Summary
Biz canlı bakteri stoma yanıt erişmek için basit ve tekrarlanabilir bir protokol geliştirmiştir. Bu yöntem daha önce bildirdiği epidermal peeling kullanımı ile karşılaştırıldığında yaprak yaralama ve manipülasyona en aza indirir.
Abstract
Stoma bitki iç ve çevre arasındaki gaz değişimi için sorumlu olan bitki epidermisin doğal açıklıklar. Bu ışık yoğunluğu, karbon dioksit konsantrasyonu, ve bağıl nem (RH) de dahil olmak üzere bir dizi dış etkenlere yanıt olarak stoma gözenek kapatmak için bekçi hücreleri, bir çifti tarafından oluşturulur. Stoma gözenek da ana güzergah yaprakların içine patojen giriş, hastalık gelişimi için önemli bir adım. Son çalışmalar, gözenek kapatılması Arabidopsis bitkilerin bakteriyel hastalık gelişimi en aza indirilmesinde etkili olduğunu açıkladı; bitki doğal bağışıklık ayrılmaz bir parçasıdır . Önceden, canlı bakteriler (Melotto et al 2006), stoma tepki değerlendirmek için epidermal peeling; ancak bitki epidermal peeling ve bakteri hücreleri için olumlu çevre koşulları muhafaza zorlu olmuştur . Yaprak epidermisin bekçi hücreleri elektrofizyolojik deneyler için MES tamponu (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) ile canlı ve sağlıklı olarak muhafaza edilebilir. Ancak, bu tampon bakteri süspansiyonu elde etmek için uygun değildir. Öte yandan, bakteri hücrelerinin epidermal peeling kez uzun süre korumak için uygun değildir su canlı tutulabilir. 4 saat içinde hava kuru maruz kalan kabuğu, su üzerinde epidermal kabuğu yüzer, hücreleri deney yapmak için zamanlama sınırlayıcı. Bekçi hücreleri belirli bir uyaranın etkisini değerlendirmek için ideal bir yöntem stoma fizyolojisi ve tesisi mümkün olduğunca doğal çevreye minimal girişim sunmalıdır. Bu nedenle, yaprak yaralama ve manipülasyon kolayca tekrarlanabilir ve güvenilir bir stoma tahlil sağlamayı amaçlayan önemli ölçüde minimize edildiği bakterilerin yaşaması için stoma yanıtı değerlendirmek için yeni bir yöntem geliştirdi. Protokol propidium iyodür (PI), bakteri süspansiyonu ile yaprak boyama inkübasyon, lazer tarama konfokal mikroskop altında yaprakları gözlem ve sağlam yaprak boyama dayanmaktadır. Son olarak, bu yöntem bitkiler patojenler tarafından saldırıya altında doğal koşulları yakından taklit koşulları kullanarak uzun süre boyunca aynı canlı yaprak örnek gözlem için izin verir.
Protocol
1. Büyüyen Bitkiler ve hazırlanması Bakteriler
- V: v büyüyen orta karışımı (Redi-toprak fiş ve fide karışımı Sun, Gro), ince vermikülit, perlit, bu yordamı başlamak için 01:01:01 v Arabidopsis tohumları eker .
- Bir büyüme odası (22 ° C, 12 saat 100 mmol / mm 2 / sn günlük ışık ve 65 ±% 5 nem) ve gerektiği kadar su bitkileri yetiştirin. Bitkiler 4-6 hafta içinde tamamen genişletilmiş genç yaprakları önce civatalama zaman kullanıma hazır.
- Deney başlamadan önce iki gün bakteri kültürü hazırlar. LB, orta (10 g / L Tripton, 5 g / L maya özü, 5 g / L NaCl, pH 7.0 ve% 1.5 agar) değiştirilmiş ve 28 az 24 saat süreyle inkübe ° C gliserol stok Streak Pseudomonas syringae Inokulum hazırlamak ve bakteriler alt-kültür sonra daha az öldürücü olur gliserol stokları her zaman olduğu gibi kültür plakaları başlatmak için taze kültür kullanın.
- Plaka üzerinde büyüdü bakteri P. 10 ml sıvı kültürü başlatmak için kullanın syringae 50 ml Erlenmeyer balonuna. Gecede kültür 28 ° C'de 0.8 ile 1 arasında 600 nm dalga boyunda optik yoğunluk veya OD ulaşıncaya kadar kuvvetli sallayarak.
