Summary
우리는 사는 박테리아에 stomatal 응답을 액세스하는 간단하고 재현성 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법은 표피 껍질의 사용에 비해 잎사귀의 입힐 수있는 총알과 조작은 이전에 보고된 최소화합니다.
Abstract
Stomata은 공장 내부와 환경 사이의 가스 교환에 책임이있는 식물 표피 자연 채용하고 있습니다. 그들은 빛의 강도, 이산화탄소 농도, 그리고 상대 습도 (RH)를 포함한 외부 요인에 대응 stomatal 기공을 닫으 수있는 경비 세포, 한 쌍의에 의해 형성된다. stomatal 기공은 나뭇잎으로 병원체 진입, 질병 개발을위한 중요한 단계의 주요 경로입니다. 최근 연구는 기공의 폐쇄가 Arabidopsis 식물의 세균성 질병 개발을 최소화에 효과적이라는 사실을 발표했습니다; 공장 타고난 면역의 중요한 부분을. 이전, 우리는 박테리아를 (. Melotto 외 2006) 생활 stomatal 반응을 평가하기 위해 표피 껍질을 사용한 적이 있지만 식물 표피 껍질을 세균 세포 모두에 유리한 환경 조건을 유지 도전했습니다. 잎 표피는 경비 세포 electrophysiological 실험 MES 버퍼 (10 MM KCl, 25 MM MES - 코, 산도 6.15)와 살아 있고 건강하게 만들어 줬어 수 있습니다. 그러나,이 버퍼가 박테리아 중지를위한 적합하지 않습니다. 한편, 세균 세포는 시간의 오랜 기간 동안 표피 껍질을 유지하기 위해 적절한되지 않습니다 물이 살아 보관하실 수 있습니다. 물 위에 표피 필 수레, 4 시간 이내에 건조 공기에 노출되어있는 껍질에있는 세포가 실험을 실시하는 시간을 제한하는 경우. 경비 세포에 특정 자극의 효과를 평가하기위한 이상적인 방법은 stomatal 생리학과 가능한 많은 식물의 자연 환경에 최소한의 간섭을 제시해야합니다. 우리는 그러므로, 잎 입힐 수있는 총알과 조작이 크게 쉽게 재현할하고 안정적인 stomatal 분석을 제공하는 목표로 최소화되는 박테리아를 살 stomatal 응답을 평가하는 새로운 방법을 개발했습니다. 프로토콜은 propidium 요오드화물의 (PI), 세균의 정지와 리프 얼룩의 부화하고, 공촛점 현미경 스캐닝 레이저에 따라 나뭇잎의 관찰과 함께 그대로 잎의 얼룩을 기반으로합니다. 마지막으로,이 방법은 밀접하게 식물이 병원균에 의해 공격하는 아래의 자연 조건을 모방 조건을 사용하여 오랜 기간에 걸쳐 동일한 라이브 잎 샘플의 관찰을 허용합니다.
Protocol
1. 성장하는 식물과 박테리아 준비
- V : 성장 매체의 V 혼합물 (Redi - 지구 플러그 앤 세들링 믹스, 일요일 Gro), 고급 vermiculite와 펄라이트이 절차를 시작하려면 1시 1분 1초 V에 Arabidopsis 씨를 뿌리다.
- 성장 챔버 (22 ° C, 100 μmol / mm 2 / 초 매일 가벼운 65 12 시간의 ± 5 % 습도)와 필요에 따라 물속에 식물을 성장. 식물들은 이전 탈당 젊은 완전히 확장 나뭇잎이있을 때 4~6주에서 사용할 준비가 된 것입니다.
- 실험을 시작하기 전에 이틀 세균 문화를 준비합니다. 수정된 LB 매체 (10 G / L tryptone, 5 G / L 효모 추출물, 5 G / L NaCl 산도 7.0 및 1.5 %의 한천) 및 28에서 24 시간 동안 품어 ° C.에 글리세롤 주식의 리크 모나스 syringae inoculum를 준비하고 박테리아가 하위 culturing 후 적은 악성되면서 항상 글리세롤 주식의 문화 접시를 시작하는 새로운 문화를 사용합니다.
- P.의 10 ML 액체 문화를 시작 접시에 자란 박테리아를 사용하여 50 ML Erlenmeyer 플라스크에 syringae. 28 밤새 문화를 품어 ° C가 0.8 일 사이에 600 nm의에서 광학 밀도 또는 OD에 도달할 때까지 활발한 떨고와 함께.
