Summary
Эта статья описывает различные методы выращивания
Abstract
Бактериальные биопленки, были связаны с целым рядом различных человеческих заболеваний, но биопленки развития, как правило, учились на неживых поверхностей. В этой статье мы описываем протоколы для формирования синегнойной палочки биопленок на человеческие клетки эпителия дыхательных путей (CFBE клетки), выращенных в культуре. В первый метод (называется статическое сотрудничеству культуры биопленки модели), П. палочки инкубируют с CFBE клетки, выращенные в качестве сливной монослоев на стандартные пластины для культуры ткани. Хотя бактерии очень токсичен для клеток эпителия, добавление аргинина задержки разрушение монослоя достаточно долго для биопленки сформировать на CFBE клеток. Второй метод (называется потоком сотовый сотрудничеству культуры биопленки Model), включает в себя адаптацию ячейки биопленки поток аппарат, который часто используется в биопленки исследования, для размещения стекло покровное поддержки сливающийся монослой CFBE клеток. Это монослоя засевают П. палочки и перистальтического насоса течет свежую среду по ячейкам. В обеих системах, бактериальные биопленки форме в течение 6-8 часов после прививки. Визуализация биопленки повышается за счет использования P. палочки штамма конститутивно выразил зеленый флуоресцентный белок (GFP). Статические и потоком сотовый сотрудничества культуре анализы биопленки модельных систем для раннего П. палочки заражения Муковисцидоз (МВ), легких, и эти методы позволяют различным аспектам П. палочки образование биопленки и вирулентность для изучения, в том числе биопленки цитотоксичность, измерение биопленки CFU, и окрашивания и визуализации биопленки.
Protocol
1. Статические сотрудничеству культуры биопленки модели
- Статические сотрудничеству культуры биопленки модель 1 использует CFBE41o-клеток (CFBE клетки), которые увековечены клетки первоначально разработана с отдельными с гомозиготной CF для ΔF508-CFTR мутаций 2,3,4. CFBE клетки должны быть посеяны в концентрации 10 6 клеток / лунку в 6-и ткани пластины культуры или 2 х 10 5 в 24-луночных культуре ткани пластины в минимальной необходимой среде (MEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 50 ед / мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина. Мы используем 1,5 мл среды на лунку в 6-луночных планшетах и 0,5 мл среды на лунку в 24-луночных планшетах.
- Клетки должны быть выращены при 37 ° С и 5% CO 2 -95% воздуха в течение 7-10 дней, чтобы сформировать сливающийся монослой перед прививкой с бактериями. Среда должна менять каждые 2-3 дней. Эти условия, как было показано привести к образованию сливающийся монослой и плотные соединения.
- Рост P. палочки в 5 мл LB в течение 18 часов при температуре 37 ° С на шейкере инкубаторе при 200 оборотах в минуту. В этих условиях П. палочки культур, как правило, достигают плотности 5х10 9 КОЕ / мл.
- Для бактериальный посев, удалите среды от CFBE клетки и добавьте равное количество MEM без фенола красного, с добавлением 2 мМ L-глутамина (микроскопия среды). Сливной монослоев CFBE засевают П. палочки при множественности заражения примерно 30:1 по отношению к числу CFBE клетки первоначально заполнена. Это соответствует 2 х 10 7 КОЕ / мл в 1,5 мл MEM / а для 6-луночных и 1,2 X 10 7 КОЕ / мл в 0,5 мл MEM / хорошо для 24-луночных планшетах.
- Инкубируйте пластин в течение 1 часа при температуре 37 ° С и 5% CO 2 -95% воздуха.
- После 1 часа инкубации супернатант должны быть удалены и заменены на свежую среду микроскопии дополнена 0,4% аргинина.
- Инкубировать при 37 ° С и 5% CO 2 -95% воздуха для различных моментов времени (примерно до 8 часов) и проанализировать целостность монослоя CFBE использованием микроскопии фазового контраста. Если клетки дыхательных путей не являются вырожденным, П. палочки быстро (в течение нескольких минут) получить доступ к базолатеральной поверхности клеток и уничтожать сотовой целостности. Прививка с П. палочки штаммов, конститутивно выразить GFP результатов в люминесцентных микроколоний биопленки, которые могут быть визуализированы epifluorescence или конфокальной микроскопии.
- Бактериальных КОЕ в биопленки могут быть определены стиральной совместно культуры в 2-3 раза с фосфатным буферным раствором (PBS), чтобы устранить планктонных бактерий. После мытья, относиться с 0,1% Тритон Х-100 в PBS или MEM в течение 10-15 мин для лизиса клеток эпителия и дисперсных биопленки.
