Co-kultur modeller av Pseudomonas aeruginosa Biofilmer odlas på levande mänskliga Airway Cells

Summary

Detta dokument beskriver olika metoder att växa

Abstract

Bakteriella biofilmer har förknippats med en rad olika mänskliga sjukdomar, men biofilm utvecklingen i allmänhet har studerats på icke-levande ytor. I denna skrift beskriver vi protokoll för att bilda Pseudomonas aeruginosa biofilmer på människors luftvägar epitelceller (CFBE celler) odlas i kultur. I den första metoden (sk Static Co-kultur Biofilm Model), P. aeruginosa är inkuberas med CFBE celler odlas som konfluenta monolager på vanliga tallrikar vävnadsodling. Även om bakterien är mycket giftigt för epitelceller, tillägg av arginin förseningar förstörelsen av cellslager tillräckligt länge för biofilmer till form på CFBE celler. Den andra metoden (sk Flow Cell Co-kultur Biofilm Model), innebär anpassning av en biofilm flödescell apparater, som ofta används i biofilmen forskning, för att rymma ett glas täckglas stödja en konfluenta monolager av CFBE celler. Detta cellslager är inokuleras med P. aeruginosa och en Slangpumpar rinner sedan färska medelstora över de celler. I båda systemen, bakteriella biofilmer form inom 6-8 timmar efter ympningen. Visualisering av biofilmen förstärks genom användning av P. aeruginosa-stammar som uttrycker konstitutivt grönt fluorescerande protein (GFP). De statiska och Flow Cell Co-kulturen Biofilm analyser modellsystem för tidig P. aeruginosa infektion i cystisk fibros (CF) lunga, och dessa tekniker möjliggör olika aspekter av P. aeruginosa biofilm bildning och virulens som skall studeras, inklusive biofilmen cytotoxicitet, mätning av biofilm CFU och färgning och visualisera biofilmen.

Protocol

1. Statisk Co-kulturen Biofilm Modell

1. Den Static Co-kultur Biofilm modell ¹ använder CFBE41o-celler (CFBE celler), som är förevigade celler ursprungligen utvecklats från en individ med CF homozygota för ΔF508-CFTR mutationer ^2,3,4. CFBE celler bör seedas i en koncentration av 10 ⁶ celler / brunn i en 6-och vävnadsodling platta eller 2 x 10 ⁵ i 24-och vävnadsodling plattan i minimala viktigt medium (MEM) kompletteras med 10% fetalt bovint serum, 2mm L-glutamin, 50 U / mL penicillin, och 50 mikrogram / ml streptomycin. Vi använder 1,5 ml medel per väl i 6-brunnars plattor och 0,5 mL medelstora per väl i 24-brunnars plattor.
2. Celler bör odlas vid 37 ° C och 5% CO ₂ -95% luft i 7-10 dagar för att bilda en konfluenta monolager före inokulering med bakterier. Mediet måste bytas var 2-3 dagar. Dessa villkor har visat sig leda till bildandet av en sammanhängande cellslager och tight junctions.
3. Väx P. aeruginosa i 5 ml LB i 18 timmar vid 37 ° C på en inkubator skak vid 200 rpm. Under dessa förhållanden, s. aeruginosa kulturer kommer oftast med en befolkningstäthet på 5x10 ⁹ CFU / mL.
4. För bakteriella ympning, ta bort mediet från CFBE celler och tillsätt en lika stor volym av MEM utan fenolrött, kompletterat med 2 mm L-glutamin (Mikroskopi medium). Sammanflytande CFBE monolager inokuleras med P. aeruginosa i en mångfald av infektion i ca 30:1 i förhållande till antalet CFBE celler ursprungligen seedade. Detta motsvarar 2 x 10 ⁷ CFU / mL i 1,5 ml MEM / brunn för 6-brunnar och 1,2 x 10 ⁷ CFU / mL i 0,5 ml MEM / brunn för 24-brunnars plattor.
5. Inkubera plattorna under 1 timme vid 37 ° C och 5% CO ₂ -95% luft.
6. Efter 1 timme inkubation, skall supernatanten tas bort och ersättas med nya Mikroskopi mediet kompletteras med 0,4% arginin.
7. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO ₂ -95% luft för olika tidpunkter (upp till cirka 8 timmar) och analysera integritet CFBE cellslager med mikroskopi faskontrast. Om luftvägarna celler är icke-konfluenta, s. aeruginosa kommer snabbt (inom minuter) få tillgång till basolateral ytan av cellerna och förstör cellulära integritet. Inokulering med P. aeruginosa-stammar som konstitutivt uttrycka GFP resulterar i fluorescerande biofilm microcolonies som kan visualiseras genom epifluorescence eller konfokalmikroskopi.
8. Den bakteriella CFU i biofilmen kan bestämmas genom att tvätta samarbete kulturen 2-3 gånger med fosfatbuffrad-saltlösning (PBS) för att eliminera planktoniska bakterier. Efter tvätta, behandla med 0,1% Triton X-100 i PBS eller MEM i 10-15 minuter för att lysera de epitelceller och skingra biofilmen.
9. Vortex i 3 minuter och förbereda seriella spädningar av lysat. Tavla dessa spädningar på LB-agar och inkubera över natten vid 37 ° C. Räkna kolonierna nästa dag för att bestämma CFU.

