser difícil de imagen debido a su espesor y la topografía irregular. Este problema puede aliviarse mediante la eliminación de la vena media de la hoja para que quede plana en la diapositiva y el uso de la microscopía confocal. Sin embargo, otro tipo de microscopio de fluorescencia se puede utilizar para obtener imágenes de alta resolución de la superficie de la hoja.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada por una subvención del Instituto Nacional de Salud y la Universidad de Texas en Arlington crear fondos de MM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-1 | |
| Yeast Extract | Difco Laboratories | 0127-01-7 | |
| Sodium Chloride | VWR international | 7647-14-5 | |
| Agar | Bio Express | J637-2500G | |
| Plant growth chamber | |||
| Shaker incubator | |||
| Laser scanning confocal microscope |
References
- Brooks, D. M., Hernandez-Guzman, G., Kloek, A. P., Alarcon-Chaidez, F., Sreedharan, A., Rangaswamy, V., Penaloza-Vazquez, A., Bender, C. L., Kunkel, B. N. Identification and characterization of a well-defined series of coronatine biosynthetic mutants of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Mol Plant-Microbe Interact. 17, 162-174 (2004).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis Book. Somerville, C. R., Meyerowitz, E. M. , American Society of Plant Biologists. Rockville, MD. (2002).
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- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126, 969-980 (2006).