- 600 OD ölçün ve 10 dakika 1360 xg'de santrifüj hücrelerin hasat. Distile su ile son OD 0.2, böylece hücreleri tekrar Bu OD 10 8 koloni oluşturan birim (CFU) / mL karşılık gelir. Hazır bakteri, yaprakları hazırlamak ve analiz gerçekleştirmek için devam edin.
2. Bakteriler Yaprak Boyama ve Kuluçka
- Yaprakları ilk 20 mcM propidium iyodür veya suya PI çözüm hazırlamak leke için. 10 ml çözelti, bir seferde 3 küçük yaprak leke için yeterli.
- 3 genç, tam genişletilmiş yaprak büyüme odasından ve forseps detach ile bitkiler al. 5 dakika PI çözüm tüm yaprakları bırakın. Sonra yaprakları kaldırmak ve onları saf su ile kısa bir süre yıkayın.
- Sonraki yerde bir mikroskop lamı üzerine aşağı bakacak şekilde alt yüzeye sahip bir yaprak. Slayt yaprak düz bırakır, böylece orta damar içine keskin bir jilet hariç dört adet yaprak kesin.
- Yaprakları ile bakteri inkübasyon için, slayt yaprak parçaları altında bakteriyel süspansiyon 300 mcL ekleyin. Yaprağın alt yüzeyi inokulum ile temas halinde olduğundan emin olun.
- Bitkilerin büyümesi için kullanılan aynı çevre koşullarında örnekleri inkübe edin. Mikroskop altında yaprakları gözlemlemek zamanda yaprak parçaları, alt yüzeyi yukarı bakacak şekilde yeni bir slayt aktarın. Slaytlar montaj kapağı kayma olmadığını unutmayın. Aynı yaprak örneği inkübasyon sırasında birden çok kez görüntülenmiş olabilir ve bir süre ders, araştırma hedeflerine göre ayarlanmış olabilir.
3. Mikroskopi, Ölçme ve Veri Analizi
- Burada konfokal mikroskop bir lazer tarama (EKK 510 Meta, Carl Zeiss Inc.) Yaprakları incelemek için kullanılır. PI (eksitasyon 453 nm, emisyon 543 ve 620 nm) floresan algılamak için yaprakların alt yüzeyi dikkat edin.
- Aynı yaprak örnekleri kullanarak zamanla stoma görüntüleri yakalayabilir. Stoma diyafram genişliğini ölçmek için kaydedin.
- LSM görüntü tarayıcısı kullanarak her zaman bir noktada her bir tedavi için en az 60 stoma stoma diyafram genişliği ölçün.
- Stoma diyafram genişliği için ortalama ve standart hata hesaplayın. Sonuçlarının istatistiksel anlamlılık 2 kuyruklu bilge Öğrenci, eşleştirilmiş t-testi kullanılarak hesaplandı.
4. Bakteriler Kuluçka Stoma Tepki Temsilcisi Görüntüler
- İşte, parlak bir alan görünümü (Şekil 1) konfokal mikroskop lazer tarama altında bir Arabidopsis yaprak yüzeyi tipik bir mikroskobik görüntü (20x amacı kullanarak) .
- Propidium iyodür lekeleri veri toplama (Şekil 2) hasarsız hücrelerinin tanımlanması için izin vermeye ek olarak bekçi hücreleri görünürlüğünü artırarak canlı hücreleri hücre duvarı. Stoma gözenek açıklıkları bir dizi, tamamen kapalı stoma geniş açık stoma, bu mikrograflar görülebilir.
- Tamamı kapalı stoma bekçi hücrelerin şekil (Şekil 3) tarafından tespit edilir. Diyafram genişliği 0 mm olarak kabul edilir.
- Açık stoma (Şekil 4) için gösterilen diyafram genişliği stoma gözenek geniş alan boyunca çizilen düz bir çizgi ile ölçülür.
- Bunlar bu stoma testin tipik deneysel sonuçlar Arabidopis yaprakları Pseudomonas syringae üç farklı suşları ile karanlıkta inkübe edildi. Sadece bakteri Pst DC3000 koyu-kapalı stoma, bakteri suşunun başına rastgele seçilen 60 stoma (Şekil 5) diyafram genişliği ile ölçülen açmak mümkün.