2. Flow Cell Co-kulturen Biofilm Modell

1. Flow Cell Co-kultur Biofilm Model (flow-analys) innebär ändring av standarden biofilm flödescellen apparater för att rymma CFBE celler ^5.
2. Placera flera 40-mm täckglas diameter glas i en ren 100-ml bägare. Täck ordentligt med två lager aluminiumfolie och autoklav på en torr cykel för 20 min.
3. Att arbeta i en cellkultur huva, ta ett sterilt täckglas från bägaren med etanol tvättas pincett och placera i en steril 60-mm plast skålen.
4. Tillsätt 3 ml förvärmda celltillväxt medium, trycka på täckglas med spetsen på pipetten för att ta bort bubbla instängd under och tvinga täckglas till botten av plast skålen.
5. Seed 2x10 ⁶ celler per maträtt och skaka skålen försiktigt fram och tillbaka. Undvik att snurra för att förhindra att centrifugering cellerna mot sidorna av skålen.
6. Placera skålen i en 5% CO ₂ -95% luft inkubator vid 37 ° C och mata cellerna varannan dag med 3 ml färsk grogrund för 8 till 10 dagar. Cellerna bildar en sammanhängande monolager på glaset täckglas.
7. Väx P. aeruginosa i 5 ml LB i 18 timmar vid 37 ° C på en inkubator skak vid 200 rpm. Under dessa förhållanden, s. aeruginosa kulturer kommer oftast med en befolkningstäthet på 5x10 ⁹ CFU / mL. Vi använder P. aeruginosa stam PAO1 bär pSMC21 plasmiden för konstitutivt uttryck av GFP ^6.
8. Tillsätt 1 ml bakteriekultur i en steril mikrocentrifugrör. Centrifugera vid 6000 rpm i 3 min, och tvätta den bakteriella pellets två gånger i 1 ml mikroskopi medium.
9. Späd 0,5 ml tvättas och resuspenderat bakterier i 4,5 mL Mikroskopi medel för att uppnå en koncentration av ~ 5x10 ⁸ CFU / mL.
10. Observation av levande celleri realtid kräver en avbildning kammare kopplad till en peristaltiska pumpar (för att säkerställa ett flöde av näringsämnen under längre tid) och en temperatur regulator. Vi använder Bioptechs FCS2 (Focht live-cell) kammare anslutna till ett lågt flöde mikro-perfusion pump med 1 / 16: ^e C-flex slang kapas till lämplig längd och autoklaveras för sterilitet, och temperatur-regleras via FCS2 kammaren controller. Vi håller ingångskällan av mediet i ett 37 ° C vattenbad ligger precis bredvid mikroskopet.
11. Montera flödet kammaren. Den FCS2 kammaren innehåller en självlåsande bas (som sitter på scenen adaptern under bildframställning) och ett övre halvan ansluten till perfusion rör och kammaren controller. Kammaren är monterad upp och ned innan den välte och placeras på scenen adaptern. Håll den övre halvan av kammaren upp och ner så att perfusionen rören är synliga, och anpassa frigående hål för en 0,75 mm tjock gummipackning på perfusion rören. Stapla microaqueduct bilden följer med kammare på toppen av gummipackning och se den räfflade sidan är upp, och placera en gummipackning ovanpå bilden. Tjockleken och inre geometri denna andra packningen kommer att avgöra volymen på kammaren. Vi arbetar vanligtvis med en 0,75 mm tjock gummipackning med ett 30-mm rund intern geometri.
12. Tillsätt 1 mL förvärmda (37 ° C) Mikroskopi mediet i mitten av bilden.
13. Hämta en 60-mm maträtt från cellodling inkubatorn, ta bort det använda mediet och tvätta cellerna en gång med 3 mL förvärmda Mikroskopi medium. Detta steg säkerställer eliminering av fenolrött och antibiotika som finns i celltillväxt medium. Fenolrött är svagt fluorescerande och kan störa bildbehandling, medan antibiotika kan utrota s. aeruginosa-bakterier innan de kan etablera biofilmer.
