Summary
We hebben een eenvoudige en reproduceerbare protocol om stomatale reactie op de levende bacteriën te openen. Deze methode minimaliseert verwonden en manipulatie van het blad ten opzichte van het gebruik van de epidermale schillen eerder gerapporteerd.
Abstract
Huidmondjes zijn natuurlijke openingen in de installatie epidermis die verantwoordelijk is voor de uitwisseling van gassen tussen plant interieur en omgeving. Ze worden gevormd door een paar van de wacht cellen, die in staat zijn om de stomatale porie dicht in reactie op een aantal externe factoren, zoals lichtintensiteit, koolstofdioxide concentratie, en de relatieve vochtigheid (RH). De stomatale porie is ook de belangrijkste route voor pathogeen toegang tot bladeren, een cruciale stap voor de ziekte van ontwikkeling. Recente studies hebben onthuld dat de sluiting van de porie is effectief in het minimaliseren van bacteriële ziekte in Arabidopsis planten, een integraal onderdeel van plant aangeboren immuniteit. Eerder hebben we gebruikt epidermale peelings om stomatale respons te beoordelen op bacteriën (Melotto et al., 2006.) Leven; ook om de gunstige milieu-omstandigheden voor zowel planten epidermale peelings en bacteriële cellen is uitdagend. Bladepidermis levend gehouden kan worden en gezond met MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6,15) voor de elektrofysiologische experimenten sluitcellen. Echter, deze buffer is niet geschikt voor het verkrijgen van bacteriële suspensie. Aan de andere kant kan bacteriële cellen worden in leven gehouden in water dat niet eigen is aan epidermale schillen te behouden voor een lange periode van tijd. Wanneer een epidermale schil drijft op het water, de cellen in de schil, die aan de lucht drogen blootgesteld binnen 4 uur het beperken van de timing om het experiment uit te voeren. Een ideale methode voor het beoordelen van het effect van een bepaalde stimulus op sluitcellen moet indienen minimale interferentie stomatale fysiologie en om de natuurlijke omgeving van de plant zoveel mogelijk. We daarom een nieuwe methode ontwikkeld om stomatale respons te beoordelen aan bacteriën in die bladeren verwonden en manipulatie sterk wordt geminimaliseerd gericht op een gemakkelijk reproduceerbaar en betrouwbaar stomatale assay te bieden wonen. Het protocol is gebaseerd op de kleuren van intacte blad met propidiumjodide (PI), incubatie van kleuren blad met bacteriële suspensie, en observatie van de bladeren onder laser scanning confocale microscoop. Tot slot is deze methode laat voor de observatie van dezelfde live-blad steekproef over langere tijd met behulp van omstandigheden die nauw nabootsen van de natuurlijke omstandigheden waaronder planten worden aangevallen door ziekteverwekkers.
Protocol
1. Groeiende planten en voorbereiden van bacteriën
- Om te beginnen deze procedure te zaaien Arabidopsis zaden op een 1:01:01 v: v: v mengsel van groeimedium (Redi-aarde stekker en zaailing mix, zon Gro), fijne vermiculiet, perliet en.
- Groeien de planten in een groeikamer (22 ° C, 12 uur van 100 mmol / mm 2 / sec per dag licht en 65 ± 5% vocht) en water als dat nodig is. De planten zijn klaar voor gebruik in 4-6 weken als ze jong volledig uitgevouwen blaadjes voorafgaand aan de bouten.
- Twee dagen vóór het begin van het experiment voor te bereiden de bacterie cultuur. Streak Pseudomonas syringae uit glycerol voorraad van gemodificeerde LB-medium (10 g / L trypton, 5 g / L gistextract, 5 g / L NaCl pH 7,0, en 1,5% agar) en incubeer gedurende 24 uur bij 28 ° C. Gebruik verse cultuur aan de inoculum voor te bereiden en altijd kweekplaten vanaf glycerol voorraden als bacteriën minder virulent na sub-kweken.
- Gebruik bacteriën die groeiden op de plaat om een 10 ml vloeibare cultuur van P. start syringae in een 50 mL erlenmeyer. 'S nachts Incubeer de cultuur bij 28 ° C met heftig schudden totdat het optische dichtheid of OD bij 600 nm tussen 0,8 en 1.