- Vortex в течение 3 минут и подготовить серийных разведений лизата. Пластина этих разведений на агаре LB и инкубировать в течение ночи при температуре 37 ° C. Граф колонии на следующий день, чтобы определить КОЕ.
2. Проточная ячейка сотрудничеству культуры биопленки модели
- Проточная ячейка сотрудничеству культуры биопленки модели (поток анализ) предполагает модификацию стандартного аппарата проточной ячейки биопленки для размещения CFBE клетки 5.
- Место несколько 40-мм диаметром покровные стекла в чистую 100-мл стакан. Плотно закрыть с 2-х слоев алюминиевой фольги и автоклава на сухой цикл, в течение 20 мин.
- Работа в капот культуре клеток, захватить один из стерильной покровное стакан с использованием этанола мыть пинцетом и поместить в стерильный 60-мм блюдо пластиковой диаметре.
- Добавьте 3 мл подогретого средний рост клеток, нажимая на покровное с кончика пипетки, чтобы удалить пузырь ловушку под и заставить покровное на дно пластиковой тарелки.
- Семенной 2x10 6 клеток на блюдо и встряхните блюдо нежно взад и вперед. Избегайте закрученного для предотвращения центрифугирования клетки от сторон блюдо.
- Место блюдо в 5% CO 2 -95% воздуха инкубаторе при температуре 37 ° С и питаются клетками через день с 3 мл свежей среды, рост от 8 до 10 дней. Клетки образуют сливающийся монослой на покровное стекло.
- Рост P. палочки в 5 мл LB в течение 18 часов при температуре 37 ° С на шейкере инкубаторе при 200 оборотах в минуту. В этих условиях П. палочки культур, как правило, достигают плотности 5х10 9 КОЕ / мл. Мы используем P. PAO1 палочки штамм, несущий плазмиду pSMC21 для конститутивной экспрессии GFP из 6.
- Добавить 1 мл бактериальной культуры в стерильную пробирку микроцентрифужных. Центрифуга при 6000 оборотов в минуту в течение 3 минут и смойте бактериальных гранул в два раза, в 1 мл микроскопии среды.
- Развести 0,5 мл отмывали и ресуспендировали бактерий в 4,5 мл среды микроскопии для достижения концентрации ~ 5x10 8 КОЕ / мл.
- Наблюдение живых клетокв режиме реального времени требует изображения камеры соединен с перистальтического насоса (для обеспечения поступление питательных веществ в течение длительного времени, длины) и регулятор температуры. Мы используем Bioptechs FCS2 (Фохт Live-Cell) камера подключена к малым расходом микро-перфузионного насоса с 1 / 16-й C-Flex трубы сократить соответствующие длины и автоклавного на стерильность, а температура регулируется с помощью контроллера камеры FCS2. Мы продолжаем источника входного сигнала среды в 37 ° С водяной бане расположен рядом с микроскопом.
- Соберите проточную камеру. FCS2 камеры включает самоблокирующийся базы (который сидит на сцене адаптер во время съемки), а верхняя половина связана с перфузии труб и контроллера камеры. Камера собрана вверх дном, прежде чем перевернул и поставил на сцену адаптера. Держите верхнюю часть камеры с ног на голову так, что перфузии труб являются видимыми, и выровнять сквозными отверстиями в 0,75-мм резиновая прокладка на перфузию труб. Стек microaqueduct слайд снабжен камерой сверху резиновую прокладку, убедившись, рифленой стороной вверх, и место другого резиновую прокладку на верхней части слайда. Толщина и внутреннюю геометрию этой второй прокладка будет определять объем камеры. Как правило, мы работаем с 0,75-мм резиновая прокладка с 30-мм выстрел внутренней геометрии.
- Добавить 1 мл подогретого (37 ° C) микроскопии среду в центре слайда.
- Получить 60-мм блюдо из клеточной культуры инкубатор, удалить провел средних и мыть клетки сразу с 3 мл подогретого микроскопии среды. Этот шаг гарантирует устранение фенола красного и антибиотиков присутствующих в среде рост клеток. Фенол красный флуоресцентный мягко и могут вмешиваться в изображение, в то время антибиотиков может уничтожить P. палочки бактерий прежде чем они смогут установить биопленки.
- Использование этанола мыть щипцов, извлечение из покровного блюдо и опустите его вниз головой на шарик микроскопии среды, помещенной на камеру. Покровное сейчас покоится на втором резиновую прокладку и монослоя клетки дыхательных путей были обращены вниз.
