Co-cultura de Modelos Pseudomonas aeruginosa Biofilmes Grown no Live Células Airway Humanos

Summary

Este artigo descreve métodos diferentes de crescimento

Abstract

Biofilme bacteriano têm sido associados com um número de diferentes doenças humanas, mas o desenvolvimento de biofilme geralmente tem sido estudada em superfícies não-vivos. Neste artigo, descrevemos os protocolos para formar biofilmes de Pseudomonas aeruginosa nas células epiteliais das vias aéreas humanas (células CFBE) cultivadas em cultura. No primeiro método (chamado de modelo de biofilme estática Co-cultura), P. aeruginosa é incubada com células CFBE crescido como monocamadas confluentes em placas de cultura de tecido normal. Embora a bactéria é muito tóxico para as células epiteliais, a adição de atrasos arginina a destruição da monocamada tempo suficiente para formar biofilmes sobre as células CFBE. O segundo método (chamado de fluxo de células Modelo Biofilm Co-cultura), envolve a adaptação de um aparelho celular biofilme fluxo, que é frequentemente usado em biofilme de pesquisa, para acomodar uma lamela de vidro apoiar uma monocamada confluente de células CFBE. Este monocamada é inoculado com P. aeruginosa e uma bomba peristáltica, então, flui meio fresco através das células. Em ambos os sistemas, biofilme bacteriano forma dentro de 6-8 horas após a inoculação. Visualização do biofilme é reforçada pelo uso de P. cepas aeruginosa constitutivamente expressando a proteína verde fluorescente (GFP). A estática e fluxo de células ensaios Co-cultura de biofilme são sistemas modelo para P. início aeruginosa infecção do pulmão da fibrose cística (CF), e estas técnicas permitem diferentes aspectos da P. formação de biofilme e virulência aeruginosa a ser estudado, incluindo a citotoxicidade biofilme, a medição do biofilme UFC, e de coloração e visualização do biofilme.

Protocol

1. Modelo Biofilm estática co-cultura

1. O modelo de biofilme estática cultura ^Co-1 usa CFBE41o células (células CFBE), que são imortalizadas células originalmente desenvolvido a partir de um indivíduo com homozigotos CF para a mutação DF508-CFTR ^2,3,4. Células CFBE deve ser semeado a uma concentração de 10 ⁶ células / poço em uma placa de cultura de 6 bem tecido ou 2 X 10 ⁵ em uma placa de cultura de 24 poços de tecidos em meio essencial mínimo (MEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino, 2mM de L-glutamina, 50 U / mL de penicilina, e 50 mcg / mL estreptomicina. Usamos 1,5 mL médio por poço em placas de 6 poços e 0,5 mL médio por poço em placas de 24 poços.
2. Células devem ser cultivadas a 37 ° C e 5% de CO ₂ do ar -95% por 7-10 dias para formar uma monocamada confluente antes da inoculação com bactérias. O meio deve ser trocada a cada 2-3 dias. Essas condições foram mostradas para levar à formação de uma monocamada confluente e tight junctions.
3. Crescer P. aeruginosa em 5 mL LB por 18 horas a 37 ° C num agitador estufa a 200 rpm. Sob essas condições, P. culturas aeruginosa tipicamente atingir uma densidade de 5x10 ⁹ UFC / mL.
4. Para a inoculação bacteriana, remova a mídia a partir de células CFBE e adicionar igual volume de MEM sem vermelho de fenol, suplementado com 2 mM L-glutamina (médio Microscopy). Monocamadas confluentes CFBE são inoculadas com P. aeruginosa em uma multiplicidade de infecção de cerca de 30:1 em relação ao número de células CFBE originalmente semeada. Isso equivale a 2 X 10 ⁷ UFC / mL em 1,5 mL MEM / bem para 6-bem placas e 1,2 X 10 ⁷ UFC / mL em 0,5 mL MEM / bem para placas de 24 poços.
5. Incubar as placas durante 1 hora a 37 ° C e 5% CO _2% -95 ar.
6. Após a incubação de 1 hora, o sobrenadante deve ser removido e substituído por meio de Microscopia fresco suplementado com arginina de 0,4%.
7. Incubar a 37 ° C e 5% de CO ₂ do ar 95% para vários pontos do tempo (até cerca de 8 horas) e analisar a integridade da monocamada CFBE meio de microscopia de contraste de fase. Se as células das vias aéreas não são confluentes, P. aeruginosa irá rapidamente (em minutos) ter acesso à superfície basolateral das células e destruir a integridade celular. Inoculação com P. cepas aeruginosa que constitutivamente expressa resultados GFP em microcolônias biofilme fluorescentes que podem ser visualizados por microscopia de epifluorescência ou confocal.
8. O CFU bacteriana no biofilme pode ser determinado através de lavagem a co-cultura 2-3 vezes com tampão fosfato (PBS) para eliminar bactérias planctônicas. Após a lavagem, o tratamento com 0,1% Triton X-100 em PBS ou MEM por 10-15 minutos para lisar as células epiteliais e dispersar o biofilme.
9. Vortex por 3 minutos e preparar diluições de série do lisado. Placa dessas diluições em ágar LB e incubar durante a 37 ° C. Contar as colónias no dia seguinte para determinar o UFC.

