Summary
본 논문은 성장의 다른 방법을 설명합니다
Abstract
세균성 biofilms는 다양한 인간 질병의 숫자와 관련되어 있지만, biofilm 개발은 일반적으로 비 - 생활 표면에 연구되었습니다. 본 논문에서는, 우리는 문화의 성장 인간기도 상피 세포 (CFBE 세포)에 형성 녹농균의 biofilms에 대한 프로토콜을 설명합니다. 첫 번째 방법에서는 (정적 공동 문화 Biofilm 모델을 칭했다), P. 녹농균이라는 박테리아가 표준 조직 문화 접시에 합류 monolayers로 성장 CFBE 전지 incubated입니다. 박테리아가 상피 세포에 매우 독성이지만, 아르기닌 지연 monolayer의 파괴 또한 충분히 biofilms에 대한 CFBE 세포에서 만들어집니다. 두 번째 방법은 (흐름 전지 공동 문화 Biofilm 모델을 칭했다), 종종 CFBE 세포의 합류 monolayer를 지원하는 유리 coverslip을 수용하기 위해 biofilm 연구에 사용되는 biofilm 흐름 전지 장치의 적응을 포함한다. 이 monolayer는 P.과 주사입니다 녹농균이라는 박테리아와 연동 펌프 다음 세포에 걸쳐 신선한 매체를 흐르고 있습니다. 두 시스템에서 세균성 biofilms는 접종 후 6-8시간 이내에 양식. biofilm의 시각화는 P.의 사용에 의해 향상됩니다 녹농균이라는 박테리아의 변종은 녹색 형광 단백질 constitutively (GFP)을 표현. 정적 및 흐름 세포 공동 문화 Biofilm의 assays 일찍 P.을위한 모델 시스템 아르 낭성 섬유증 (CF) 폐, 이러한 기술의 녹농균이라는 박테리아 감염은 P.의 다양한 측면을 허용 녹농균이라는 박테리아의 biofilm 형성과 독성이 biofilm의 세포 독성, biofilm CFU 측정 및 biofilm을 얼룩과 시각화를 포함하여 공부 할 수 있습니다.
Protocol
1. 정적 공동 문화 Biofilm 모델
- 정적 공동 문화 Biofilm 모델 1 원래 ΔF508 - CFTR 돌연변이 2,3,4에 대한 CF의 homozygous와 개인의 발전 세포를 영원히 아르 CFBE41o - 세포 (CFBE 세포)를 사용합니다. CFBE 세포가 / 잘 6 잘 조직 배양 플레이트 또는 10% 태아 소 혈청과 보충 최소한의 필수적인 매체 24 잘 조직 배양 플레이트 (멤) 2 X 10 5 10 6 세포의 농도에 씨앗을해야합니다 2mM L - 글루타민, 50 U / ML 페니실린, 50 μg / ML의 스트렙토 마이신. 우리는 6 자 접시 24 - 잘 접시에 잘 당 0.5 ML 매체에서 잘 당 1.5 ML 매체를 사용합니다.
- 세포가 37 성장해야 ° C, 5 %는 박테리아와 접종 전에 합류 monolayer를 형성 70~10일 2 -95 %의 공기를 CO. 매체 2-3일마다 변경해야합니다. 이러한 조건은 합류 monolayer과 꽉 분기점의 형성으로 이어질에 표시하고 있습니다.
- 37 18 시간 동안 5 ML의 LB의 P.의 녹농균이라는 박테리아의 성장 ° C 200 rpm으로 보육 흔드는에. 이러한 조건에서, P. 녹농균이라는 박테리아의 문화는 일반적으로 5x10 9 CFU / ML의 밀도에 도달합니다.
- 세균 접종 들어, CFBE 세포에서 매체를 제거하고 두 MM L - 글루타민 (현미경 매체)에 보충 페놀 레드없이 멤의 동일한 볼륨을 추가합니다. 콘플루앙 CFBE의 monolayers는 P.과 주사 아르 원래 씨앗 CFBE 세포의 수가 약 30:1 상대의 감염의 다중성에 녹농균이라는 박테리아. 이것은 X 1.5 ML 멤에서 10 7 CFU / ML / 음 6 잘 접시와 1.2 X 10 0.5 ML 멤 7 CFU / ML / 잘 24 - 잘 접시를위한 2 equates.