- Холдинг собраны компоненты в одной руке, места базе камеры на вершину стека, и включите камеру более стремительно, так что все с головы на ноги. Блокировка базы на место, повернув кольцо.
- Подключите входной трубки с малым расходом микро-перфузионного насоса и начать поток со скоростью 20 мл / ч, это скорость потока в пределах возможностей скорости плавания П. палочки. Второй кусок трубы ссылки насоса в колбу микроскопии среды, помещенной в 37 ° С водяной бане расположен рядом с микроскопом.
- Прикрепить стерильной предварительно сократить 1 / 16 C-Flex трубы на входе и выходе трубы перфузии камеру, подключить регулятор температуры, затем поместить собранный камеры на столике микроскопа из перевернутой флуоресцентного микроскопа.
- Использование 1-мл одноразовый шприц, вводят заранее подготовленные бактериальной суспензии в камеру, с помощью двух-ходовой клапан помещен в линии между насосом и камерой. В наших конкретных условиях, она занимает объем 0,6 мл бактериальной суспензии для достижения камеры. Отрегулируйте этот объем в соответствии с вашими определенной длины трубы. Мы также считаем полезным место в линии одноразовые 0,22 мкм фильтр между насосом и двухходовой клапан, чтобы предотвратить бактерии от плавания вверх по течению и загрязняющих вход колбы.
- Чтобы позволить бактериям прикрепляться к клеткам дыхательных путей, остановка насоса для 2ч. Поток может быть вновь инициировала и поддерживается на 20 мл / ч для остальных эксперимента.
- Монитор целостности клетки дыхательных путей дифференциальной интерференционного контраста (DIC) микроскопии в течение всего эксперимента, чтобы проверить на наличие признаков повреждения монослоя. Одновременно следят за развитием GFP-меченых П. палочки биопленки на апикальной поверхности клетки дыхательных путей за счет приобретения изображений с перевернутой конфокальной или широким полем флуоресцентного микроскопа.
3. Представитель Результаты
Мы используем штамм P. палочки содержащие плазмиды pSMC21 которая позволяет учредительных выражения GFP 6. По этой причине, GFP-меченых биопленки, растущие на CFBE монослоя могут быть визуализированы epifluorescence микроскопии. Кроме того, визуализация биопленки может быть достигнуто путем окрашивания немеченого П. палочки с 1% calcofluor белый раствор в течение 1 часа при температуре 37 ° C 1.
Для визуализации образование биопленки на CFBE клеток в течение анализа, мы используем на заказ этапе адаптер, но некоторые компании могут теперь для этой цели специально оборудован адаптерами стадии. Мы работаем с Olympus IX70 инвертированный микроскоп оснащен ORCA-AG глубокого охлаждения ПЗС-камерой и x60 нефтью погружения цели (числовая апертура 1,40). Фильтр Wпятка оснащена 480/40 нм полосового фильтра возбуждения и 535/30 нм полосового фильтра выбросов. Цифровые изображения были получены с OpenLab 4.0.3 программного пакета (импровизация) и объемы deconvolved итерационными восстановление использованием Volocity 3.5.1 программного обеспечения (импровизация). Количественный анализ 3D структуры биопленки была достигнута с анализом изображений КОМСТАТ программный пакет 7,8.
Для любого со-культура рассматривалась модель, нужно обратить особое внимание на цитотоксичность развивающихся между компонентами модели. В обоих статические и анализы проточной ячейке мы обнаружили, что монослой CFBE выдержать присутствие P. палочки в течение 8 часов после прививки без каких-либо признаков изменения. Эпителиальные целостность монослоя можно оценить с помощью фазово-контрастной микроскопии с использованием инвертированного микроскопа 1 (рис. 1А) или дифференциальный интерференционный контраст (DIC) микроскопии в течение всего эксперимента 5. Со временем, П. палочки будут производить токсины и факторов вирулентности, которые накапливаются и могут повредить эпителиальных монослоя клетка полностью или в разделах (рис. 1B-1C). Цитотоксичность может быть количественно оценивается с помощью различных комплектов для измерения выпуска лактатдегидрогеназы (ЛДГ) из эпителиальных клеток. ЛДГ является стабильной цитозольного фермента выпущен в внеклеточной среде на лизис клетки или гибель клеток.