2. Célula de fluxo Modelo Biofilm Co-cultura

1. O fluxo de células Modelo Biofilm co-cultura (ensaio de fluxo) envolve a modificação do padrão de aparelho celular biofilme fluxo para acomodar células CFBE ^5.
2. Coloque vários de 40 mm de diâmetro lamínulas de vidro em um copo de 100 mL limpo. Cubra firmemente com duas camadas de papel alumínio e autoclave em um ciclo de seca por 20 min.
3. Trabalhando em uma capa de cultura de células, pegue uma lamela estéril do copo com a pinça de etanol lavados e coloque em um prato de plástico estéreis de 60 mm de diâmetro.
4. Adicionar 3 mL de pré-aquecido meio de crescimento celular, pressionando a lamela com a ponta da pipeta para remover qualquer bolha preso debaixo e forçar a lamínula para o fundo do prato de plástico.
5. Semente de 2x10 ⁶ células por prato e agitar suavemente o prato e para trás. Evitar agitação para evitar a centrifugação as células contra os lados do prato.
6. Coloque o prato em um 5% de CO ₂ a 95% do ar incubadora a 37 ° C e alimentar as células a cada dois dias com 3 mL meio de cultura fresco para 8 a 10 dias. As células formam uma monocamada confluente na lamela de vidro.
7. Crescer P. aeruginosa em 5 mL LB por 18 horas a 37 ° C num agitador estufa a 200 rpm. Sob essas condições, P. culturas aeruginosa tipicamente atingir uma densidade de 5x10 ⁹ UFC / mL. Usamos P. PAO1 tensão aeruginosa carregando o plasmídeo pSMC21 para expressão constitutiva de GFP ^6.
8. Adicionar 1 mL da cultura bacteriana em um tubo de microcentrífuga estéril. Centrifugar a 6000 rpm por 3 min e lavar o pellet bacteriano duas vezes em 1 mL de meio de Microscopia.
9. Diluir 0,5 mL de bactérias lavadas e ressuspendidas em 4,5 mL de médio Microscopia para alcançar uma concentração de ~ 5x10 ⁸ UFC / mL.
10. Observação de células vivasem tempo real requer uma câmara de imagem acoplado a uma bomba peristáltica (para assegurar um fluxo de nutrientes para longos períodos de tempo) e um controlador de temperatura. Usamos o FCS2 Bioptechs (Focht Live Cell) câmara ligada a um baixo fluxo de perfusão micro-bomba com 1 / 16 ^º corte tubos C-flex para comprimentos apropriados e autoclavada para esterilidade, e com temperatura regulada através do controlador da câmara FCS2. Mantemos a fonte de entrada de meio em banho-maria a 37 ° C situado ao lado do microscópio.
11. Montar a câmara de fluxo. A câmara de FCS2 inclui uma base auto-locking (que se senta no palco durante adaptador de imagem) e uma metade superior conectados aos tubos de perfusão eo controlador de câmara. A câmara é montado de cabeça para baixo antes de ser virado e colocado no adaptador palco. Segure a parte superior da câmara de cabeça para baixo, para que os tubos de perfusão são visíveis, e alinhar os furos de folga de uma junta de borracha 0,75 mm de espessura em tubos de perfusão. Stack o slide microaqueduct fornecido com a câmara em cima da vedação de borracha, certificando-se o lado da ranhura é para cima, e colocar outra junta de borracha no topo do slide. A espessura e geometria interna desta segunda vedação irá determinar o volume da câmara. Nós normalmente trabalham com uma junta de borracha 0,75 mm de espessura com 30 mm de geometria interna rodada.
12. Adicionar 1 mL da pré-aquecido (37 ° C) Microscopia médio no centro do slide.
13. Recuperar um prato de 60 mm da cultura de células incubadora, remova a mídia passou e lavar as células uma vez com 3 mL de pré-aquecido médio Microscopia. Essa etapa assegura a eliminação do vermelho de fenol e antibióticos presentes no meio de crescimento celular. Vermelho de fenol é levemente fluorescente e pode interferir com a imagem, enquanto que os antibióticos podem erradicar P. aeruginosa bactérias antes que possam estabelecer biofilmes.
14. Uso do etanol lavado fórceps, recuperar a lamela do prato e abaixá-lo de cabeça para baixo sobre o talão de meio de Microscopia colocado na câmara. A lamela está agora descansando sobre a junta de borracha segundo e monocamada de células das vias aéreas é voltado para baixo.
15. Segurando os componentes montados em uma mão, coloque a base da câmara no topo da pilha, e ligue a câmara mais rápida para que tudo fique do lado certo. Bloqueio da base no lugar, girando o anel.
16. Ligue o tubo de admissão do baixo fluxo de perfusão micro-bomba e iniciar o fluxo a uma taxa de 20 mL / h, este fluxo está dentro da capacidade de velocidade de natação do P. aeruginosa. A segunda parte de links tubulação da bomba para um balão de meio de Microscopia colocado no 37 ° C banho de água localizado ao lado do microscópio.
17. Anexar estéril pré-cortados 16/01 ^º C-Flex tubulação para a entrada e tubos de perfusão tomada da câmara, ligar o controlador de temperatura, em seguida, coloque a câmara montada no palco de um microscópio microscópio invertido de fluorescência.
18. Usando uma seringa descartável de 1 ml, injetar a suspensão bacteriana previamente preparado para a câmara, usando uma válvula de duas vias colocada em linha entre a bomba ea câmara. Em nosso meio particular, é preciso um volume de 0,6 mL de suspensão bacteriana para alcançar a câmara. Ajustar este volume de acordo com o seu comprimento da tubulação particular. Também achamos útil fazer um in-line descartáveis ​​0,22 mM de filtro entre a bomba ea válvula de duas vias para evitar que as bactérias de nadar contra a corrente e contaminando o balão de entrada.
19. Para permitir que as bactérias para anexar as células das vias aéreas, parar a bomba de 2h. O fluxo pode então ser reiniciado e mantido a 20 mL / h para o resto do experimento.
20. Monitorar a integridade das células das vias aéreas pelo contraste de interferência diferencial (DIC) de microscopia durante todo o experimento para verificar se há sinais de danos à monocamada. Ao mesmo tempo, acompanhar o desenvolvimento da GFP-rotulados P. biofilmes aeruginosa na superfície apical das células das vias aéreas através da aquisição de imagens com um microscópio de fluorescência confocal invertida ou wide-campo.

