Summary
Ce document décrit les différentes méthodes de plus en plus
Abstract
Biofilms bactériens ont été associés à un certain nombre de différentes maladies humaines, mais le développement du biofilm a généralement été étudié sur des surfaces non-vivantes. Dans cet article, nous décrivons les protocoles de formant des biofilms de Pseudomonas aeruginosa sur les cellules des voies respiratoires épithéliales humaines (cellules CFBE) en culture. Dans la première méthode (appelée le modèle de biofilm statique co-culture), P. aeruginosa est incubé avec des cellules cultivées comme CFBE monocouches confluentes sur le standard des plaques de culture tissulaire. Bien que la bactérie est très toxique pour les cellules épithéliales, l'ajout de retards arginine la destruction de la monocouche assez longtemps pour former des biofilms sur les cellules CFBE. La deuxième méthode (appelée la cellule de flux biofilm modèle de co-culture), implique l'adaptation d'un appareil cellulaire biofilm flux, ce qui est souvent utilisé dans un biofilm de recherche, pour accueillir une lamelle de verre supportant une monocouche confluente de cellules CFBE. Cette monocouche est inoculé avec P. aeruginosa et une pompe péristaltique s'écoule ensuite du milieu frais à travers les cellules. Dans les deux systèmes, les biofilms bactériens se forment dans les 6-8 heures après l'inoculation. Visualisation du biofilm est renforcée par l'utilisation de P. aeruginosa souches exprimant de manière constitutive la protéine fluorescente verte (GFP). Les analyses statique et dynamique cellulaire biofilm co-culture sont des systèmes modèles pour le début de P. l'infection aeruginosa de la fibrose (FC) pulmonaires kystique, et ces techniques permettent différents aspects de P. formation d'un biofilm aeruginosa et de la virulence d'être étudiée, y compris la cytotoxicité du biofilm, la mesure du biofilm UFC, et la coloration et la visualisation du biofilm.
Protocol
1. Modèle statique biofilm co-culture
- Le modèle de biofilm statique Co-culture utilise une CFBE41o (cellules CFBE), qui sont des cellules immortalisées développé à l'origine d'un individu avec homozygotes pour la mutation FC AF508-CFTR 2,3,4. Cellules CFBE doivent être ensemencées à une concentration de 10 6 cellules / puits dans une plaque de 6 puits de culture de tissu ou de 2 x 10 5 dans une plaque de 24 puits de culture de tissu dans un milieu essentiel minimal (MEM) supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal, 2 mM L-glutamine, 50 U / ml de pénicilline, et 50 ug / ml de streptomycine. Nous utilisons 1,5 ml de milieu par puits dans des plaques 6 puits et 0,5 ml de milieu par puits dans des plaques 24 puits.
- Les cellules doivent être cultivées à 37 ° C et 5% de CO 2 atmosphérique -95% pour les 7-10 jours pour former une monocouche confluente avant l'inoculation avec des bactéries. Le milieu doit être changé tous les 2-3 jours. Ces conditions ont été démontré que conduire à la formation d'une monocouche confluente et des jonctions serrées.
- Cultivez P. aeruginosa dans 5 ml LB pendant 18 heures à 37 ° C sur un agitateur incubateur à 200 tpm. Dans ces conditions, P. cultures aeruginosa sera typiquement atteindre une densité de 5x10 9 UFC / ml.
- Pour l'inoculation bactérienne, retirez le support à partir des cellules CFBE et ajouter un volume égal de MEM sans rouge de phénol, supplémenté avec 2 mM de L-glutamine (milieu de microscopie). Monocouches confluentes sont CFBE inoculés avec P. aeruginosa à une multiplicité d'infection d'environ 30:1 rapport au nombre de cellules CFBE origine ensemencés. Cela équivaut à 2 x 10 7 UFC / ml dans 1,5 ml MEM / puits pour plaques 6 puits et 1,2 x 10 7 UFC / ml dans 0,5 ml MEM / puits pour plaques de 24 puits.
- Incuber les plaques pendant 1 heure à 37 ° C et 5% de CO 2 atmosphérique -95%.
- Suite à l'incubation de 1 heure, le surnageant doit être retiré et remplacé par du milieu frais Microscopie complété avec de l'arginine 0,4%.
- Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 atmosphérique -95% pour les différents temps (jusqu'à environ 8 heures) et d'analyser l'intégrité de la monocouche CFBE en utilisant la microscopie à contraste de phase. Si les cellules des voies respiratoires sont non confluentes, P. aeruginosa sera rapidement (quelques minutes) d'accéder à la surface basolatérale des cellules et de détruire l'intégrité cellulaire. L'inoculation avec P. souches aeruginosa qui expriment constitutivement les résultats GFP dans des microcolonies biofilm fluorescent qui peut être visualisé par microscopie à épifluorescence ou confocal.