- Meet de OD bij 600 en oogsten van de cellen door centrifugatie bij 1360 xg gedurende 10 minuten. Resuspendeer de cellen in gedestilleerd water, zodat het uiteindelijke OD is 0,2. Deze OD komt overeen met 10 8 kolonievormende eenheden (CFU) / ml. Met de bacteriën klaar, ga dan naar de bladeren te bereiden en de test uit te voeren.
2. Leaf Kleuring en Incubatie met bacteriën
- Om vlekken op de bladeren eerst voor te bereiden 20 uM propidiumjodide of PI-oplossing in water. 10 ml oplossing is voldoende om drie kleine blaadjes vlek op een moment.
- Haal de planten uit de groei van kamer en met een pincet los 3 jonge, volledig uitgebreid bladeren. Dompel de hele bladeren in de PI-oplossing gedurende 5 minuten. Verwijder vervolgens de bladeren en spoel ze kort met gedestilleerd water.
- Volgende plaats een blad met de onderkant naar beneden op een microscoopglaasje. Snijd het blad met een scherp scheermesje in vier stukken met uitzondering van het midden van de ader, zodat het blad ligt plat op de dia.
- Tot broeden de bacteriën met de bladeren, voeg 300 ul van bacteriële suspensie onder het blad stukken op de dia. Zorg ervoor dat de onderkant van het blad is in contact met de inoculum.
- Incubeer de monsters onder dezelfde omgevingsomstandigheden die werden gebruikt om de planten te laten groeien. Op het moment om te bladeren in acht onder de microscoop, de overdracht van het blad stukken om een nieuwe dia met een lager oppervlak naar boven. Merk op dat dekglas niet wordt gebruikt bij de montage van de dia's. Hetzelfde blad monster kan worden afgebeeld meerdere keren tijdens de incubatietijd en een tijdsverloop kan worden ingesteld op basis van de onderzoeksdoelstellingen.
3. Microscopie, meting en data-analyse
- Hier een laser scanning confocale microscoop (LSM 510 Meta, Carl Zeiss Inc) wordt gebruikt om de bladeren te onderzoeken. Let op de onderkant van de bladeren naar de fluorescentie van PI (excitatie 453 nm, emissie 543 en 620 nm) te detecteren.
- Met dezelfde bladmonsters beelden vastleggen van huidmondjes in de tijd. Sla de foto's voor het meten van de breedte van de stomatale diafragma.
- Meet stomatale opening breedte van ten minste 60 huidmondjes voor elke behandeling op elk tijdstip met behulp van LSM image browser.
- Bereken de gemiddelde en standaardfout voor de stomatale opening breedte. Statistische significantie van de resultaten kan worden berekend met behulp van twee-staart, gekoppeld verstandig Student's t-test.
4. Vertegenwoordiger Beelden van stomatale Reactie op Incubatie met bacteriën
- Hier is een typisch microscopisch beeld (met behulp van een 20x objectief) van een Arabidopsis bladoppervlak onder laser scanning confocale microscoop in fel gezichtsveld (figuur 1).
- Propidiumjodide vlekken de celwand van levensvatbare cellen het vergroten van de zichtbaarheid van sluitcellen Naast het feit dat voor de identificatie van de onbeschadigde cellen voor het verzamelen van gegevens (figuur 2). Een reeks van stomatale porie-openingen zijn te zien in deze microfoto van volledig gesloten huidmondjes te wijd open huidmondjes.
- Volledig gesloten huidmondjes zijn te herkennen aan de vorm van de wacht cellen (figuur 3). Het diafragma breedte wordt beschouwd als 0 um.
- Voor open huidmondjes (figuur 4) de getoonde diafragma breedte wordt gemeten met behulp van een rechte lijn over het breedste gedeelte van de stomatale porie.
- Dit zijn typische experimentele resultaten van deze test stomatale. Arabidopsis bladeren werden geïncubeerd in het donker met drie verschillende stammen van Pseudomonas syringae. Alleen de bacterie Pst DC3000 was in staat om donkere gesloten huidmondjes, zoals gemeten door de opening breedte van willekeurig geselecteerde 60 huidmondjes per bacteriestam (figuur 5) te openen.