Когда целостность монослоя дыхательных путей не нарушена (как правило, в течение ~ 8 часов после прививки), П. палочки биопленок может успешно формировать и развивать в апикальной поверхности клетки дыхательных путей и в совместной культуре описанных моделей (рис. 2А-2В). После 3D-реконструкции (рис. 2C) и количественного накопления биомассы могут быть точно определены. Мы также использовали эти со-культуры биопленки в несколько фенотипических анализов. Например, как упоминалось выше, КОЕ биопленки могут быть легко определены лизису эпителиальных клеток, серийно разбавления лизат, а покрытие на чашках с агаром. Мы нашли эту технику выгодно при определении устойчивости различных штаммов лечения антибиотиками. Кроме того, биопленки токсичность по отношению к эпителиальных клеток может быть измерена с помощью коммерчески доступных комплектов ЛДГ обнаружения. Таким образом, роль факторов вирулентности токсичности биопленки могут быть оценены. Эти модели системы также поддерживают ряд приложений экспрессии генов, в том числе промоутер термоядерных исследований, RT-PCR и анализа микрочипов 1,5,9.
Рисунок 1. Монослой CFBE клеток и представитель образы скомпрометирован и повреждения дыхательных путей ячейка монослоя из-за P. палочки биопленки роста. () Представитель образ сливающийся монослой CFBE клеток, выращенных в виде пластин культуре тканей, оценивается фазово-контрастной микроскопии. Шкала бар, 120 мкм. (B) Пример скомпрометированы CFBE монослоя. Хотя монослоя не показывает очевидных видимых признаков повреждения все же, P. палочки бактерий видны распространения между плотные соединения эпителиальных клеток и получения доступа к базолатеральной мембран. Формирование биопленок, как правило, не достигается в этих условиях из-за ухудшения монослоя. Шкала бар, 20 мкм. (C) Пример заросшей П. палочки биопленки наблюдали 24 часов после прививки. После успешной поддержки образования биопленки, монослой CFBE было повреждено и не подлежит ремонту и сейчас практически отсутствует. Остаточная биопленки, растущие как плоский слой бактерий, показано крепления к стеклу покровное. Шкала бар, 20 мкм.
Рисунок 2. P. палочки биопленки выращенных на апикальной поверхности клетки CFBE сливающийся с помощью статического сотрудничеству культуры Модель биопленки и потоком сотовый сотрудничеству культуры биопленки модели. () Представитель образ GFP-экспрессирующих П. палочки биопленки выращенных на сливающийся монослой CFBE клеток с использованием статического сотрудничеству культуры биопленки модели, оценивается epifluorescence микроскопии. Изображение наложения канал фазового контраста и флуоресценции канала. Шкала бар, 35 мкм. (B), представитель образ GFP-меченых П. палочки биопленки выращенных в течение 6 ч на сливающийся монослой CFBE ячеек с помощью проточной ячейки сотрудничеству культуры биопленки модели. Для облегчения визуализации монослоя дыхательных путей, ядер окрашивали 10 мкг / мл Hoechst 33342 (Molecular Probes) в течение 30 минут перед посевом с П. палочки. Объединенные и pseudocolored изображения рассматривались дифференциального интерференционного контраста (DIC), и соответствующие флуоресцентные изображения показываются. Биопленки, представляя, как зеленые сгустки прилагается к апикальной поверхности клетки CFBE, разбросаны по всей клетки дыхательных путей. Шкала бар, 20 мкм. (C) Трехмерные реконструкцииТион из Z-серии изображений стека показывает типичный грибовидных структур 6 ч от роду П. палочки биопленки формирования на CFBE монослоя клеток. Шкала бар, 10 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Биопленки сообщества бактерий, которые образуются в ответ на стимулы окружающей среды. Эти экологические сигналы приводят к глобальным нормативные изменения внутри каждой бактерии, в результате связывания с поверхностью, агрегация, производство экзополисахариды и других фенотипов таких, как повышение устойчивости к антибиотикам 10. За последние пару десятилетий, много доказательств поддерживает гипотезу, что биопленки играют большую роль в патогенезе хронических инфекций. Например, она хорошо принимается, что П. палочки способен установить хронические инфекции в легких Муковисцидоз (МВ) пациентов путем формирования биопленок 11. CF это генетическое нарушение, где мутации в гене CFTR привести к неправильной секреции хлорид 12. Пациентов с МВ обычно испытывают изменил физиологию дыхательных путей, ведущих к толстыми пробками слизи в дыхательных путях и, одновременно, к микробной инфекции 13. К концу подросткового возраста, доминирующей инфекционным агентом CF дыхательных путей P. палочки, что приводит к хронической инфекции биопленки, которые устойчивы к антибиотикам 14.