- L'UFC de bactéries dans le biofilm peut être déterminé par le lavage de la co-culture 2-3 fois avec un tampon phosphate salin (PBS) pour éliminer les bactéries planctoniques. Après le lavage, traiter avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS ou MEM pendant 10-15 minutes pour lyser les cellules épithéliales et de disperser le biofilm.
- Vortex pendant 3 minutes et de préparer des dilutions en série du lysat. Plaque ces dilutions sur gélose LB et incuber une nuit à 37 ° C. Compter les colonies le lendemain afin de déterminer l'UFC.
2. Cellule de débit biofilm modèle de co-culture
- La cellule de débit biofilm modèle de co-culture (test de débit) implique la modification de l'appareil cellulaire biofilm débit standard pour accueillir les cellules CFBE 5.
- Placez plusieurs de 40 mm de diamètre lamelles de verre dans un récipient propre bécher de 100 mL. Couvrir hermétiquement avec 2 couches de papier d'aluminium et autoclaver sur un cycle de séchage pendant 20 min.
- Travailler sous une hotte de culture de cellules, saisir une lamelle stérile du bécher en utilisant une pince éthanol lavés et le placer dans une solution stérile de 60 mm de diamètre en plastique plat.
- Ajouter 3 ml de pré-chauffé milieu de croissance cellulaire, en appuyant sur la lamelle à l'extrémité de la pipette pour enlever toute bulle piégée en dessous et à la force de la lamelle au fond du plat en plastique.
- Graine 2x10 6 cellules par boîte et secouer le plat délicatement en arrière. Évitez tourbillonnant pour éviter la centrifugation les cellules contre les côtés du plat.
- Placer le plat dans un 5% de CO 2 -95% incubateur à air à 37 ° C et alimenter les cellules tous les autres jours avec 3 ml milieu de croissance frais pendant 8 à 10 jours. Les cellules forment une monocouche confluente sur la lamelle de verre.
- Cultivez P. aeruginosa dans les 5 ml LB pendant 18 heures à 37 ° C sur un agitateur incubateur à 200 tpm. Dans ces conditions, P. cultures aeruginosa sera typiquement atteindre une densité de 5x10 9 UFC / ml. Nous utilisons P. PAO1 aeruginosa souche portant le plasmide pSMC21 pour l'expression constitutive de la GFP 6.
- Ajouter 1 mL de culture bactérienne dans un microtube stérile. Centrifuger à 6000 rpm pendant 3 min, et laver le culot bactérien double dans 1 ml de milieu de microscopie.
- Diluer 0,5 ml de bactéries lavées et resuspendues dans 4,5 ml de microscopie moyenne pour atteindre une concentration de ~ 5x10 8 UFC / ml.
- L'observation de cellules vivantesen temps réel nécessite une chambre d'imagerie couplé à une pompe péristaltique (pour assurer un flux de nutriments pour des périodes prolongées) et un régulateur de température. Nous utilisons les FCS2 Bioptechs (Focht cellules vivantes) chambre reliée à un faible débit de perfusion micro-pompe avec 1 / 16 ème couper des tubes C-Flex pour les longueurs appropriées et autoclavé pour la stérilité, et la température régulée via le contrôleur de la chambre FCS2. Nous gardons la source d'entrée de milieu dans un bain à 37 ° C eau situé juste à côté du microscope.
- Assemblez la chambre d'écoulement. La chambre comprend une base FCS2 auto-verrouillage (qui se trouve sur l'adaptateur scène lors d'imagerie) et une moitié supérieure reliés aux tubes de perfusion et le contrôleur de la chambre. La chambre est monté à l'envers avant d'être retourné et placé sur l'adaptateur scène. Tenir la moitié supérieure de la chambre de l'envers de sorte que les tubes de perfusion sont visibles, et aligner les trous de passage d'un joint en caoutchouc épais de 0,75 mm sur les tubes de perfusion. Empilez les diapositives microaqueduct fourni avec la chambre au-dessus du joint en caoutchouc, en s'assurant que le côté rainuré est en hausse, et placer un autre joint de caoutchouc sur le dessus de la diapositive. L'épaisseur et la géométrie interne de ce second joint permettra de déterminer le volume de la chambre. Nous fonctionnent généralement avec un joint en caoutchouc de 0,75 mm d'épaisseur avec un 30 mm géométrie interne ronde.