- 37에서 1 시간 동안 접시를 품어 ° C, 5 % 2 -95 %의 공기를 CO.
- 1 시간 부화 후, 뜨는은 0.4 %의 아르기닌과 보충 신선한 현미경 매체로 제거하고 교체해야합니다.
- 37 품어 ° C, 5 %는 여러 시간 지점 (최대 약 8 시간) 2 -95 %의 공기를 CO와 위상 콘트라스트 현미경을 사용하여 CFBE의 monolayer의 무결성을 분석할 수 있습니다. 기도 세포가 아닌 합류있다면, P. 녹농균이라는 박테리아는 빠르게 (분 이내) 세포의 basolateral 표면에 액세스하고 세포 무결성을 파괴합니다. P.과 접종 constitutively epifluorescence 또는 공촛점 현미경에 의해 시각 수있는 형광 biofilm의 microcolonies에서 GFP의 결과를 표현하는 녹농균이라는 박테리아의 변종.
- biofilm의 세균 CFU는 planktonic 박테리아를 제거하는 인산염 버퍼 호수 (PBS)와 공동 문화에게 2-3 번 세척하여 결정하실 수 있습니다. 세척 후, 트리톤은 10~15분을위한 PBS 또는 멤에서 X - 100 상피 세포를 lyse 및 biofilm을 해산하기 위해 0.1 %과 치료.
- 3 분 소용돌이와 lysate 일련 dilutions을 준비합니다. 플레이트이 LB 한천에 dilutions 37에서 밤새 품어 ° C. CFU를 확인하려면 다음 날 식민지를 계산합니다.
2. 플로우 셀 공동 문화 Biofilm 모델
- 흐름 전지 공동 문화 Biofilm 모델 (흐름 분석)는 CFBE 세포에게 5 수용할 수있는 표준 biofilm 흐름 셀 장치의 변경을 포함한다.
- 깨끗한 100 ML 비커에 여러 개의 40 mm 직경의 유리 coverslips를 놓습니다. 20 분 건조 사이클에 알루미늄 호일과 압력솥 2 레이어로 단단히 커버.
- 세포 배양 후드에서 근무, 살균 60 mm 직경의 플라스틱 그릇에 에탄올 씻어 포셉과 장소를 사용하여 비이커에서 하나 살균 coverslip 잡아.
- 아래에 갇혀있는 모든 거품을 제거하고 플라스틱 접시의 바닥에 coverslip을 강제로 피펫의 끝에있는 coverslip에 누르면, 미리 예열 세포 성장 매체 3 ML을 추가합니다.
- 시드 2x10 6 접시 당 세포 및 앞뒤로 부드럽게 요리를 흔들. 접시의 측면에 대한 세포를 centrifuging 방지하기 위해 소용돌이 치는 마십시오.
- 37 ° C에서 5 % CO 2 -95 % 공기 인큐베이터에있는 접시를 놓고 8-10일 3 ML 신선한 성장 매체와 매일 세포를 피드. 세포는 유리 coverslip에 합류 monolayer를 형성합니다.
- P. 그로 37 18 시간 동안 5 ML의 LB에 녹농균이라는 박테리아 ° 200 rpm으로 보육 쉐이크에 C. 이러한 조건에서, P. 녹농균이라는 박테리아의 문화는 일반적으로 5x10 9 CFU / ML의 밀도에 도달합니다. 우리는 P.을 사용 녹농균이라는 박테리아 스트레인 PAO1는 GFP 6 제정 표현 pSMC21 플라스미드를 들고.
- 멸균 microcentrifuge 관에 세균성 문화 1 ML을 추가합니다. 3 분위한 6,000 rpm으로 원심 분리기와 현미경 매체 1 ML에 두 박테리아 펠렛을 씻으십시오.
- ~ 5x10 8 CFU / ML의 농도를 달성하기 4.5 ML 현미경 매체로 세탁 및 resuspended 박테리아의 0.5 ML를 희석.