Протоколов, описанных в этой статье, были разработаны в качестве модельных систем для изучения образование биопленки на живые клетки легких. Бактериальные биопленки замешан во многих болезненных состояний и, тем не менее, в основном были изучены на неживые твердых поверхностей, таких как стекло и пластик 15,16. Изучая образование биопленки и роста на абиотические поверхности только один не хватает важных взаимодействий между патогеном и хост, который может произойти только с моделью системы, такие, как описано в протоколах выше. В частности, статическое сотрудничеству культуры Модель биопленки и потоком сотовый сотрудничеству культуры биопленки Модель воспользоваться способностью П. палочки для взаимодействия и связываться с эпителиальной поверхности легких. Используя эти модели, мы показали, что реакция со-культуры биопленки на лечение антибиотиками является уникальным и, что эти модели, скорее всего, точно отражают состояние инфекционной 1,5. В этой связи мы уже сообщали, что сопротивление увеличивается на тобрамицин> в 25 раз, когда П. палочки биопленки выращивают на клетки дыхательных путей по сравнению с биопленки выращенных на абиотические поверхностей, таких как стекло 5. Вполне вероятно, что эти методы отражают события, которые происходят во время ранней колонизации легких 17. Таким образом, со-культуры модельных систем представляют инновационные инструменты для понимания ранней инфекции эпителия дыхательных путей CF П. палочки 1.
Системы культуры ткани имеют обычно были заняты, чтобы понять взаимодействия между хозяином и патогеном. Мы приняли эти взаимодействия шаг вперед за счет формирования биопленок на живого человека эпителиальных клеток. В будущем, модифицированные версии модели, описанные здесь, могут быть потенциально использованы для исследования биопленки различных бактерий, в других инфекционных состояний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Г. О Тул для руководства и предложения при разработке этих моделей. Эта работа была поддержана фондом кистозный фиброз (ANDERS06F0 к GGA, STANTO07RO и STANTO08GA к BAS), Национального института здоровья (T32A107363 к GGA и R01-HL074175 к BAS), и Национального центра по исследованию ресурсов Центры медико-биологических исследований Совершенство (P20-Кобре RR018787 к BAS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FCS2 (Focht Live-Cell) chamber | Bioptechs | 060319131616 | |
| FCS2 chamber controller | Bioptechs | 060319-2-0303 | |
| 40 mm glass coverslips | Bioptechs | PH 40-1313-0319 | |
| MEM | Mediatech, Inc. | #10-010-CV | |
| MEM without phenol red | Mediatech, Inc. | Mediatech, Manassass, VA |
References
- Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infect Immun. 76, 1423-1433 (2008).
- Bruscia, E. Isolation of CF cell lines corrected at DeltaF508-CFTR locus by SFHR-mediated targeting. Gene Ther. 9, 683-685 (2002).
- Cozens, A. L. CFTR expression and chloride secretion in polarized immortal human bronchial epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 10, 38-47 (1994).
- Hentchel-Franks, K. Activation of airway cl- secretion in human subjects by adenosine. Am J Respir Cell Mol Biol. 31, 140-146 (2004).
- Moreau-Marquis, S. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 25-37 (2008).
- Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O'Toole, G. A. A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187, (2005).
- Heydorn, A. Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms. Microbiology. 146 (Pt 10), 2409-2415 (2000).
- Heydorn, A. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
- Anderson, G. G., Yahr, T. L., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A. The Pseudomonas aeruginosa magnesium transporter MgtE inhibits transcription of the type III secretion system. Infect Immun. 78, (2010).
- Costerton, J. W. Overview of microbial biofilms. J Ind Microbiol. 15, 137-140 (1995).
- Hoiby, N., Frederiksen, B., Pressler, T. Eradication of early Pseudomonas aeruginosa infection. J Cyst Fibros. 4, Suppl 2. 49-54 (2005).
- Ko, Y. H., Pedersen, P. L. Cystic fibrosis: a brief look at some highlights of a decade of research focused on elucidating and correcting the molecular basis of the disease. J Bioenerg Biomembr. 33, 513-521 (2001).
- Gibson, R. L., Burns, J. L., Ramsey, B. W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 168, 918-951 (2003).
- Furukawa, S., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, Unit 1B 1-Unit 1B 1 (2005).
- O'Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol Microbiol. 28, 449-461 (1998).
- Gomez, M. I., Prince, A. Opportunistic infections in lung disease: Pseudomonas infections in cystic fibrosis. Curr Opin Pharmacol. 7, 244-251 (2007).