- 600에서 OD를 측정하고 10 분 동안 1,360 XG에서 원심 분리하여 세포를 수확. 최종 OD가 0.2이되도록 증류수에있는 세포를 Resuspend. 이 OD는 10 8 콜로니 형성 단위 (CFU) / ML에 해당합니다. 준비 박테리아와 나뭇잎을 준비하고 분석을 수행하기 위해 진행합니다.
2. 박테리아와 리프 스테 이닝과 부화
- 단풍은 처음 20 μm의의 propidium 요오드화물의 또는 물에 PI 솔루션을 준비 얼룩하기 위해서. 솔루션의 10 ML는 한 번에 세 작은 잎을 얼룩이 충분하다.
- 세 젊은 완벽하게 확장 단풍 성장 챔버로부터 포셉 분리와 함께 식물을 검색할 수 있습니다. 5 분 PI 솔루션에있는 모든 나뭇잎을 담가. 그런 나뭇잎을 제거하고 증류수로 잠시 그들을 씻어.
- 현미경 슬라이드에 아래로 직면하고있는 낮은 표면 다음 장소는 나뭇잎. 나뭇잎이 슬라이드 평면 낳는 있도록 중간 정맥을 제외한 네 조각으로 날카로운 면도날로 나뭇잎을 잘라.
- 나뭇잎과 박테리아를 부화, 슬라이드에있는 잎 조각 아래의 세균 현탁액 300 μL를 추가합니다. 잎사귀의 낮은 표면 inoculum 접촉되어 있는지 확인합니다.
- 식물을 성장하는 데 사용된 동일한 환경 조건에서 샘플을 품어. 현미경으로 나뭇잎을 관찰하기 위해 당시까지 직면 낮은 표면을 가진 새 슬라이드에 잎 조각을 전송할 수 있습니다. 슬라이드를 장착하면 커버 용지가 사용되지 않습니다. 같은 잎 샘플 부화하는 동안 여러 번 몇 군데있을 수 있으며 시간 과정은 연구 목적에 따라 설정할 수 있습니다.
3. 현미경, 측정 및 데이터 분석
- 여기 공촛점 현미경 스캐닝 레이저 (LSM 510 메타, 칼 자이스 혈구 주)는 나뭇잎을 검사하는 데 사용됩니다. PI (453 nm의 여기, 방사 543 및 620 nm의)의 형광을 감지하기 위해 나뭇잎의 낮은 표면을 관찰.
- 같은 잎 샘플을 사용하면 시간이 지남에 따라 stomata의 이미지를 캡처합니다. stomatal 조리개의 넓이를 측정하기위한 이미지를 저장합니다.
- LSM 이미지 브라우저를 사용하여 각 시점에서 각 치료를 위해 최소 60 stomata의 stomatal 조리개 너비를 측정합니다.
- stomatal 개구 폭에 대한 평균과 표준 오차를 계산. 결과의 통계적 의의 2 - 꼬리, 이점 현명한 학생의 T - 테스트를 사용하여 계산하실 수 있습니다.
4. 박테리아 배양에 Stomatal 답변 대표 이미지
- 여기 밝은 필드 뷰 (그림 1)에 공촛점 현미경 스캐닝 레이저 아래 Arabidopsis 잎 표면의 전형적인 미세한 이미지 (20x 목표를 사용)입니다.
- Propidium 요오드화물 얼룩의 데이터 수집 (그림 2)에 대한 손상이 세포의 식별을 허용 이외에 경비 세포의 가시성을 증가 가능한 세포의 세포 벽. stomatal 구멍 구멍의 범위는 완전히 폐쇄 stomata에서 활짝 열려 stomata하려면 다음 micrographs에서 볼 수 있습니다.
- 완전히 폐쇄 stomata은 경비 세포의 모양 (그림 3)에 의해 식별됩니다. 개구 폭 0 μm의 것으로 간주됩니다.
- 오픈 stomata (그림 4)와 같이 조리개 너비가 stomatal 기공의 넓은 지역에 걸쳐 그려진 직선을 사용하여 측정됩니다.
- 이들은이 stomatal 분석의 전형적인 실험 결과입니다. Arabidopis 단풍은 모나스 syringae의 세 가지 다른 변종과 함께 어둠 속에서 incubated되었습니다. 만이 세균은 PST DC3000은 박테리아 스트레인마다 무작위로 선택된 60 stomata (그림 5)의 개구 폭에 의해 측정 어두운 폐쇄 stomata를 열 수있었습니다.