3. Resultados representante

Nós usamos uma linhagem de P. aeruginosa contendo o plasmídeo pSMC21 que permite a expressão constitutiva de GFP ^6. Por esta razão, GFP-rotulados biofilmes crescem em uma monocamada CFBE podem ser visualizados por microscopia de epifluorescência. Alternativamente, a visualização do biofilme pode ser alcançado através da coloração P. unlabeled aeruginosa com um 1% de solução branca calcofluor por 1 hora a 37 ° C ^1.

Para imagens de formação de biofilme sobre as células CFBE no ensaio de fluxo, nós usamos um adaptador de estágio feito por encomenda, mas várias empresas podem agora fornecer adaptadores palco especialmente montado. Trabalhamos com uma Olympus IX70 microscópio invertido equipado com um profundo arrefecimento ORCA-AG câmera CCD e um x60 objetivo óleo de imersão (abertura numérica 1.40). O filtro wcalcanhar é equipado com um filtro de banda 480/40 nm de excitação e um pass 535/30 nm banda do filtro de emissão passar. Imagens digitais foram adquiridas com o pacote de software OpenLab 4.0.3 (Improvisação) e volumes foram deconvolved por iterativa restauração usando o software 3.5.1 Volocity (Improvisação). Análise quantitativa de estruturas 3D biofilme foi alcançada com o pacote de software de análise de imagem COMSTAT ^7,8.