Şekil 1. Arabidopsis bir yaprak yüzeyi Mikrografik konfokal mikroskobu (LSCM) 20x objektif kullanarak lazer tarama altında yaprak yüzeyi görüş alanı. Propidium iyodür boyama (Şekil 2) yardımıyla floresan görünümüne göre stoma diyafram gibi belirgin olmadığını unutmayın.
Şekil 2. Propidium iyodür lekeli Arabidopsis yaprak yüzeyi Mikrografik konfokal mikroskobu (LSCM) 20x objektif kullanarak lazer tarama altında yaprak yüzeyi görüş alanı. Stoma gözenek açılması bir dizi dikkat edin. Sarı oklar stoma tamamen kapatmak için işaret ve yeşil okları geniş açık stoma işaret edilir.
Şekil 3. Tamamen şekil ve bekçi hücreleri arasındaki açıklık tespit yakın stoma diyafram genişliği 0 mm olarak kabul edilir.
Şekil 4. Mikron diyafram genişliği gösteren Açık stoma. Ölçümler stoma gözenek geniş alan boyunca çizilen düz bir çizgi dayalı LSCM tarayıcı kullanarak alındı.
Şekil 5. Arabidopsis yaprakları üç Pseudomonas syringae pv domates suşları ile inkübe Stoma diyafram: DC3118, DB29 ve DC3000 Tesisleri deneme süresi boyunca karanlıkta tutulmuştur. Sonuçlar ortalama olarak verilmiştir (n = 50-70) ± standart hata. Iki kuyruklu Student t-testi ile istatistiksel anlamlılık tespit edildi. Deney benzer sonuçlar veren üç kez tekrarlandı.
Discussion
Biz, farklı tedavilere stoma yanıt kolay bir değerlendirme için izin sağlam yaprak dokusunda stoma diyafram ölçmek için bir yalındır prosedürü sundu.
Model sistem Arabidopsis / Pseudomonas syringae kullanarak sonuçlarını sundu olmasına rağmen, bozulmamış yaprak stoma tahlil potansiyel olarak herhangi bir bitki-bakteri kombinasyonu ile yapılabilir . Protokolü, diğer bitkiler ve bakteriyel patojenler büyüme gereksinimlerini kolayca sığacak şekilde modifiye edilebilir. Genel ilke ve prosedür aynı kalır. Buna ek olarak, bu yöntem mikroplar yaşamak için bekçi hücreleri sadece fonksiyonel çıktı okumak isteyen araştırmacılar için yararlı olabilir, ama aynı zamanda, yaprak doğal ortamını korumak koşullar altında diğer uyaranların ve kimyasal ajanlar olabilir.
Tüm yaprak kalınlığı ve engebeli topografyası nedeniyle görüntü için zor olabilir. Bu sorun, yaprak orta damar düz durduğundan slayt kaldırma ve konfokal mikroskopi kullanılarak kontrol altına alınabilir. Ancak, diğer tip floresan mikroskop yaprak yüzeyinin yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde etmek için kullanılabilir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüsü ve The University of Texas at Arlington MM fonları tarafından hibe destek verdi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-1 | |
| Yeast Extract | Difco Laboratories | 0127-01-7 | |
| Sodium Chloride | VWR international | 7647-14-5 | |
| Agar | Bio Express | J637-2500G | |
| Plant growth chamber | |||
| Shaker incubator | |||
| Laser scanning confocal microscope |
References
- Brooks, D. M., Hernandez-Guzman, G., Kloek, A. P., Alarcon-Chaidez, F., Sreedharan, A., Rangaswamy, V., Penaloza-Vazquez, A., Bender, C. L., Kunkel, B. N. Identification and characterization of a well-defined series of coronatine biosynthetic mutants of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Mol Plant-Microbe Interact. 17, 162-174 (2004).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis Book. Somerville, C. R., Meyerowitz, E. M. , American Society of Plant Biologists. Rockville, MD. (2002).
- Ma, S. W., Morris, V. L., Cuppels, D. A. Characterization of a DNA region required for production of the phytotoxin coronatine by Pseudomonas syringae pv. tomato. Mol Plant-Microbe Interact. 4, 69-74 (1991).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126, 969-980 (2006).