그림 1. Arabidopsis 잎 표면의 현미경. 20x 목표를 사용 공촛점 현미경 (LSCM)를 스캐닝 레이저에서 잎 표면의보기 중 하나는 분야. propidium 요오드화물 얼룩 (그림 2)에 의해 주었 형광등 볼 수 비교할 때 stomatal 조리개과 같이 분명되지 않습니다.
그림 2. propidium 요오드화물 - 스테인드 Arabidopsis 리프의 표면의 현미경. 20x 목표를 사용 공촛점 현미경 (LSCM)를 스캐닝 레이저에서 잎 표면의보기 중 하나는 분야. stomatal 기공 개방의 범위를합니다. 노란색 화살표는 완전히 stomata를 닫고 지적하고 녹색 화살표가 활짝 열려 stomata 지적하고 있습니다.
그림 3. 완전의 모양과 경비 세포 사이의 개방으로 식별 가까이 stomata가. 개구 폭은 0 μm의 것으로 간주됩니다.
그림 4. μm의에서 조리개 너비를 보여주는 오픈 stomata가. 측정은 stomatal 기공의 넓은 지역에 걸쳐 그린 직선에 따라 LSCM 브라우저를 사용하여 촬영되었다.
그림 5. .. 세 모나스 syringae PV 토마토의 변종과 함께 incubated Arabidopsis 나뭇잎의 Stomatal 조리개 : DC3118, DB29, 그리고 DC3000 공장은 실험 시간 동안 어둠 속에 보관했다. 결과는 의미로 표시됩니다 (N = 50-70) ± 표준 오차. 통계 중요성은 두 꼬리 학생의 T - 테스트를 발견했습니다. 실험과 유사한 결과를 세 번 반복되었다.
Discussion
우리는 다른 치료에 반응 stomatal 쉽게 평가 있도록 그대로 잎 조직에서 stomatal 조리개를 측정하는 직선 전달 절차를 제시합니다.
우리가 모델 시스템 Arabidopsis / 모나스 syringae를 사용하여 결과를 발표했지만, 손상 잎 stomatal 분석은 잠재적으로 어떤 식물 세균의 조합을 수행할 수 있습니다. 프로토콜은 쉽게 다른 식물과 세균성 병원균의 성장 요구에 맞게 수정할 수 있습니다. 전체 원칙과 절차는 동일하게 유지. 또한,이 방법은 미생물을 살아 경호 세포뿐만 아니라 출력의 기능을 연구하고자하는 연구자에게 도움이 될뿐 아니라 나뭇잎의 자연 환경을 유지 조건에서 다른 자극과 화학 약품에 있습니다.
전체 잎의 두께와 고르지 지형으로 인해 이미지에 어려울 수 있습니다. 이 문제는 그것이 평면 낳는 있도록 슬라이드에 나뭇잎의 중간 정맥을 제거하고 공촛점 현미경을 사용하여 완화 할 수 있습니다. 그러나, 형광 현미경의 다른 종류는 잎 표면의 고해상도 이미지를 얻기 위해 사용할 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
본 연구는 보건 국립 연구소에서 그랜트와 알링턴 텍사스 대학 MM에 기금을 설치하여 지원했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-1 | |
| Yeast Extract | Difco Laboratories | 0127-01-7 | |
| Sodium Chloride | VWR international | 7647-14-5 | |
| Agar | Bio Express | J637-2500G | |
| Plant growth chamber | |||
| Shaker incubator | |||
| Laser scanning confocal microscope |
References
- Brooks, D. M., Hernandez-Guzman, G., Kloek, A. P., Alarcon-Chaidez, F., Sreedharan, A., Rangaswamy, V., Penaloza-Vazquez, A., Bender, C. L., Kunkel, B. N. Identification and characterization of a well-defined series of coronatine biosynthetic mutants of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Mol Plant-Microbe Interact. 17, 162-174 (2004).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis Book. Somerville, C. R., Meyerowitz, E. M. , American Society of Plant Biologists. Rockville, MD. (2002).
- Ma, S. W., Morris, V. L., Cuppels, D. A. Characterization of a DNA region required for production of the phytotoxin coronatine by Pseudomonas syringae pv. tomato. Mol Plant-Microbe Interact. 4, 69-74 (1991).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126, 969-980 (2006).