- Ajouter 1 mL de pré-chauffée (37 ° C) moyenne de microscopie au centre de la diapositive.
- Récupérer un plat de 60 mm de la incubateur de culture cellulaire, retirez le support passé et laver les cellules une fois avec 3 ml de milieu de microscopie préchauffé. Cette étape garantit l'élimination de la rouge de phénol et d'antibiotiques présents dans le milieu de croissance cellulaire. Rouge de phénol est légèrement fluorescente et peut interférer avec l'imagerie, alors que les antibiotiques peuvent éradiquer P. aeruginosa avant qu'ils puissent établir des biofilms.
- L'utilisation d'éthanol-lavés forceps, de récupérer la lamelle de l'antenne et l'abaisser à l'envers sur la perle du milieu de microscopie placé sur la chambre. La lamelle est désormais posée sur le joint en caoutchouc deuxième et la monocouche de cellules des voies respiratoires est confronté à la baisse.
- Tenir les composants assemblés dans une main, placez la base de la chambre au-dessus de la pile, et tournez la chambre plus rapidement de sorte que tout est en place côté droit. Verrouillage de la base en place en tournant la bague.
- Connectez le tube d'admission à la circulation faible de micro-irrigation pompe et démarrer le flux à un taux de 20 ml / h, ce débit est dans la capacité de vitesse de nage des P. aeruginosa. Un deuxième morceau de tuyau de la pompe liens dans un flacon de milieu de microscopie placé dans le bain à 37 ° C eau situé juste à côté du microscope.
- Fixez stériles pré-coupés 1 / 16 ème C-Flex tuyau à l'entrée et les tubes de perfusion sortie de la chambre, se connecter au contrôleur de température, puis placer la chambre assemblé sur la platine du microscope d'un microscope inversé à fluorescence.
- En utilisant une seringue de 1 ml à usage unique, injecter la suspension bactérienne préparée précédemment dans la chambre, en utilisant une vanne à deux voies placé en ligne entre la pompe et la chambre. Dans notre contexte particulier, il prend un volume de 0,6 mL de suspension bactérienne pour atteindre la chambre. Réglez ce volume en fonction de la longueur de votre tuyau particulier. Nous trouvons également utile de placer une en ligne jetables 0,22 um filtre entre la pompe et la vanne à deux voies pour empêcher les bactéries de la natation en amont et en contaminant dans le ballon d'entrée.
- Pour permettre aux bactéries de s'attacher à des cellules des voies respiratoires, arrêter la pompe pendant 2 heures. Le débit peut alors être repris et maintenu à 20 mL / h pour le reste de l'expérience.
- Surveiller l'intégrité des cellules des voies respiratoires par contraste d'interférence différentiel (DIC) microscope long de l'expérience pour vérifier les signes de dommages à la monocouche. Simultanément, suivre le développement de la GFP-étiquetée P. biofilms aeruginosa à la surface apicale des cellules des voies respiratoires par l'acquisition d'images avec un microscope à fluorescence confocale ou à grand champ inversé.
3. Les résultats représentatifs
Nous utilisons une souche de P. aeruginosa contenant le plasmide pSMC21 qui permet l'expression constitutive de la GFP 6. Pour cette raison, la GFP-étiquetée biofilms croissant sur une monocouche CFBE peut être visualisé par microscopie à épifluorescence. Alternativement, la visualisation du biofilm peut être réalisé par une coloration sans étiquette P. aeruginosa avec une solution à 1% calcofluor blanc pour 1 heure à 37 ° C 1.
Pour la formation de biofilms d'imagerie sur les cellules CFBE dans le test de débit, nous utilisons un adaptateur étape de mesure, mais plusieurs entreprises peuvent maintenant fournir des adaptateurs scène spécialement aménagée. Nous travaillons avec un Olympus IX70 microscope inversé équipé d'une caméra ORCA-AG profonde de refroidissement CCD et une immersion dans l'huile x60 objectif (ouverture numérique 1,40). Le filtre wtalon est équipé d'un filtre nm bande d'excitation 480/40 passe et une bande d'émission 535/30 nm filtre passe. Les images numériques ont été acquises avec le paquet OpenLab logiciels 4.0.3 (Improvisation) et les volumes ont été déconvoluées par itérative de restauration en utilisant les logiciels Volocity 3.5.1 (Improvisation). L'analyse quantitative des structures de biofilm 3D a été réalisé avec le paquet de l'image COMSTAT logiciel d'analyse 7,8.