Para qualquer modelo de co-cultura considerada, deve-se prestar especial atenção ao desenvolvimento de citotoxicidade entre os componentes do modelo. Em ambos os estáticos e os ensaios de célula de fluxo, descobrimos que a monocamada CFBE poderia suportar a presença de P. aeruginosa por até 8 horas após a inoculação, sem qualquer sinal de alteração. Integridade monocamada epitelial pode ser avaliada por microscopia de contraste de fase utilizando um microscópio invertido ¹ (Figura 1A) ou por microscopia de interferência diferencial contraste (DIC) durante todo o experimento ^5. Ao longo do tempo, P. aeruginosa irá produzir toxinas e fatores de virulência que se acumulam e podem danificar a monocamada de células epiteliais na totalidade ou em seções (Figura 1B 1C). Citotoxicidade pode ser quantitativamente avaliada utilizando vários kits para medir a liberação de lactato desidrogenase (LDH) de células epiteliais. LDH é uma enzima citosólica estável lançado no meio extracelular sobre a lise celular ou morte celular.

Quando a integridade da monocamada das vias aéreas não seja comprometida (normalmente para a inoculação h ~ 8 seguinte), P. biofilmes aeruginosa pode formar e desenvolver com sucesso na superfície apical das células das vias respiratórias em ambos os co-cultura modelos descritos (Figura 2A-2B). Após a reconstrução 3D (Figura 2C) e quantificação, acúmulo de biomassa pode ser determinada com precisão. Temos também usou esses biofilmes co-cultura em vários ensaios fenotípicos. Por exemplo, como mencionado acima, biofilme UFC pode ser facilmente determinado pela lise das células epiteliais, em série diluir o lisado, e plaqueamento em placas de ágar. Nós descobrimos que esta técnica vantajosa em determinar a resistência de diferentes linhagens ao tratamento com antibióticos. Além disso, o biofilme toxicidade para as células epiteliais podem ser medidos utilizando kits de detecção disponíveis comercialmente LDH. Desta forma, o papel de fatores de virulência em toxicidade de biofilmes pode ser avaliado. Estes sistemas modelo também apoiar uma série de aplicações de expressão gênica, incluindo estudos de promotor de fusão, RT-PCR e análise de microarray ^1,5,9.

Figura 1. Monocamada de células CFBE e imagens representativas de comprometida e danificada monocamadas de células das vias aéreas devido a P. aeruginosa crescimento do biofilme. (A) Imagem representativa de uma monocamada confluente de células cultivadas em placas CFBE cultura de tecidos, avaliada por microscopia de contraste de fase. Barra de escala, 120 mM. (B) Exemplo de uma monocamada CFBE comprometida. Mesmo que a monocamada não exibe óbvio sinais visíveis de danos ainda, P. bactérias aeruginosa são vistos espalhando entre o tight junctions das células epiteliais e de acesso a ganhar para as membranas basolateral. Formação de biofilme normalmente não é alcançado sob essas condições, devido à deterioração da monocamada. Barra de escala, 20 mM. (C) Exemplo de uma p. overgrown biofilme aeruginosa observadas 24 h após a inoculação. Após o sucesso de apoiar a formação de biofilme, a monocamada CFBE foi danificado além do reparo e agora está praticamente ausente. Biofilme residual, crescendo como uma camada lisa de bactérias, é mostrado inerentes às lamela de vidro. Barra de escala, 20 mM.