- 라이브 세포의 관찰실시간으로 연동 펌프 (시간 연장 길이에 대한 영양소의 흐름을 보장하기 위해)와 온도 컨트롤러에 결합 이미징 챔버가 필요합니다. 우리는 Bioptechs FCS2 (폭트 라이브 셀) 적절한 길이로 16분의 1과 낮은 흐름 마이크로 관류 펌프로 일 C - 플렉스 튜빙 인하를 연결하고 불임에 대한 autoclaved 챔버 및 FCS2 챔버 컨트롤러를 통해 온도 규제를 사용합니다. 우리는 현미경 바로 옆에 위치한 37 ° C의 물을 욕조에있는 입력 소스 매체 보관하십시오.
- 흐름 챔버를 조립. FCS2 챔버는 자동 잠금 자료 (이미징 동안 무대 어댑터에 앉아있는)과 재관류 튜브와 챔버 컨트롤러에 연결된 상반신을 포함합니다. 챔버가 넘는 이성을 상실되기 전에 거꾸로 조립 무대 어댑터에 배치됩니다. 거꾸로 그래서 재관류 튜브가 표시되는 것을 챔버의 위쪽 절반을 보유하고 재관류 튜브에 0.75 - mm 두께 고무 가스켓의 통관 구멍을 맞춥니다. 홈 붙이 사이드가 있는지 확인하고, 고무 가스켓 위에 챔버와 함께 제공된 microaqueduct 슬라이드를 스택, 그리고 슬라이드 상단에있는 다른 고무 가스켓을 넣으십시오. 두께와이 두 번째 가스켓의 내부 형상은 챔버의 볼륨을 결정합니다. 우리는 일반적으로 30 mm 원형 내부 기하학과 0.75 - mm 두께의 고무 가스켓과 함께 작동합니다.
- 1 ML 추가 사전 예열 (37 ° C) 슬라이드의 중앙에 현미경 매체.
- 세포 문화 인큐베이터에서 60 mm 요리를 검색, 지출 매체를 제거하고 미리 예열 현미경 매체 3 ML과 함께 한 번 세포를 씻으십시오. 이 단계는 세포 성장 매체에있는 페놀 빨간색과 항생제의 제거를 보장합니다. 항생제는 P.을 근절 할 수있는 동안 페놀 레드는 약간 형광이고 이미지를 방해할 수 녹농균이라는 박테리아 세균들이 biofilms을 확립하기 전에.
- 에탄올 세탁 집게를 사용하여 음식의 coverslip을 검색하고 챔버에 배치 현미경 매체의 구슬에 거꾸로 그것을 낮추십시오. coverslip 이제 두 번째 고무 가스켓에 휴식하고기도 세포의 monolayer 아래로 직면하고 있습니다.
- 한손에 조립 부품을 개최하면, 스택의 상단에있는 챔버의 기본을 배치하고, 그래서 모든 오른쪽 위로있다 신속히 통해 챔버를 켜십시오. 반지를 돌려하여 장소에 기지를 잠금.
- 마이크로 관류 펌프 낮은 흐름에 입구 튜브를 연결 20 ML / H의 속도로 흐름을 시작,이 유량은 P.의 수영 속도 능력 안에 녹농균이라는 박테리아. 튜브 링크의 두 번째 부분 37에 배치 현미경 매체의 플라스크에 펌프 현미경을 바로 옆에 위치한 ° C의 물 목욕.
- , 챔버의 입구와 출구의 재관류 튜브에 살균 사전 컷 16분의 1 일 C - 플렉스 튜빙을 부착 온도 컨트롤러를 연결 후, 거꾸로 형광 현미경의 현미경 단계에 조립 챔버를 놓습니다.
- 1 - ML 일회용 주사기를 사용하여 펌프와 챔버 사이의 라인에 배치 양방향 밸브를 사용하여 챔버로 이전 준비 세균 현탁액을 주입. 우리가 특히 설정에서, 그것은 챔버에 도달하는 세균 현탁액의 0.6 ML 볼륨을 소요됩니다. 특정 튜브 길이에 따라이 볼륨을 조정합니다. 우리는 또한 펌프와 상류 수영 입력 술병을 오염으로부터 세균을 방지하기 위해 두 방향 밸브 사이에 필터 인라인 일회용 0.22 μm의 배치하는 것이 유용할.