14. Med etanol-tvättade pincett, hämta täckglaset från skålen och sänk den upp och ner på sträng Mikroskopi medelstora placeras på kammaren. Den täckglas vilar nu på den andra gummipackningen och monolager av luftvägarna celler är vänd nedåt.
15. Håll monterade komponenter i ena handen, placera basen av kammaren på toppen av stacken och slå kammaren över snabbt så att allt är rätt sida upp. Lås basen på plats genom att vrida ringen.
16. Anslut inlopp röret till lågt flöde mikro-perfusion pumpen och starta flödet med en hastighet av 20 ml / h. Detta flöde är inom simning hastighet av P. aeruginosa. En andra slang länkar pumpen till en kolv med mikroskopi medelstora placeras i 37 ° C vattenbad ligger precis bredvid mikroskopet.
17. Fäst sterila färdigskurna 1 / ^{16: e} C-Flex slangen till in-och utlopp rör perfusion av kammaren, anslut temperaturregulator, placera sedan monteras kammaren på mikroskop skede av ett inverterat fluorescensmikroskop.
18. Med hjälp av en 1-ml engångsspruta, injicera den tidigare beredda bakteriesuspension in i kammaren, med en två-vägs ventil placeras in-line mellan pumpen och kammaren. I vår viss inställning, tar det en 0,6 mL volym bakteriesuspension att nå kammaren. Justera volym enligt din slang längd. Vi finner det också bra att placera en in-line disponibel 0,22 ìm filter mellan pump och två-vägs ventil för att hindra bakterier från att simma uppströms och förorena in kolven.
19. Att låta bakterier att fästa på luftvägarna celler, stoppa pumpen för 2h. Flödet kan sedan återupptas och bibehållas på 20 ml / h för resten av experimentet.
20. Övervaka integritet luftvägarna celler genom differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi hela experimentet för att kontrollera om tecken på skador på monolager. Samtidigt följa utvecklingen av GFP-märkta s. aeruginosa biofilmer vid den apikala ytan av luftvägarna celler genom att köpa bilder med en inverterad konfokala eller brett fält fluorescensmikroskop.

3. Representativa resultat

Vi använder en stam av P. aeruginosa innehåller pSMC21 plasmiden som möjliggör konstitutivt uttryck av GFP ^6. Av denna anledning kan GFP-märkta biofilmer som växer på en CFBE monolager att visualiseras genom epifluorescence mikroskopi. Alternativt kan visualisering av biofilm uppnås genom färgning utan etikett P. aeruginosa med en 1% calcofluor vit lösning för en timme vid 37 ° C ^1.

För avbildning biofilm bildas på CFBE celler i flödet analysen använder vi en skräddarsydd skede adapter, men flera företag kan nu erbjuda särskilt utrustade scenen adaptrar. Vi arbetar med en Olympus IX70 inverterat mikroskop utrustat med en ORCA-AG djupa kyla CCD-kamera och en X60 olje-nedsänkning mål (numerisk bländare 1,40). Filtret whälen är utrustad med en 480/40 nm bandpass excitation filter och en 535/30 nm bandpass utsläpp filter. Digitala bilder har förvärvats med OpenLab 4.0.3 programvarupaket (improvisation) och volymer deconvolved genom iterativa restaurationen med hjälp av Volocity 3.5.1 programvaran (improvisation). Kvantitativ analys av 3D-biofilm strukturer uppnåddes med COMSTAT bildanalys programpaket ^7,8.