Figura 2. P. biofilmes aeruginosa cresceu na superfície apical das células confluentes CFBE usando o modelo de biofilme estática co-cultura e do fluxo de células Modelo Biofilm Co-cultura. imagem (A) Representante de uma p. expressando GFP- biofilme aeruginosa cultivada em uma monocamada confluente de células CFBE usando o modelo de biofilme estática Co-cultura, avaliada por microscopia de epifluorescência. Imagem é uma sobreposição do canal de contraste de fase eo canal de fluorescência. Barra de escala, 35 mM. (B) Imagem representativa de um P. GFP-rotulados biofilme aeruginosa cresceu para 6 h em uma monocamada confluente de células CFBE usando o fluxo de células Modelo Biofilm Co-cultura. Para facilitar a visualização da monocamada das vias aéreas, os núcleos foram corados com 10 mcg / mL Hoechst 33342 (Molecular Probes) por 30 min antes da inoculação com P. aeruginosa. Imagens fundidas e pseudocolored eram vistos por contraste de interferência diferencial (DIC), e as imagens correspondentes fluorescentes são mostrados. Biofilmes, apresentando-se como aglomerados verdes junto à superfície apical das células CFBE, estão dispersos através das células das vias aéreas. Barra de escala, 20 mM. (C) reconstrução tridimensionalção de pilhas z-series imagem que mostra o típico cogumelo-como estruturas de 6 h de idade P. biofilmes aeruginosa formando sobre uma monocamada de células CFBE. Barra de escala, 10 mM.

Discussion

Biofilmes são comunidades de bactérias que se formam em resposta a estímulos ambientais. Estes sinais ambientais globais levar a mudanças regulatórias dentro de cada bactéria, resultando na ligação a uma superfície, de agregação, a produção de exopolissacarídeos, e outros fenótipos, tais como aumento da resistência aos antibióticos ^10. Ao longo das duas últimas décadas, muitas provas apoiou a hipótese de que biofilmes desempenham um grande papel na patogênese das infecções crônicas. Por exemplo, é bem aceito que P. aeruginosa é capaz de estabelecer infecções crônicas nos pulmões de Fibrose Cística (FC) dos pacientes através da formação de biofilmes ^11. CF é uma doença genética, onde as mutações no gene CFTR levam à secreção de cloreto imprópria ^12. Pacientes com FC geralmente experiência alterado das vias aéreas levando a fisiologia plugs de muco espesso nas vias aéreas e, simultaneamente, a infecções microbianas ^13. Ao final da adolescência, o agente infeccioso da CF dominando vias aéreas é P. aeruginosa, levando a uma infecção crônica que biofilme é resistente aos antibióticos ^14.

Os protocolos descritos neste artigo foram desenvolvidos para atuar como sistemas modelo para estudar a formação de biofilme sobre as células do pulmão de vida. Biofilme bacteriano estão implicados em muitos estados de doença e, ainda, têm sido quase sempre estudou em não-vivos superfícies sólidas, tais como vidro e plástico ^15,16. Ao estudar a formação de biofilme e crescimento em superfícies abióticas só, um está faltando interações importantes entre patógeno e hospedeiro que só pode ocorrer com um sistema modelo, como descrito nos protocolos acima. Especificamente, o modelo de biofilme estática co-cultura e do fluxo de células Modelo Biofilm Co-cultura aproveitar a capacidade de P. aeruginosa para interagir e se ligam à superfície epitelial do pulmão. Usando esses modelos, temos mostrado que a resposta dos biofilmes co-cultura ao tratamento com antibióticos é única e que estes modelos são mais propensas a refletir com precisão o estado infeccioso ^1,5. Neste sentido, relataram que a resistência a aumentos tobramicina por> 25 vezes quando P. biofilmes aeruginosa são cultivados em células das vias respiratórias em comparação com biofilmes em superfícies cultivadas abióticos como o vidro ^5. É provável que essas técnicas refletem os acontecimentos que ocorrem durante a colonização precoce dos ¹⁷ de pulmão. Portanto, os sistemas de co-cultura modelo representam ferramentas inovadoras para a compreensão de infecção precoce do epitélio das vias aéreas por P. CF aeruginosa ^1.

Sistemas de cultura de tecidos têm sido comumente empregadas para compreender as interacções entre o hospedeiro eo patógeno. Nós tomamos essas interações mais um passo através da formação de biofilmes em viver células epiteliais humanas. No futuro, versões modificadas de modelos descritos aqui poderiam potencialmente ser usada para investigar a formação de biofilmes de bactérias diferentes em outros estados infecciosos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FCS2 (Focht Live-Cell) chamber	Bioptechs	060319131616
FCS2 chamber controller	Bioptechs	060319-2-0303
40 mm glass coverslips	Bioptechs	PH 40-1313-0319
MEM	Mediatech, Inc.	#10-010-CV
MEM without phenol red	Mediatech, Inc.	Mediatech, Manassass, VA