- 박테리아가기도 세포에 첨부할 수 있도록하려면, 2 시간을 위해 펌프를 중지합니다. 흐름은 다음 실험의 나머지 부분에 대해 다시 가동 20 ML / H 유지하실 수 있습니다.
- monolayer 손상의 흔적을 확인하는 실험을 통해 차등 간섭 대비 (DIC) 현미경에 의해기도 세포의 무결성을 모니터링합니다. 동시에, GFP - 레이블 P.의 발전을 따르십시오 거꾸로 공촛점 또는 넓은 필드 형광 현미경으로 이미지를 획득하여기도 세포의 꼭대기의 표면에 녹농균이라는 박테리아의 biofilms.
3. 대표 결과
우리는 P.의 변형을 사용하여 GFP 6 제정 표현을 허용하는 pSMC21 플라스미드를 포함하는 녹농균이라는 박테리아. 이러한 이유로 들어, CFBE monolayer에서 성장 GFP - 라벨 biofilms는 epifluorescence 현미경에 의해 시각하실 수 있습니다. 또는 biofilm의 시각화는 레이블이 지정되지 않은 P.을 얼룩에 의해 얻을 수 37 ° C 1에서 1 시간 동안 1 %의 calcofluor 화이트 솔루션 녹농균이라는 박테리아.
흐름 분석에 CFBE 세포에 이미징 biofilm 형성을 위해, 우리는 사용자 정의 만든 무대 어댑터를 사용하지만, 몇몇 기업들은 이제 특별히 장착 무대 어댑터를 제공할 수 있습니다. 우리는 오카 - AG 깊은 냉각 CCD 카메라 및 x60 오일 침지 목표 (수치 구경 1.40)을 갖춘 올림푸스 IX70 거꾸로 현미경으로 작동합니다. 필터 w뒤꿈치는 40분의 480 NM 밴드 패스 필터 및 여기 30분의 535 NM 밴드 패스 방출 필터를 갖추고 있습니다. 디지털 이미지는 OpenLab 4.0.3 소프트웨어 패키지 (순발력)에 인수되었고 볼륨 Volocity 3.5.1 소프트웨어 (순발력)를 사용하여 복원을 반복하여 deconvolved되었습니다. 3D biofilm 구조의 정량 분석은 COMSTAT 이미지 분석 소프트웨어 패키지 7,8와 함께 달성했습니다.
고려하는 공동의 문화 모델, 하나는 모델의 구성 요소 간의 개발 세포 독성에 특히주의하셔야합니다. 정적 및 유동 세포 assays 모두에서, 우리는 CFBE의 monolayer 피의 존재를 견딜 수 있다고 발견 최대 접종 후 8 시간 변경의 흔적없이위한 녹농균이라는 박테리아. 상피 monolayer 무결성은 거꾸로 현미경 1 (그림 1A)를 사용하여 위상 대조 현미경이나 실험에 걸쳐 5 차동 간섭 대비 (DIC) 현미경에 의해 평가하실 수 있습니다. 시간이지나면서, P. 녹농균이라는 박테리아는 독소와 축적 및 상피 세포 monolayer 완전히 또는 부분에서 (그림 1B - 1C)를 손상시킬 수 독성 요소를 생성합니다. 세포 독성은 양적 상피 세포에서 락트 산 탈수소 효소 (LDH)의 출시를 측정하기 위해 다양한 키트를 사용하여 평가하실 수 있습니다. LDH는 세포 용해 또는 세포 사망시 세포외 환경에 출시 안정 cytosolic 효소이다.