För alla betraktas som co-kultur-modellen måste man särskilt uppmärksamma den cytotoxiska utvecklas mellan komponenterna i modellen. I både statiska och flödet tester cell, fann vi att CFBE cellslager kunde motstå förekomst av P. aeruginosa för upp till 8 timmar efter ympningen utan några tecken på förändring. Epitelial cellslager integritet kan bedömas genom faskontrast mikroskopi med ett inverterat mikroskop ¹ (Figur 1A) eller genom differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi hela experimentet ^5. Med tiden, s. aeruginosa kan producera gifter och faktorer virulens som ackumuleras och kan skada epitelceller cellslager helt eller i sektioner (figur 1B-1C). Cytotoxiciteten kan kvantitativt utvärderas med hjälp av olika kit för att mäta utsläpp av laktatdehydrogenas (LDH) från epitelceller. LDH är ett stabilt cytosoliskt enzym ut i det extracellulära miljön vid cellslys eller celldöd.

När integritet luftvägarna cellslager inte äventyras (typiskt för ~ 8 timmar efter ympning), P. aeruginosa biofilmer kan framgångsrikt form och utvecklas i den apikala ytan av luftvägarna celler i både beskrivs co-kultur modeller (Figur 2A-2B). Efter 3D-rekonstruktion (figur 2C) och kvantifiering kan biomassa ackumulering fastställas exakt. Vi har också använt dessa co-kultur biofilm i flera fenotypiska analyser. Till exempel, som nämnts ovan, kan biofilmen CFU lätt bestämmas genom lysering epitelceller, seriellt späda lysat och bordläggning på agarplattor. Vi har funnit denna teknik fördelaktigt att bestämma resistansen av olika stammar behandling med antibiotika. Dessutom kan biofilmen toxicitet mot epitelceller mätas med hjälp av kommersiellt tillgängliga LDH upptäckt kit. På detta sätt kan betydelsen av virulensfaktorer i toxicitet av biofilmer bedömas. Dessa modellsystem stöder också ett antal ansökningar genuttryck, inklusive studier promotor fusion, RT-PCR och microarray analys ^1,5,9.

Figur 1. Monolager av CFBE celler och representativa bilder av äventyras och skadade monolager luftvägarna cell på grund av P. aeruginosa biofilmen tillväxt. (A) representant bild av en sammanhängande monolager av CFBE celler som odlas i form av plattor vävnadsodling, bedöms av faskontrast mikroskopi. Skala bar, 120 ìm. (B) Exempel på en komprometterad CFBE monolager. Även om cellslager inte visar tydliga tecken på skada ännu, s. aeruginosa-bakterier sett sprids mellan tight junctions av epitelceller och få tillgång till den basolateral membran. Biofilm bildning är normalt inte uppnås under dessa förhållanden på grund av monolager försämras. Skala Bar, 20 ìm. (C) Exempel på en igenväxt P. aeruginosa biofilm observerades 24 timmar efter ympningen. Efter att framgångsrikt stödja biofilm bildning var CFBE cellslager inte att reparera och är nu i stort sett frånvarande. Återstående biofilm, växer som en platt lager av bakterier, visas knutna till glaset täckglas. Skala Bar, 20 ìm.