Pour tout modèle de co-culture considérée, il faut accorder une attention particulière à la cytotoxicité de développement entre les composantes du modèle. Dans les deux statiques et des dosages cellule d'écoulement, nous avons constaté que la monocouche CFBE pourrait résister à la présence de P. aeruginosa jusqu'à 8 heures après l'inoculation, sans aucun signe d'altération. L'intégrité monocouche épithéliale peut être évaluée par microscopie à contraste de phase en utilisant un microscope inversé 1 (figure 1A) ou par des interférences de contraste différentiel (DIC) microscope à travers l'expérience 5. Au fil du temps, P. aeruginosa se produisent des toxines et des facteurs de virulence qui s'accumulent et peuvent endommager la monocouche de cellules épithéliales en tout ou en sections (figure 1B-1C). La cytotoxicité peut être évalué quantitativement l'aide de kits différents pour mesurer la libération de lactate déshydrogénase (LDH) à partir des cellules épithéliales. LDH est une enzyme cytosolique stables libérés dans le milieu extracellulaire lors de la lyse cellulaire ou la mort cellulaire.
Lorsque l'intégrité de la monocouche voies respiratoires ne sont pas compromises (typiquement pour ~ 8 h après l'inoculation), P. biofilms aeruginosa peuvent réussir à former et développer à la surface apicale des cellules des voies respiratoires dans les deux co-culture des modèles décrits (figure 2A-2B). Suite à la reconstruction 3D (figure 2C) et la quantification, l'accumulation de la biomasse peut être déterminée avec précision. Nous avons également utilisé ces biofilms de co-culture dans plusieurs tests phénotypiques. Par exemple, comme mentionné plus haut, le biofilm UFC peut être facilement déterminée par la lyse des cellules épithéliales, dilution en série du lysat, et le placage sur gélose. Nous avons trouvé cette technique avantageuse dans la détermination de la résistance des souches différentes de traitement antibiotique. Par ailleurs, la toxicité du biofilm vers les cellules épithéliales peut être mesurée à l'aide disponible dans le commerce des kits de détection LDH. De cette manière, le rôle des facteurs de virulence de la toxicité des biofilms peuvent être évalués. Ces systèmes modèles également en charge un certain nombre de demandes d'expression génique, y compris les études de fusion promoteur, la RT-PCR et l'analyse des microréseaux 1,5,9.
Figure 1. Monocouche de cellules CFBE et images représentant des compromis et endommagé des monocouches de cellules des voies respiratoires due à P. la croissance du biofilm aeruginosa. (A) l'image représentant d'une monocouche confluente de cellules cultivées en CFBE plaques de culture tissulaire, évaluée par microscopie à contraste de phase. La barre d'échelle, 120 um. (B) Exemple d'une monocouche CFBE compromise. Même si la monocouche n'affiche pas évidentes signes visibles de dommages encore, P. aeruginosa sont vu répandre entre les jonctions serrées des cellules épithéliales et d'avoir accès aux membranes basolatérale. La formation du biofilm n'est généralement pas atteint dans ces conditions, en raison de la détérioration de monocouche. La barre d'échelle, 20 um. (C) Exemple d'une envahies P. biofilm aeruginosa observée 24 h après l'inoculation. Après avoir réussi à soutenir la formation de biofilm, la monocouche CFBE a été endommagé de façon irréparable et il est maintenant pratiquement absents. Biofilm résiduel, de plus en plus comme une couche plane de bactéries, est montré attachés à la lamelle de verre. La barre d'échelle, 20 um.
Figure 2. P. biofilms aeruginosa cultivées à la surface apicale des cellules confluentes CFBE l'aide du modèle statique biofilm co-culture et de la Cellule de débit biofilm modèle de co-culture. (A) l'image d'un représentant P. exprimant la GFP biofilm aeruginosa cultivées sur une monocouche confluente de cellules CFBE l'aide du modèle statique biofilm co-culture, évaluée par microscopie à épifluorescence. L'image est une superposition des canaux à contraste de phase et le canal de fluorescence. La barre d'échelle, 35 um. Représentant l'image (B) d'un P. GFP-étiquetée biofilm aeruginosa grandi pendant 6 h sur une monocouche confluente de cellules CFBE utilisant la cellule de flux biofilm modèle de co-culture. Pour faciliter la visualisation de la monocouche des voies respiratoires, les noyaux ont été colorés avec 10 ug / ml Hoechst 33342 (Molecular Probes) pendant 30 min avant l'inoculation avec P. aeruginosa. Des images fusionnées et pseudocolored ont été vues par contraste d'interférence différentiel (DIC), et les images correspondantes fluorescentes sont affichés. Les biofilms, la présentant comme des touffes vertes attachées à la surface apicale des cellules CFBE, sont dispersés à travers les cellules des voies respiratoires. La barre d'échelle, 20 um. (C) la reconstruction en trois dimensionstion des piles d'images de la série Z montrant le type de champignon comme des structures de 6 h, âgé de P. biofilms aeruginosa formant sur une monocouche de cellules CFBE. La barre d'échelle, 10 um.