기도 monolayer의 무결성이 손상되지 않습니다 (일반적으로 ~ 8 H 다음 접종에 대한), P. 녹농균이라는 박테리아의 biofilms 성공적으로 형태와 설명 공동 문화 모델 (그림 2A - 2B) 모두에서기도 세포의 꼭대기의 표면에서 개발할 수 있습니다. 3D 재건 (그림 2C)와 부량 다음, 바이오 매스 축적 정확하게 확인할 수 있습니다. 우리는 또한 여러 phenotypic assays 이러한 공동 문화 biofilms를 사용했습니다. 예를 들어, 위에서 언급한 바와 같이, biofilm CFU 쉽게 순차적으로 한천 플레이트에 lysate, 그리고 도금을 diluting, 상피 세포를 lysing에 의해 결정하실 수 있습니다. 우리는 항생제 치료를 다른 변종의 저항을 결정하는이 기법은 유리 나타났습니다. 또한 상피 세포쪽으로 biofilm의 독성은 상용 LDH 탐지 키트를 사용하여 측정할 수 있습니다. 이러한 방법으로 biofilms의 독성에 독성 요소의 역할은 평가하실 수 있습니다. 이러한 모델 시스템은 또한 모터의 융합 연구, RT - PCR과 microarray 분석 1,5,9를 포함한 유전자 발현 응용 프로그램의 번호를 지원합니다.
그림 1. 의 CFBE 세포와 대표 이미지 Monolayer는 P.에 의해기도 세포 monolayers을 훼손하고 손상 녹농균이라는 박테리아의 biofilm 성장. (A) 조직 배양 플레이트 재배 CFBE 세포의 합류 monolayer 대표 이미지, 위상 대조 현미경에 의해 평가. 스케일 바, 120 μm의. 손상된 CFBE의 monolayer의 (B) 예. monolayer 아직 손상의 명백한 보이는 징후를 표시하지 않는다하더라도, P. 녹농균이라는 박테리아 박테리아는 상피 세포와 basolateral 세포막에 얻는 접근 꽉 분기점 사이에 확산 볼 수 있습니다. Biofilm 형성은 일반적으로 악화 monolayer로 인해 이러한 조건 하에서 달성되지 않습니다. 스케일 바, 20 μm의. 자란 P.의 (C) 예 녹농균이라는 박테리아의 biofilm 24 H 후 접종을 관찰했다. 성공적으로 biofilm 형성을 지원하면, CFBE의 monolayer는 복구할 수 없게 손상된 지금 거의 결석했다. 박테리아의 평면 레이어로 성장 잔류 biofilm은, 유리 coverslip에 연결 표시됩니다. 스케일 바, 20 μm의.
그림 2. P. GFP - 표현 P.의 정적 공동 문화 Biofilm 모델 및 흐름 전지 공동 문화 Biofilm 모델을 사용하여 합류 CFBE 세포의 꼭대기의 표면에서 성장 녹농균이라는 박테리아의 biofilms가. (A) 대표 이미지 녹농균이라는 박테리아의 biofilm은 epifluorescence 현미경에 의해 평가 정적 공동 문화 Biofilm 모델을 사용 CFBE 세포의 합류 monolayer에서 성장. 이미지 위상 콘트라스트 채널의 오버레이 및 형광 채널입니다. 스케일 바, 35 μm의. GFP - 라벨 P.의 (B) 대표 이미지 녹농균이라는 박테리아의 biofilm은 흐름 셀 공동 문화 Biofilm 모델을 사용하여 CFBE 세포의 합류 monolayer 6 H에 대한 성장. 기도 monolayer의 시각화를 촉진하기 위해, 핵은 P.과 함께 접종하기 전에 30 분 10 μg / ML Hoechst 33342 (분자 프로브)와 스테인드되었습니다 녹농균이라는 박테리아. 합병과 pseudocolored 이미지가 차등 간섭 대비 (DIC)에 의해 볼되었고, 해당 형광 이미지가 표시됩니다. CFBE 세포의 꼭대기의 표면에 부착된 녹색 대단히 짧은 시간으로 발표 Biofilms은,기도 세포에 걸쳐 분산됩니다. 스케일 바, 20 μm의. (C) 입체 reconstruc6 H 된 P.의 전형적인 버섯 모양의 구조를 보여주는 Z - 시리즈 이미지 스택의 기 녹농균이라는 박테리아의 biofilms은 CFBE 세포 monolayer를 형성. 스케일 바, 10 μm의.