Figur 2. P. aeruginosa biofilmer odlas vid den apikala ytan av sammanhängande CFBE celler med statiska Co-kultur Biofilm modellen och Flow Cell Co-kulturen Biofilm modellen. (A) representant bild av en GFP-uttryckande s. aeruginosa biofilm odlas på ett konfluenta monolager av CFBE celler med statiska Co-kultur Biofilm modellen, bedöms av epifluorescence mikroskopi. Bilden är en överlagring av faskontrast kanal och fluorescensen kanal. Skala Bar, 35 ìm. (B) Representativa bilden av en GFP-märkta s. aeruginosa biofilm som odlas för 6 h på en konfluenta monolager av CFBE celler med Flow Cell Co-kulturen Biofilm Model. För att underlätta visualisering av luftvägarna cellslager var cellkärnor färgades med 10 mikrogram / ​​ml Hoechst 33.342 (molekylära sonder) i 30 min före inokulering med P. aeruginosa. Samman och pseudocolored bilderna ses av differential interferens kontrast (DIC), och motsvarande fluorescerande bilder ska visas. Biofilmer, yttrar sig som gröna klumpar bifogas apikala yta CFBE celler, är spridda över hela luftvägarna celler. Skala Bar, 20 ìm. (C) Tredimensionell rekonstruktionning av z-serien Bildstaplar visar typiska svamp-liknande strukturer i 6 timmar gamla s. aeruginosa biofilmer som bildas på en CFBE cell monolager. Skala Bar, 10 mikrometer.

Discussion

Biofilmer är samhällen av bakterier som bildas som svar på stimuli från omgivningen. Dessa miljö-signaler leder till globala förändringar av regelverket inom varje bakterie, vilket resulterar i att binda till en yta, sammanställning, produktion av exopolysaccharides, och andra fenotyper som ökad antibiotikaresistens ^10. Under de senaste decennierna har mycket bevis stöder hypotesen att biofilmer spelar en stor roll i patogenesen av kroniska infektioner. Till exempel är det väl accepterat att P. aeruginosa kan fastställa kroniska infektioner i lungorna av cystisk fibros (CF) patienter genom att bilda biofilm ^11. CF är en genetisk sjukdom, där mutationer i CFTR-genen leder till felaktig klorid sekretion ^12. CF-patienter vanligtvis upplever förändrad luftvägarna fysiologi leder till tjockt slem pluggar i luftvägarna och, samtidigt, för mikrobiell infektion ^13. I slutet av tonåren, är den dominerande smittämnet av CF luftvägarna P. aeruginosa, vilket leder till en kronisk biofilm infektion som är resistent mot antibiotika ^14.

De protokoll som beskrivs i detta dokument har utvecklats för att fungera som modellsystem för att studera biofilm bildas på levande celler lunga. Bakteriella biofilmer är inblandade i många sjukdomstillstånd, men ändå har oftast studerats på icke-levande fasta ytor, såsom glas och plast ^15,16. Genom att studera biofilm bildning och tillväxt på abiotiska ytor bara är en missa viktiga interaktioner mellan patogen och värd som bara kan uppstå med en modell system som beskrivs i protokollen ovan. Närmare bestämt, det statiska Co-kultur Biofilm modellen och Flow Cell Co-kultur Biofilm Modell dra nytta av förmågan hos P. aeruginosa att interagera med och binda till slemhinnans yta i lungan. Med hjälp av dessa modeller har vi visat att reaktionen i co-kultur biofilmer på behandling med antibiotika är unik och att dessa modeller är mer benägna att korrekt återge den smittsamma staten ^1,5. I detta avseende har vi rapporterat att motståndet mot tobramycin ökar med> 25-faldigt när P. aeruginosa biofilmer odlas på luftvägarna celler jämfört med biofilmer odlas på abiotiska ytor såsom glas ^5. Det är troligt att dessa tekniker återspeglar händelser som inträffar under den tidiga kolonisationen av lungan ^17. Därför co-kultur modellsystem representerar innovativa verktyg för att förstå tidig infektion i CF slemhinnan av P. aeruginosa ^1.

Vävnadskultursystem har ofta använts för att förstå samspelet mellan värd och patogen. Vi har tagit denna samverkan ett steg längre genom att bilda biofilmer på levande mänskliga epitelceller. I framtiden beskrivs modifierade versioner av de modeller som här skulle kunna användas för att undersöka biofilm bildning av olika bakterier i andra smittsamma stater.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FCS2 (Focht Live-Cell) chamber	Bioptechs	060319131616
FCS2 chamber controller	Bioptechs	060319-2-0303
40 mm glass coverslips	Bioptechs	PH 40-1313-0319
MEM	Mediatech, Inc.	#10-010-CV
MEM without phenol red	Mediatech, Inc.	Mediatech, Manassass, VA