Figuur 1. Microfoto van het oppervlak van een blad Arabidopsis. Een beeldveld van het bladoppervlak onder laser scanning confocale microscoop (LSCM) met de 20x doelstelling. Merk op dat stomatale opening is niet zo evident in vergelijking met de fluorescerende te bekijken geholpen door propidiumjodide kleuring (figuur 2).
Figuur 2. Microfoto van het oppervlak van een propidiumjodide gekleurd Arabidopsis blad. Een beeldveld van het bladoppervlak onder laser scanning confocale microscoop (LSCM) met de 20x doelstelling. Let op een reeks van stomatale porie opening. Gele pijlen zijn gewezen op volledig te sluiten huidmondjes en groene pijlen zijn gewezen op wijd open huidmondjes.
Figuur 3. Volledig te sluiten huidmondjes geïdentificeerd door de vorm van en de opening tussen de sluitcellen. Het diafragma breedte wordt beschouwd als 0 um.
Figuur 4. Open huidmondjes met de opening breedte in um. Metingen werden genomen met behulp van de LSCM browser gebaseerd op een rechte lijn over het breedste gedeelte van de stomatale porie.
Figuur 5. Stomatale opening van Arabidopsis bladeren geïncubeerd met drie stammen van Pseudomonas syringae pv tomaat:.. DC3118, DB29 en de DC3000 planten werden bewaard in het donker tijdens het experimenteren tijd. De resultaten zijn weergegeven als de gemiddelde (n = 50-70) ± standaard fout. Statistische significantie werd gedetecteerd met tweezijdig Student's t-test. Het experiment werd drie keer herhaald met vergelijkbare resultaten.
Discussion
We hebben presenteerde een rechttoe rechtaan procedure om stomatale diafragma te meten in intacte bladweefsel waardoor een eenvoudige beoordeling van stomatale reactie op de verschillende behandelingen.
Hoewel we hebben gepresenteerde resultaten met behulp van het modelsysteem Arabidopsis / Pseudomonas syringae, kan de intacte blad stomatale test mogelijk worden uitgevoerd met een plant-bacterie combinatie. Het protocol kan eenvoudig worden aangepast om de gewenste groei van andere planten en bacteriële pathogenen te passen. Het algemene principe en de procedure blijven hetzelfde. Daarnaast kan deze methode nuttig voor onderzoekers die willen functionele output van sluitcellen niet alleen tegen microben leven studeren, maar ook voor andere stimuli en chemische stoffen onder omstandigheden die het blad de natuurlijke omgeving te behouden.
Hele blad kan moeilijk zijn om de afbeelding door zijn dikte en ongelijke topografie. Dit probleem kan worden verholpen door het verwijderen van het midden van de ader van het blad, zodat het ligt plat op de glijbaan en het gebruik van confocale microscopie. Maar ook andere vormen van fluorescentie microscoop gebruikt worden om hoge resolutie afbeeldingen van het bladoppervlak te verkrijgen.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie van het National Institute of Health en de Universiteit van Texas in Arlington fondsen opgericht op MM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-1 | |
| Yeast Extract | Difco Laboratories | 0127-01-7 | |
| Sodium Chloride | VWR international | 7647-14-5 | |
| Agar | Bio Express | J637-2500G | |
| Plant growth chamber | |||
| Shaker incubator | |||
| Laser scanning confocal microscope |
References
- Brooks, D. M., Hernandez-Guzman, G., Kloek, A. P., Alarcon-Chaidez, F., Sreedharan, A., Rangaswamy, V., Penaloza-Vazquez, A., Bender, C. L., Kunkel, B. N. Identification and characterization of a well-defined series of coronatine biosynthetic mutants of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Mol Plant-Microbe Interact. 17, 162-174 (2004).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis Book. Somerville, C. R., Meyerowitz, E. M. , American Society of Plant Biologists. Rockville, MD. (2002).
- Ma, S. W., Morris, V. L., Cuppels, D. A. Characterization of a DNA region required for production of the phytotoxin coronatine by Pseudomonas syringae pv. tomato. Mol Plant-Microbe Interact. 4, 69-74 (1991).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126, 969-980 (2006).