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Discussion
Biofilms 환경 자극에 대한 응답으로 양식 박테리아의 커뮤니티입니다. 이러한 환경 신호 표면, 집합, exopolysaccharides 생산, 그리고 증가 항생 저항 10 다른 phenotypes에 바인딩에서 발생하는 각 세균 내에 세계적인 규제 변화로 이어집니다. 수십년 지난 몇 동안 많은 증거가 biofilms는 만성 감염의 pathogenesis에 큰 역할을한다는 가설을 지원하고 있습니다. 예를 들어, 그것은 잘 접수되었는지 P. 녹농균이라는 박테리아가 biofilms 11 형성하여 낭성 섬유증 (CF) 환자의 폐에 만성 감염을 설정할 수 있습니다. CF는 CFTR 유전자의 변이가 부적 절한 염화물 분비 12 리드 유전 질환입니다. CF 환자는 일반적으로기도 생리학은 미생물 감염 13, 동시에,기도의 두꺼운 점액 플러그로 이어지는 및 변경 체험을 제공합니다. 늦은 사춘기로, CF 항공의 지배 전염성 에이전트 P.입니다 항생제 14 강한 만성 biofilm 감염 이어지는 녹농균이라는 박테리아.
이 문서에서 설명하는 프로토콜은 생활 폐 세포에 biofilm 형성을 연구를위한 모델 시스템의 역할을하기 위해 개발되었습니다. 세균성 biofilms는 많은 질병 상태에 연루되고, 아직 대부분 유리와 플라스틱 15,16 비 생활 고체 표면에 연구하고 있습니다. 단 무생물 표면에 biofilm 형성과 성장을 연구함으로써, 하나는 병원체와 그러한 위의 프로토콜에서 설명한대로 모델 시스템으로 발생할 수있는 호스트 사이의 중요한 상호 작용이 없습니다. 특히 정적 공동 문화 Biofilm 모델 및 흐름 전지 공동 문화 Biofilm 모델 P.의 능력을 활용 녹농균이라는 박테리아는과 상호 작 용할 수 있으며 폐의 상피 표면에 바인딩합니다. 이러한 모델을 사용하여, 우리는 항생제 치료 공동 문화 biofilms의 반응은 고유한 것이 이러한 모델은 정확하게 전염성 상태 1.5을 반영하기 위해 가능성이 더 높아집니다 것으로 나타났습니다. 이러한 점에서, 우리는 언제 P.>로 tobramycin 증가에 대한 저항이 25 배보고있다 녹농균이라는 박테리아의 biofilms는 유리 5 무생물 표면에 성장 biofilms에 비해기도 세포에 성장하고 있습니다. 그것은 이러한 기술은 폐 17 초기 식민지 기간 동안 발생하는 이벤트를 반영 가능성이 높습니다. 따라서, 공동 문화 모델 시스템은 P.하여 CF의기도 상피의 조기 감염을 이해하는 혁신적인 도구를 나타냅니다 녹농균이라는 박테리아 1.
조직 문화 시스템은 일반적으로 호스트와 병원체 간의 상호 작용을 이해하기 위해 고용되었다. 우리는 살아 인간의 상피 세포에 biofilms를 형성하여 더 나아가 이러한 상호 작용을 촬영했습니다. 앞으로 모델의 수정된 버전 다른 잠재적으로 감염 상태에서 다른 박테리아의 biofilm 형성을 조사하는 데 사용할 수 있습니다 여기에 설명되어 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는이 모델을 개발 지침과 제안을 G. O 툴 감사하고 싶습니다. 이 작품은 낭성 섬유증 재단 (GGA, STANTO07RO 및 BAS에 STANTO08GA에 ANDERS06F0), 국립 보건원 (GGA 및 BAS에 R01 - HL074175에 T32A107363)에서 지원하고,되었다 바이오 메디컬 연구 우수 연구 자원 센터를위한 국립 센터 (꼬브르 BAS에 P20 - RR018787).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FCS2 (Focht Live-Cell) chamber | Bioptechs | 060319131616 | |
| FCS2 chamber controller | Bioptechs | 060319-2-0303 | |
| 40 mm glass coverslips | Bioptechs | PH 40-1313-0319 | |
| MEM | Mediatech, Inc. | #10-010-CV | |
| MEM without phenol red | Mediatech, Inc. | Mediatech, Manassass, VA |
References
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