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Discussion
Les biofilms sont des communautés de bactéries qui se forment en réponse aux stimuli environnementaux. Ces signaux environnementaux mondiaux conduire à des changements réglementaires au sein de chaque bactérie, résultant en se liant à une surface, l'agrégation, la production d'exopolysaccharides et d'autres phénotypes tels que la résistance aux antibiotiques a augmenté de 10. Au cours des deux dernières décennies, beaucoup de preuves a soutenu l'hypothèse que les biofilms jouent un rôle important dans la pathogenèse des infections chroniques. Par exemple, il est bien admis que P. aeruginosa est capable d'établir des infections chroniques dans les poumons de la fibrose kystique (FK) patients en formant des biofilms 11. FC est une maladie génétique, où des mutations dans le gène CFTR conduire à la sécrétion de chlorure de mauvais 12. Patients atteints de mucoviscidose connaissent habituellement altéré la physiologie des voies respiratoires menant aux fiches mucus épais dans les voies respiratoires et, simultanément, à une infection microbienne 13. En fin de l'adolescence, l'agent infectieux des voies aériennes dominent FC est P. aeruginosa, conduisant à une infection chronique qui est un biofilm résistant aux antibiotiques 14.
Les protocoles décrits dans ce document ont été développées pour agir en tant que systèmes modèles pour étudier la formation de biofilm sur les cellules pulmonaires de vie. Biofilms bactériens sont impliqués dans de nombreux états pathologiques et, pourtant, ont surtout été étudiés sur la non-vie des surfaces solides, tels que le verre et le plastique 15,16. En étudiant la formation de biofilm et de la croissance sur des surfaces abiotiques seulement, un manque d'interactions importantes entre pathogène et hôte qui ne peut se produire avec un système modèle tel que décrit dans les protocoles de plus haut. Plus précisément, le modèle statique biofilm co-culture et de la Cellule de débit biofilm modèle de co-culture de profiter de la capacité de P. aeruginosa d'interagir avec et de se lier à la surface épithéliale du poumon. En utilisant ces modèles, nous avons montré que la réponse des biofilms de co-culture à un traitement antibiotique est unique et que ces modèles sont plus susceptibles de refléter fidèlement l'état infectieux 1,5. À cet égard, nous avons signalé que la résistance à la tobramycine par l'augmentation> 25 fois lorsque P. biofilms aeruginosa sont cultivés sur des cellules des voies respiratoires par rapport à biofilms cultivés sur des surfaces abiotiques tels que le verre 5. Il est probable que ces techniques reflètent les événements qui se produisent lors de la colonisation au début des 17 poumons. Par conséquent, les systèmes de modèle de co-culture représentent des outils novateurs pour la compréhension de l'infection précoce de l'épithélium des voies aériennes des FC par P. aeruginosa 1.
Systèmes de culture de tissus ont été couramment employées pour comprendre les interactions entre l'hôte et le pathogène. Nous avons pris ces interactions un peu plus loin en formant des biofilms en direct des cellules épithéliales humaines. Dans le futur, des versions modifiées de modèles décrits ici pourraient potentiellement être utilisées pour étudier la formation de biofilms de bactéries différentes dans d'autres états infectieux.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier G. O Toole pour obtenir des conseils et des suggestions dans le développement de ces modèles. Ce travail a été soutenu par la Cystic Fibrosis Foundation (ANDERS06F0 au GGA, STANTO07RO et STANTO08GA au BAS), les National Institutes of Health (T32A107363 au GGA et R01-HL074175 au BAS), et le Centre national pour les Centres de Ressources de recherche d'excellence en recherche biomédicale (COBRE P20-RR018787 au BAS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FCS2 (Focht Live-Cell) chamber | Bioptechs | 060319131616 | |
| FCS2 chamber controller | Bioptechs | 060319-2-0303 | |
| 40 mm glass coverslips | Bioptechs | PH 40-1313-0319 | |
| MEM | Mediatech, Inc. | #10-010-CV | |
| MEM without phenol red | Mediatech, Inc. | Mediatech, Manassass, VA |
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